Содержание к диссертации
Введение
Глава I.Обзор литературы .11
I.1.Понятие и эпидемиология ВКМП .11
I.2.Этиология воспалительного поражения миокарда .13
I.3.Патогенез воспалительной кардиомиопатии .15
I.3.1. Роль клеточных факторов в развитии воспалительной реакции при ВКМП .17
I.3.2.Значение гуморальных факторов в развитии ВКМП .21
I.4.Диагностика воспалительной кардиомиопатии .25
I.5.Лечение воспалительной кардиомиопатии 31
Глава II. Материалы и методы исследования 36
II.1.Общая характеристика обследованных больных .36
II.2.Общеклинические методы исследования .37
II.3. Инструментальные методы исследования 38
II.4.Лабораторные методы исследования 41
II.5 Дизайн исследования 45
II.6.Статистическая обработка данных 47
Глава III. Результаты .48
III.1. Сравнение групп эндомиокардиальной биопсии и лабораторного контроля .48
III.2 Результаты гистологического, иммуногистохимического и ПЦР исследования эндомиокардиальных биоптатов 50
III.3. Сравнение подгрупп ВКМП и нвДКМП по молекулярно-генетическим маркерам инфекций .55
III.4.Сравнение подгрупп ВКМП и нвДКМП по частоте экспрессии транскрипционных факторов в эндомиокардиальных биоптатах и плазме крови 57
III.5.Сравнение подгрупп ВКМП и нвДКМП по уровню показателей гуморального, клеточного иммунитета, нейтрофильного фагоцитоза и металлопротеиназной активности 59
III.6.Сравнение подгрупп вирусположительных и вирусотрицательных больных ВКМП на основании результатов ЭМБ .65
III.7.Сравнение подгрупп вирусположительных и вирусотрицательных пациентов вне зависимости от активности воспалительного процесса в миокарде, согласно данным ЭМБ .68
III.8.ROC-анализ, определение чувствительности и специфичности биомаркеров по отношению к активности воспалительного процесса в миокарде 71
III.9.Оценка активности предполагаемого воспалительного процесса в миокарде в группе лабораторного контроля 74
III.10.Применение противовирусной и иммунотропной терапии на основании результатов эндомиокардиальной биопсии 78
Глава IV.Обсуждение 87
IV.1.Обсуждение результатов эндомиокардиальной биопсии .85
IV.2. Обсуждение диагностической значимости иммунологических биомаркеров при постановке диагноза ВКМП .91
IV.3.Обсуждение результатов лечения пациентов с ВКМП и миокардиальной вирусной персистенцией 106
Выводы .112
Практические рекомендации .113
Список литературы
- Роль клеточных факторов в развитии воспалительной реакции при ВКМП
- Инструментальные методы исследования
- Сравнение подгрупп ВКМП и нвДКМП по молекулярно-генетическим маркерам инфекций
- Обсуждение диагностической значимости иммунологических биомаркеров при постановке диагноза ВКМП
Роль клеточных факторов в развитии воспалительной реакции при ВКМП
В 2001г рабочая группа предложила определение биомаркера, используемое и по настоящее время: биомаркер - это «характеристика, которая может быть объективно измерена и оценена как индикатор нормального или физиологического процесса и ответа организма на терапевтическое воздействие.» [17]. Как известно, ключевым иммунологическим механизмом в развитии ВКМП является воспаление. Однако применение воспалительных биомаркеров для лабораторной диагностики ВКМП до сих пор является предметом дискуссий.
Известно, что этиология миокардита широко варьирует: он может быть вирусным [аденовирус (А1,2,3,5), пикорнавирус (Коксаки вирус А/В, эховирус), цитомегаловирус, эритровирусы (парвовирус В19,В19V), вирус гепатита С, вирус гриппа (1,2), вирус иммунодефицита человека, вирус герпеса (вирус Эпштейн - Барр, герпес вирусы 1,2,6 типа), смешанные инфекции], бактериальным, грибковым, протозойным, паразитарным, токсическим, аллергическим, аутоиммунным [25,26].
