Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. патогенетическое значение окислительного стресса, системного воспаления, кардиоренального синдрома и галектина-3 при хрониче ской сердечной недостаточности 12
1.1. Окислительный стресс: механизмы формирования, патогенная роль при хронической сердечной недостаточности 12
1.2. Эндогенное воспаление: роль в патогенезе ХСН 16
1.3. Кардиоренальные взаимоотношения у больных с ХСН 19
1.4. Характеристика структурного строения галектинов и их патогенных эффектов на органы и ткани 20
1.5. Участие галектина-3 в патогенезе ХСН 24
1.6. Клиническая и прогностическая значимость галектина
ГЛАВА 2. Объект и методы исследования
2.1. Клиническая и инструментальная характеристика больных 34
2.2. Методы исследования
2.2.1. Оценка окислительного стресса 39
2.2.2. Методы исследования функции почек 44
2.2.3. Определение маркеров эндогенного воспаления 44
2.2.4. Определение галектина-
3 2.3. Использованная аппаратура и реактивы 45
2.4. Статистическая обработка полученных результатов 45
ГЛАВА 3. Галектин-3 и его связь с окислительным стрессом, эндогенным воспалением у больных с хрони еской сердечной недостаточностью 47
3.1. Содержание галектина-3 в плазме крови больных с ХСН 47
3.2. Характеристика окислительного стресса
3.2.1. Состояние миокардиального окислительно-нитрозилирующего стресса у больных с ХСН 51
3.2.2. Характеристика плазменного окислительного стресса у больных с ХСН 53
3.2.3. Характеристика эритроцитарного окислительного стресса у больных с ХСН 60
3.2.4. Характеристика индексов окислительного стресса у больных с ХСН 64
3.3. Связь изменений галектина-3 с основными параметрами окислительного стресса у больных с ХСН 67
3.4. Характеристика эндогенного воспаления у больных с ХСН и его связь с галектином-3 69
ГЛАВА 4. Функциональное состояние почек, уровень мочевой кислоты и их связь с галектином-3 у больных с хронической сердечной недостаточностью
4.1. Состояние функции почек больных с ХСН 73
4.2. Взаимосвязь функционального состояния почек с индексами окислительного стресса, эндогенным воспалениеми и уровнем галектина-3 78
4.3. Обмен мочевой кислоты у больных с ХСН 81
глава 5. Диагностическое и прогностическое значе ние плазменного содержания галектина-3 у больных с хронической сердечной недостаточностью 86
Глава 6. Обсуждение полученных результатов 95
Выводы 114
Практические рекомендации 116
Список литературы
- Эндогенное воспаление: роль в патогенезе ХСН
- Методы исследования функции почек
- Состояние миокардиального окислительно-нитрозилирующего стресса у больных с ХСН
- Взаимосвязь функционального состояния почек с индексами окислительного стресса, эндогенным воспалениеми и уровнем галектина-3
Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на успехи, достигнутые в лечении сердечно-сосудистых заболеваний в настоящее время, формирование хронической сердечной недостаточности (ХСН) у пациентов с ишемической болезнью сердца остается актуальной проблемой.
Распространенность хронической сердечной недостаточности в Российской Федерации достаточно высока – более 8 млн. человек имеют четкие признаки ХСН, из них у 3,4 млн. диагностирован III–IV функциональный класс (ФК) заболевания [Агеев Ф.Т. и соавт., 2006]. Для больных с ХСН риск внезапной смерти в пять раз выше, чем в популяции, а пятилетняя выживаемость ниже 50%. Однолетняя смертность больных с клинически выраженной ХСН достигает 26–29%, то есть за один год в Российской Федерации умирает около 612 тысяч больных с этой патологией [Мареев В.Ф. и соавт., 2010].