Тем не менее, по мнению ряда авторов, наиболее частой причиной развития миокардита являются вирусы. По данным метаанализа исследований было установлено, что вирусы в эндомиокардиальных биоптатах выявляются в 3 раза чаще у больных миокардитом или кардиомиопатией в сравнении с контрольной группой, а персистенция вирусного генома в миокарде напрямую взаимосвязана с прогрессированием желудочковой дисфункции и плохим прогнозом [25]. C 1948 г Коксаки вирусы относились к разряду наиболее часто встречающихся этиотропных агентов миокардита, однако после 1995г наметились изменения этой тенденции: роль энтеровирусов заметно снизилась, а на первый план вышли аденовирусы, в особенности в Западной Европе. С 2000г наиболее часто встречающимися вирусами в эндомиокардиальных биоптатах пациентов с миокардитом являются вирус герпеса 6 типа и парвовирус В19, причем последний вышел на лидирующие позиции [27,28,29]
В 2003г Pankuweit с соавторами исследовали эндомиокардиальные биоптаты, взятые у 110 пациентов с воспалительным заболеванием сердца. При этом у 72% пациентов в миокарде методом ПЦР обнаружена ДНК парвовирса В19. В контрольной группе парвовирус В19 был обнаружен всего у 7% пациентов. Эти данные позволили авторам предположить наличие взаимосвязи между присутствием генома парвовируса В19 в эндомиокардиальных биоптатах с развитием ДКМП, воспалительной кардиомиопатии и хронического миокардита[30,31].
В 2010г Claushomas Bock с соавторами измеряли уровень вирусной нагрузки парвовируса В19 в эндомиокардиальных биоптатах 498 пациентов с миокардитом или ДКМП. По результатам исследования, авторы пришли к заключению, что уровень вирусной нагрузки в эндомиокардиальных биоптатах более 500 гэ/мкг является пороговым значением для поддержания воспалительного процесса в миокарде. Тогда как низкая вирусная нагрузка характерна для течения латентной парвовирусной инфекции [31,32]. В 2014г та же группа авторов продолжила свое исследование с применение методов молекулярной диагностики, в ходе которого были выявлены мРНК парвовируса В19, что доказывает активность этого вируса. Кроме того, авторам удалось подтвердить трансактивацию PVB19 вирусом герпеса 6 типа [33].
Однако, в отличие от Германии, В США и Японии процент обнаружения парвовируса В19 в биоптатах больных с ДКМП и признаками миокардита не является преобладающим. Так, например, Bowles с соавторами в США проанализировали эндомиокардиальные биоптаты, взятые у 624 пациентов c миокардитом и у 149 больных ДКМП методом ПЦР. При этом отмечалось преобладание аденовируса (60%), а доля PVB19 составила лишь 2,5%. Таким образом, по данным этого американского исследования, доля выявления парвовируса В19 в биоптатах больных миокардитом и ДКМП незначительна [34]. В Японии при исследовании эндомиокардиальных биоптатов больных миокардитом было установлено, что ведущим этиологическим фактором развития данной патологии является вирус гепатита C [31,35]
Таким образом, учитывая различные данные о частоте встречаемости этого вируса у различных групп больных, на сегодняшний момент спорным остается вопрос: является ли парвовирус В19 этиологическим фактором ВКМП или лишь вирусом - свидетелем.
Stewart с соавторами исследовали эндомиокардиальные биоптаты 100 больных с кардиомиопатией неизвестной этиологии методом ПЦР. Парвовирус В19 был выявлен у 12% обследованных. IgM к парвовирусу В19 у вирус-положительных больных не обнаружены, при этом у всех исследованных больных были выявлены IgG к этому типу вируса, что свидетельствует о перенесенной вирусной инфекции, либо о носительстве. Клинические проявления у парвовирус В19-положительных пациентов значительно варьировали. Два пациента с подтвержденным вирус-индуцированным миокардитом имели сходные уровни вирусной нагрузки с пациентами контрольной группы, не имеющими кардиальной патологии. Таким образом, авторы не считают парвовирус В19 этиологическим фактором развития миокардита и выступают против применения противовирусной терапия для его эрадикации [36], [31].
Тем не менее, при обсуждении вопроса о роли вирусов, в том числе и парвовируса В19 в развитии ВКМП необходимо учитывать результаты экспериментальных исследований, направленных на изучение патогенеза воспалительного поражения сердца.
Инструментальные методы исследования
Статистическая обработка материала проводилась с использованием статистической программы SPSSStatistic 18. В работе использовались следующие методы статистического анализа: оценка распределения количественных признаков проводилась с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Параметрические показатели представлены в виде M ±sd, где М- среднее, sd-стандартное отклонение. Для параметрического сравнения групп применялся t-критерий Стьюдента. При проведении корреляционного анализа параметрических показателей применялся коэффициент корреляции Пирсона. Непараметрические данные представлены в виде Ме (LQ;UQ), где Ме-медиана значения, интерквартильный интервал (LQ;UQ) с указанием 25-го и 75-го перцентилей их распределения. Для непараметрической оценки достоверности различий между группами применялся непараметрический метод анализа по Манн-Уитни. Для проведения корреляционного анализа непараметрических данных применялся коэффициент Спирмена. Для оценки достоверности изменения показателей на фоне лечения использовался критерий Вилкоксона. Проводилось составление таблиц сопряженности для определения совместного распределения двух переменных. Критерий Фишера применялся с целью выявления связи между ними. Проводился ROC анализ с определением чувствительности и специфичности. Определялось отношение шансов. За минимальный уровень значимости принято р 0,05.
Исходно всем пациентам выполнялось клинико- инструментальное обследование. В случае соответствия критериям включения и исключения пациенты подробно информировались о сути проводимого исследования. При получении согласия пациентов на проведение эндомиокардиальной биопсии, они включались в соответствующую группу, в случае отказа- проходили наблюдение в группе лабораторного контроля. Проводилось сравнение группы эндомиокардиальной биопсии (n=35;52,2%) с группой лабораторного контроля (n=33;47,8%) по основным клинико- демографическим показателям, в ходе которого значимых различий выявлено не было, что свидетельствовало о сопоставимости этих 2-х групп. (Таблица 3.).
После стандартной клинической диагностики всем пациентам производился забор крови с целью иммунологического исследования и определения концентрации биомаркеров. В ходе сравнения групп эндомиокардиальной биопсии и лабораторного контроля по показателям гуморального иммунитета выявлено, что концентрация IgM к PVB19 была значимо выше в группе эндомиокардиальной биопсии (Таблица 4). При исследовании уровня цитокинов в общей группе больных выявлено, что концентация ИЛ-10 была выше чувствительности метода лишь у 1 пациента, ИЛ-6 - у 3 больных, ИЛ-8 - у 4 больных и ИЛ-4 - у 2 пациентов. Эти данные не позволили нам рассматривать интерлейины в качестве возможных диагностических маркеров ВКМП.
При сравнении группе исследуемых групп по показателям клеточного иммунитета и нейтрофильного фагоцитоза установлено, что абсолютное количество NK-клеток и В-лимфоцитов было значимо выше в группе эндомиокардиальной биопси (Таблица 5).
В дополнение к клинико-инструментальному и лабораторному обследованию первой группе пациентов (п=35) проводилась эндомиокардиальная биопсия в соответствии с рекомендациями Европейского Общества Кардиологов, класс рекомендаций ПА С [5]. В зависимости от количества инфильтрирующих Т Всемирной Федерации Сердца, пациенты были разделены на 2 подгруппы: в первую подгруппу вошли пациенты, у которых было выявлено 14Т клеток/мм2 миокарда (была подтверждена ВКМП, п=18), во вторую подгруппу вошли пациенты, у которых было выявлено 14 Т клеток/мм2 миокарда (пациенты с нвДКМП без признаков активного воспалительного процесса в миокарде, п=17) (Рисунок 5). Группа эндомиокардиальной биопсии
При иммуногистохимическом исследовании биоптатов было выявлено, что подгруппы ВКМП и нвДКМП значимо различались по общему количеству лимфоцитов и макрофагов и, в частности, по числу клеток разных фенотипов (CD4+, CD8+, CD3+, CD68+) (Таблица7.), (Рисунок 6,7). Клетки CD45RO+ были выявлены лишь у двух пациентов с признаками активного воспалительного процесса в миокарде, их количество составило 6 и 3 клеток/мм2 миокарда соответственно. Таблица 7. Различия между группами ВКМП и ДКМП по количеству клеток различных фенотипов М±т, Ме[25%;75%] Фенотипы клеток 14 лейкоцитов/мм2 миокарда 14 лейкоцитов/мм2 миокарда Р.