Терапия ХСН сопряжена со значительной стоимостью лечения декомпенсированных больных, высоким уровнем их инвалидизации и смертности. Больные с ХСН представляют для развитых государств не только важную медицинскую, но и существенную социальную и экономическую проблему. В связи с этим остро стоит задача ранней диагностики, прогнозирования течения ХСН и ее осложнений, а также контроля эффективности проводимого лечения. Другим важнейшим направлением в решении проблемы ХСН является использование новейших методов биологии и медицины для изучения новых механизмов патогенеза сердечной недостаточности и методов ее эффективного лечения.
Необходимым условием для решения этих задач у больных с ХСН является определение биологически уникальных маркеров. Поэтому в настоящее время разрабатываются мультимаркерные подходы для оценки состояния пациентов с подозреваемой или доказанной ХСН. Так в работе Lee D.C., Vasan R.S. (2006) предлагаются возможные стратегии и классификация сывороточных биомаркеров ХСН на четыре категории: нейрогуморальные, деструкции кардиомиоцитов, ремоделирования матрицы миокарда и эндогенного воспаления [Lee D.C., Vasan R.S., 2006].
В современной кардиологической практике широкое применение нашли лишь два молекулярных маркера ХСН – мозговой натрийуретический пептид (BNP) и N-концевой предшественник BNP – NT-proBNP. Однако при стабильно выраженной ХСН эти показатели могут иметь существенную вариабельность значений и зависеть от таких факторов как пол, возраст, масса тела пациента, наличие фибрилляции предсердий или почечной недостаточности [Агеев Ф.Т., Азизова А.Г., 2011]. Поэтому с позиции новой мультимаркерной стратегии диагностики, оценки качества лечения, определения прогноза и выраженности патогенетических факторов ХСН есть необходимость в поиске новых эффективных тестов диагностики этого состояния.
В настоящее время определяющей моделью развития ХСН является нейрогуморальная, включающая активацию ренин-ангиотензин-альдостероновой (РААС) и симпато-адреналовой (САС) систем. Указанные звенья патогенеза достаточно изучены, а ингибиторы РААС и -адреноблокаторы стали обязательными компонентами терапии данной категории пациентов (Национальные рекомендации по диагностике и лечению ХСН, 2010). Однако возможности этого направления лечения достигли определенного предела. В связи с этим в механизмах формирования и прогрессирования ХСН исследуются новые аспекты окислительно-нитрозилирующего стресса, эндогенного воспаления и фиброзирования миокарда, а также кардиоренального синдрома. Создание медикаментозных ингибиторов данных процессов, несомненно, может улучшить качество лечения ХСН.
Одним из достижений современной молекулярной медицины является открытие нового биомаркера галектина-3. Этот гликопротеин широко представлен в различных тканях и клетках, где он локализуется в цитоплазме, саркоплазматическом ретикулуме, ядрах, митохондриях. Цитозольный пул при активации смещается к плазматической мембране и интегрируется в пузырьках для выделения из клетки.
Доказано, что галектин-3 является, прежде всего, маркером и медиатором процессов фиброза, роста и пролиферации клеток [de Filippi, 2010]. Его участие в таких важных процессах как окислительно-нитрозилирующий стресс, апоптоз, эндогенное воспаление, а также кардиоренальные взаимоотношения трактуются неоднозначно, и он рассматривается как модулятор, способный как увеличивать, так и снижать их активность [De Boer, 2010]. Клиническое значение галектина-3 в настоящее время начинает широко изучаться. Так в исследовании Shah R.V. et al. (2010) галектин-3 оказался достоверным предиктором 4-летней смертности, независимым от показателей ЭхоКГ и маркеров тяжести заболевания. Это дало авторам возможность рассматривать его в качестве независимого предиктора смерти больных c ХСН. Прогностическое значение галектина-3 у больных с ХСН обнаружено также в исследовании Lok D.J. et al. (2010). При этом до настоящего времени не разработана математическая модель прогнозирования течения хронической сердечной недостаточности, использующая в своей основе оценку содержания галектина-3 и других достоверных маркеров ХСН.
Цель исследования
Оптимизация диагностики и прогнозирования течения хронической сердечной недостаточности на основании изучения патогенетического значения галектина-3 у больных ишемической болезнью сердца.