В подгруппе ВКМП выявлена положительная взаимосвязь между количеством CD4+/мм миокарда и КСО (r=0,4, p=0,06), и отрицательная с ФВ% ЛЖ (r=-0,45, p=0,05), что практически достигало критериев статистической значимости. Кроме того, так же была выявлена тенденция к положительной взаимосвязи этого фенотипа клеток с уровнем вчСРБ (r=0,4,p=0,07).
Сравнение подгрупп ВКМП и нвДКМП по молекулярно-генетическим маркерам инфекций
Все пациенты, включенные в исследование, получали стандартную терапию ХСН в соответствии с рекомендациями. В группе эндомиокардиальной биопсии 31(88,6%) пациент принимал ингибиторы АПФ, 4(11,4%) – блокаторы рецепторов в АТ II, 33(94,3%) – -блокаторы, 2(5,7%) – ингибиторы If каналов синусового узла, 28(80%) –петлевые диуретики, 35(100%)- АМКР.
С целью повышения эффективности проводимой терапии мы применяли лечение, направленное на элиминацию вирусного антигена и купирование воспаления в миокарде. В соответствии с результатами эндомиокардиальной биопсии вирусположительным больным проводилась противовирусная терапия. В связи с высокой стоимостью препарата лишь семь пациентов с выявленным в миокарде PVВ19 получали терапию пентаглобином в дозе 750мг/кг. При этом в одном случае было выявлено сочетание PVB19 и HHV6 и также у одного пациента - сочетание PVB19 и CMV, в этой связи этим больным дополнительно проводилась терапия фамцикловиром в дозе 1000 мг в сутки в течение 10 дней. У двух больных в миокарде был выявлен HHV6 и у двух- EBV, что так же послужило основанием для проведения терапии фамцикловиром в дозе 1000мг/сутки в течение 10 дней. Таким образом, группу пациентов противовирусной/иммуномодулирующей терапии (n=11) составили 7 больных, получавших пентаглобин (в 2-х случаях пентаглобин+фамцикловир) и 4 пациента, получающих фамцикловир. В контрольную группу вошли PVB-19- положительные пациенты, не получавшие терапию пентаглобином (n=10). В группе эндомиокардиальной биопсии у 5 пациентов отсутствовали признаки активного воспалительного процесса и вирусной персистенции в миокарде, им проводилась лишь стандартная терапия ХСН.
При статистической оценке (с помощью критерия Вилкоксона) эффективности лечения противовирусной терапией, включающей применение пентаглобина и фамцикловира, проводился анализ клинических и лабораторных показателей до и через 6 месяцев после проведения противовирусной терапии. Было показано значимое увеличение дистанции при прохождении теста 6-минутной ходьбы на 11%, (р=0,04), уменьшение количества баллов по шкале ШОКС на 42% (р=0,001), снижение концентрации NT-proBNP на 63,5% (р=0,04), увеличение ФВ на 17%, (p=0,007) (Таблица 32). По остальным анализируемым клиническим и лабораторным показателям значимых различий исходно и через 6 месяцев после проведения противовирусной терапии выявлено не было.
При оценке изменений клинических и лабораторных параметров исходно и спустя 6 месяцев наблюдения в подгруппе больных, не получавших терапию пентаглобином (п=10) отмечалась тенденция к снижению КДО на 12,4%, (р=0,05), (Таблица 33). Значимой динамики других исследуемых показателей зарегистрировано не было. Таблица 33.Сравнение пациентов, не получающих терапию пентаглобином и фамцикловиром исходно и спустя 6 месяцев наблюдения, М±т; Ме[25%;75%] Подгруппа больных, не получающих терапию пентаглобином
Через 6 месяцев наблюдения значимых различий между подгруппой, пациентов, получающих противовирусную/иммунотропную терапию и PVB19-положительных больных, не получавших терапию пентаглобином, по клиническим параметрам (Таблица 35.), а также показателям аутореактивности, гуморального, клеточного иммунитета, металлопротеиназной активности, серологическим маркерам инфекций выявлено не было. Таблица 35. Сравнение подгрупп пациентов, получающих противовирусную терапию и не получающих таковой по основным клиническим показателям, М±т; Ме[25%;75%] Через 6 месяцев наблюдения. Показатель Подруппа, получающая терапиюпентаглобином и фамцикловиром (n=11) Подруппа, не получающая терапию пентаглобином и фамцикловиром, (n=10) р
В подгруппе PVB-19 - положительных пациентов, находящихся только стандартной терапии ХСН, через 6 месяцев от начала наблюдения наблюдалась значимо более выраженная активация показателей клеточного иммунитета по сравнению с группой больных, дополнительно получающих противовирусную/иммунотропную терапию:[CD3+% - 75,3 (69;79) против 74,1(65;77), р=0,01]; [CD19+% - 13,7 (7,8;16,4) против 12,3 (6,5;15), р=0,04] соответственно. В группе пациентов с ВКМП и отсутствием вирусов в миокарде (п=9) проводилась иммуносупрессивная терапия (п=6, преднизолон 1 мес - 1мг/кг, последующие 5 мес - 0,33 мг/кг), трое пациентов в последующем отказались от приема преднизолона. При сравнении пациентов подгруппы, получавшей иммносупрессивную терапию, исходно и спустя 6 месяцев наблюдения по основным клиническим параметрам и активности NT-proBNP было выявлено статистически значимое увеличение дистанции при прохождении теста 6-минутной ходьбы на 18%, уменьшение количества баллов по шкале ШОКС на 42%, увеличение ФВ на 12%,
Обсуждение диагностической значимости иммунологических биомаркеров при постановке диагноза ВКМП
Согласно экспериментальным данным, персистенция вирусного генома в миокарде ассоциирована с плохим прогнозом [180]. Однако на сегодняшний день не разработано специфической противовирусной терапии для PVB19, геном которого наиболее часто выявляется в эдомиокардиальных биоптатах пациентов с воспалительным поражением сердца в странах Европы [30,32]. В связи с этим в лечении PVB19-обусловленного миокардита значительная роль отводится применению внутривенных иммуноглобулинов. В связи с этим в разных странах были проведены небольшие исследования по применению терапии внутривенным иммуноглобулином, направленной на элиминацию вирусного генома. Однако при рассмотрении некоторых из них обращает на себя внимание недостаточная обоснованность применения подобной терапии. Так, например, в 2001г в США ряд авторов представили результаты плацебоконтролируемого исследования по применению внутривенного иммуноглобулина у пациентов с ДКМП длительностью 6 месяцев и признаками активного воспалительного процесса в миокарде в 16% случаев. Недостатком этого исследования, на наш взгляд, является отсутствие ПЦР диагностики кардиобиоптатов больных. В этой работе не было продемонстрировано значимых различий по сократительной функции миокарда, а также прогнозу заболевания через 6 и 12 месяцев терапии между группой, получающей иммуноглобулин и группой плацебо. Такие данные, вероятно, явились следствием необоснованного подбора больных для применения соответствующей терапии вследствие отсутствия доказанной миокардиальной вирусной персистенции [151]. В 2003 г в Японии в ходе небольшого исследования 9 больным (6 из них были с диагнозом миокардит и 3 с ДКМП) с ФВ 40%, III-IV ФК и сроком заболевания менее 6 месяцев проводилась терапия внутривенным иммуноглобулином в дозе 1-2г/кг. При этом лишь у 5 пациентов воспалительный процесс в миокарде был верифицирован с помощью золотого стандарта диагностики - ЭМБ. Более того, кардиобиоптаты были исследованы не полностью, так как не проводилась ПЦР диагностика. Тем не менее, даже при неверифицированной причине развития миокардита исследователи наблюдали некоторый положительный эффект от применения иммуноглобулина через 12,2±5,8 дней: увеличение ФВ, уменьшении ФК при отсутствии побочных эффектов от применения препарата [150]. Однако необходимо отметить, что это исследование не было контролируемым.