Задачи
-
Определить плазменное содержание галектина-3 и его взаимосвязи с показателями сократительной функции миокарда, клиническими проявлениями и переносимостью физической нагрузки у больных с различной тяжестью хронической сердечной недостаточности.
-
Изучить особенности окислительного стресса в клетках и плазме и установить корреляционные связи между его параметрами и плазменным содержанием галектина-3 у больных с различной выраженностью хронической сердечной недостаточности.
-
Определить активность системного эндогенного воспаления у больных с хронической сердечной недостаточностью по показателям высокочувствительного С реактивного белка и интерлейкина-6 и дать характеристику его корреляционным связям с параметрами окислительного стресса и уровнем галектина-3.
-
Выявить особенности проявлений кардиоренального синдрома, и провести анализ взаимоотношений между его маркерами и концентрацией в плазме галектина-3 у больных с хронической сердечной недостаточностью.
-
Разработать математическую модель прогнозирования течения хронической сердечной недостаточности у больных ишемической болезнью сердца.
Научная новизна
Получены новые сведения, дополняющие современные представления о патогенезе хронической сердечной недостаточности у пациентов, перенесших инфаркт миокарда. Показано, что плазменное содержание галектина-3 напрямую зависит у пациентов от тяжести хронической сердечной недостаточности, имеет достоверную положительную корреляцию с индексами окислительного стресса, вчСРБ, ИЛ-6, не связано с показателями сократительной функции миокарда, в средней степени коррелирует с баллами шкалы оценки клинического состояния (ШОКС) и в меньшей степени с результатами 6-минутного теста.
Проведена дифференцированная оценка характеристик окислительного стресса в клеточных структурах, плазме и эритроцитах при хронической сердечной недостаточности. Активность окислительного стресса и системного воспаления связаны между собой и определяются тяжестью ХСН.
У больных с ХСН наблюдаются проявления кардиоренального синдрома, выраженность которого тесно связана с тяжестью течения ХСН и в значительной степени коррелирует с плазменным содержанием галектина-3. Установлено, что наиболее чувствительным способом выявления почечных поражений у больных с хронической сердечной недостаточностью является определение уровня цистатина С.
Настоящее исследование позволило выявить не только участие галектина 3 в формировании окислительного стресса и кардиоренального синдрома при хронической сердечной недостаточности, но возможность его применения в качестве маркера этих процессов.
Впервые разработана модель и компьютерная программа прогнозирования течения хронической сердечной недостаточности с учетом определения плазменных уровней галектина-3 и цистатина С.
Практическая значимость работы
Результаты исследования дополняют современные представления о патогенезе хронической сердечной недостаточности у пациентов, перенесших инфаркт миокарда, что позволяет повысить качество оказания им медицинской помощи.
Обоснована необходимость исследования плазменного галектина-3, основных показателей окислительного стресса, эндогенного воспаления и кардиоренального синдрома для диагностики и прогнозирования дальнейшего течения ХСН.
Разработанный прогностический алгоритм, включающий определение плазменного содержания галектина-3 и цистатина С будет способствовать повышению качества прогнозирования выживаемости у пациентов с различной тяжестью ХСН.
Положения, выносимые на защиту
-
Плазменное содержание галектина-3 у пациентов прямо зависит от тяжести хронической сердечной недостаточности, имеет достоверную положительную корреляцию с индексами окислительного стресса, вчСРБ, ИЛ-6, не связано с показателями сократительной функции миокарда, в средней степени коррелирует с баллами шкалы оценки клинического состояния (ШОКС) и в меньшей степени с результатами 6-минутного теста.
-
Окислительный стресс у больных ХСН, реализующийся в миокарде, плазме, эритроцитах, тесно связан с эндогенным воспалением, активность данных патогенных процессов определяется тяжестью ХСН.
-
У больных с ХСН имеют место проявления кардиоренального синдрома, выраженность которого тесно связана с тяжестью течения ХСН и в значительной степени коррелирует с плазменным содержанием галектина-3, индексами окислительного стресса, активностью эндогенного воспаления и гиперурикемией.
-
Разработана модель и компьютерная программа прогнозирования течения хронической сердечной недостаточности с учетом определения плазменного уровня галектина-3 и цистатина С.
Апробация диссертации
Материалы диссертации представлены на международном конгрессе Европейского Общества кардиологов «Heart Failure 2012» (Сербия, Белград, 2012), Всероссийской конференции с международным участием «Противоречия современной кардиологии: спорные и нерешенные вопросы» (Самара, 2012), Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Молодые ученые медицине» (Самара, 2011, 2012). Апробация диссертации проведена на совместном научном заседании кафедр факультетской терапии и пропедевтической терапии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России 23.01.2013 года.
Публикации
По результатам проведенного исследования опубликована 15 научных работ, в том числе, 3 статьи в научных изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.
Получены: свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ и положительное решение о выдаче патента на изобретение.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс кафедры пропедевтической терапии и практику работы кардиологического отделения №1 клиники пропедевтической терапии СамГМУ, а также кардиологического отделения №6 Самарского областного клинического кардиологического диспансера.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы по описанию клинической характеристики пациентов и методов исследования, трех глав, посвященных собственным исследованиям, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 38 таблиц, 18 рисунков; библиографический указатель состоит из 97 отечественных и 157 зарубежных источников.
Эндогенное воспаление: роль в патогенезе ХСН
В последние годы сформировалась концепция кардиоренометаболического континуума, в основу которой положено представление об общности патогенеза, наличия общих факторов риска, развития и прогрессирования, а также существенном значении нарушения функции почек вплоть до терминальной почечной недостаточности для исходов сердечно-сосудистых заболеваний [64].
Нарушения функции почек являются важным фактором риска развития сердечно-сосудистых осложнений (ССО) [66, 139]. Сердечно-сосудитсая смертность в 10-30 раз выше у пациентов, находящихся на гемодиализе, чем в общей популяции Результаты исследований свидетельствуют о томгчто даже самые ранние субклинические нарушения функции почек являются независимым фактором риска развития ССО и смерти, а также повторных событий у пациентов с ССЗ [70, 248]. Данные взаимосвязи отражают концепцию кардиоренальных взаимоотношений [71, 232].
В кратком обзоре их можно следующим образом представить схематически 1. уже на начальном этапе ХСН наблюдается нарушение равновесия между противовесными гормональными системами: АТП/натрийуретическая система в сторону преобладания АТП, что приводит к усилению синтеза альдостерона и вазопрессина [146]; 2. далее начинается снижение общего и почечного кровотока, трансформация афферентных и эфферентных артериол с последующим формированием внутриклубочковой гипертонии и снижением СКФ и дисфункцией нефрона; 3. дисфункция нефрона и его гибель приводят к состоянию гиперфильтрации в оставшихся нефронах, что потенцирует снижение общего количества нефро-нов; 4. значительно снижается способность почки к саморегуляции кровотока через клубочки; 5. возникает повышение осмолярности плазмы в результате высокой реаб-сорбции Na+ и Н20, что приводит к перегрузке объемом [102], повышению ко-нечно-диастолического давления в ЛЖ и к ухудшению функции сердца. Установлено, что важными факторами морфологического поражения почек являются их хроническая гипоксия, эндогенное воспаление, метаболиты окислительного стресса, а также фибротическое повреждение проксимальных канальцев и окружающей интерстициальной ткани, что имеет ключевое значение для про-грессирования деструкции почек и необратимой потери их функции [89, 90, 93, 94,102, ПО, 185,218,232];
В настоящее время избыток в крови мочевой кислоты (МК) рассматривается каісважньій_компонент«кардиоренометаболического континуума» [44]. В синтезе МК основная роль отводится печени и сосудистому эндотелию. В них преимущественно путем трансформации гипоксантина в ксантин, и далее под влиянием фермента ксантиноксидазы (КО) образуется мочевая кислота. В сердце КО локализуется преимущественно в эндотелии капилляров [106], поэтому при гипоксии генерация МК идет в клетках эндотелия, а не в миокарде [56, 57].