Принципиально новым исследованием стала работа голландских ученых (2010г) по изучению эффективности применения внутривенного иммуноглобулина на основании комплексного исследования кардиобиоптатов гистологическим, иммуногистохимическим и молекулярно-генетическим методом. У пациентов с высокой PVB19- вирусной нагрузкой было показано значимое увеличение ФВ, уменьшение КДР, КСР, ФК и количества копий парвовируса В19 при отсутствии побочных эффектов от данной терапии. У пациентов с низким уровнем вирусной нагрузки наметилась тенденция к увеличению ФВ 32% до 34% (p=0,07), при этом значимых изменений объемов сердца в этой группе не зарегистрировано [11]. В нашей работе подгруппа пациентов, получающих терапию пентаглобином была объединена с подгруппой больных, принимающих фамцикловир, в связи с наличием 2 больных, у которых наблюдалось сочетание PVB19 и HHV6/CMV. Пентаглобин (внутривенный иммуноглобулин) применялся дозе 750мг/кг, что соответствовало максимальной дозе, указанной в инструкции к препарату, и вводился в течение 3 дней. По данным других исследований, доза внутривенного иммуноглобулина, применяемая для лечения ВКМП в отдельных случаях доходила до 1-2г/кг [11,150,157]. Согласно полученным нами данным, в результате применения противовирусной и иммуномодулирующей терапии через 6 месяцев наблюдения отмечалось значимое снижение ФК, увеличение дистанции в тесте 6-МХ, уменьшение баллов по шкале ШОКС, концентрации NT-proBNP, а также повышение ФВ (см. табл.32). При этом снижения концентрации вчСРБ нами отмечено не было. Однако, по данным ряда исследований, внутривенный иммуноглобулин обладает противовоспалительными свойствами: ингибирует каскад комплемента, активацию матриксных металлопротеиназ, продукцию провоспалительных цитокинов, адгезию лейкоцитов, апоптоз, регулирует активность Т и В клеток, связывает вирусные и бактериальные компоненты [218,219]. Несмотря на известные противоспалительные свойства иммуноглобулина, в литературе есть данные, указывающие на отсутствие прямой взаимосвязи между снижением вирусной нагрузки и уменьшением выраженности воспалительной реакции. Напротив, возможно умеренное увеличение лимфоцитарной инфильтрации в миокарде, несмотря на хороший противовирусный эффект терапии иммуноглобулином [11]. Таким образом, в нашем исследовании у вирусположительных больных ВКМП продемонстрирован значимый положительный эффект от применения иммуноглобулина в комплексе с фамцикловиром, однако, косвенного подтверждения противоспалительных свойств препарата нами получено не было, что может быть обусловлено небольшим количеством наблюдений. Таким образом, на наш взгляд, влияние иммуноглобулина на течение воспалительного процесса в миокарде требует дальнейшего изучения. Нами проведена оценка клинико-функциональных показателей через 6 месяцев от начала наблюдения по сравнению с исходными данными в погруппе PVB19-положительных больных, не получавших терапию пентаглобином, при этом наблюдалось незначительное улучшение ряда исследуемых параметров, однако различия не были статистически значимы, (см. таблицу 33). Тем не менее, при сравнении подгруппы пациентов, получающих противовирусную и иммуномодулирующую терапию с подгруппой PVB19-положительных больных, не получавших терапию пентаглобином по основным клиническим и большинству лабораторных параметров, значимых различий выявлено не было. Возможно, это было связано с небольшим количеством наблюдений. При сравнении подгруппы пациентов, которым проводилась терапия пентаглобином/фамцикловиром или преднизолоном по основным клиническим параметрам исходно и спустя 6 месяцев наблюдения, было выявлено значимое увеличение дистанции в тесте 6-МХ, уменьшение количества баллов по ШОКС, КСО, уровня NT-proBNP, а также увеличение ФВ, (см. таблицу 38). Зарегистрированные изменения клинических показателей свидетельствуют о положительном эффекте от применения выбранной стратегии лечения такой тяжелой патологии как ВКМП. Необходимо отметить, что спустя 6 месяцев наблюдения в подгруппе больных, не получающих противовирусную/иммуносупрессивную терапию, не выявлено значимых различий по основным клиническим показателям при сравнении с исходными данными, что свидетельствует об отсутствии значимого положительного эффекта от приема лишь стандартной терапии ХСН в этой категории больных (см. таблицу 39).