В работе J.G. Puig, L.M. Ruilope [211] для больных артериальной гипертонией выдвинута концепция, что повышение содержания МК отражает нарушение функции почек. Это подтверждается следующими факторами: - только у больных с гиперурикемией отмечается повышение сосудистого почечного сопротивления; - микроальбуминурия (МАУ) указывает на сосудистое повреждение; есть прямая связь между МАУ и уровнем МК сыворотки крови; - пациенты с высоким содержанием МК представляют собой популяцию с наиболее тяжелым поражением почек и сосудов.
На сегодняшний день нет единого мнения о роли МК в патогенезе сердечной недостаточности. Так ряд фундаментальных исследований показывает, что МК активно участвует в возникновении и прогрессировании ХСН [106, 143, 160]. В тоже время как другие из них демонстрируют благотворное действие мочевой кислоты, обусловленное ее антиоксидантной активностью, при этом гиперури-кемия (ГУ) рассматривается как адаптивная реакция в ответ на оксидативный стресс, развивающийся при ХСН [199]. Вместе с тем по данным [235] антиок-сидантные свойства МК могут преодолеваться проокислительными и провос-палительными эффектами активных форм кислорода, выделяющихся при синтезе МК в ксантиноксидазной реакции. В отечественной и зарубежной литературе нет данных о связи галектина-3 с гиперурикемией.
Поэтому представляется чрезвычайно актуальным и важным изучение связи галектина-3, одного из самых эффективных маркеров фиброза, как с функциональным состоянием почек, так и с-уровнем гиперурикемии у пациентов с различной тяжестью течения ХСН.
Галектины относятся к группе белков-лектинов. Лектины - это белки, которые специфически связываются с углеводной частью гликоконьюгатов, таких как моно- и олигосахариды мембран клеток и структур экстрацеллюлярного матрикса без нарушения их структуры [21]. Галектины по своей структуре представляют собой соединение белков-лектинов с [3-галактозами [ЮЗ]. Галектины выделены не только у позвоночных (млекопитающие, птицы, рыбы и земноводные), но и у беспозвоночных (червей, насекомых) и у низших организмов, таких как губки и грибы [121], что предполагает их важную роль в функционировании организмов. В настоящее время у позвоночных описано 15 видов галектинов. Все галектины связываются с углеводами через углевод-распознающий домен (УРД), который, как правило, состоит примерно из 130 аминокислот. Некоторые галектины содержат только один УРД (галектины 1, 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 15), другие - два гомологичных УРД (галектины 4, 6, 8, 9, 12), в то же время га-лектин-3 содержит нелектиновый N-концевой фрагмент (около 120 аминокислот), соединенный с УРД. Большинство галектинов являются двухвалентными или поливалентными: галектины содержащие один УРД могут образовывать димеры, двух-УРД галектины имеют два углеводных участка связывания. В отличие от них галектин-3 при связывании с поливалентными углеводами имеет форму пентамеров. Таким образом, галектины могут образовывать упорядоченные «массивы» из лектинов и поливалетных гликоконъюгатов [251].
Галектины в основном локализуются в цитоплазме, но при определенных условиях могут находиться в ядре и секретироваться клетками, хотя не имеют сигнальной последовательности и не являются гормонами. Предполагается, что галектины не имеют специфических рецепторов, и что они могут связываться с гликопротеидами поверхности клетки или-внеклеточногоматрикса, содержащих подходящие олигосахариды. Связываясь с поверхностью клетки, они влияют на работу ее рецепторов, оказывая на них регуляторное действие [205], изменяют клеточную активность и мембранный транспорт [176]. К внеклеточной функции галектинов относится воздействие на адгезию и рост клеток [254]. Внутриклеточная функция галектинов заключается в том, что в ядре они могут влиять на транскрипцию и сплайсинг информационной РНК [207].
В настоящее время обнаружено участие галектинов в дифференцировке, апоптозе клеток, в процессах пролиферации, канцерогенеза и метастазирова-ния, воспаления, атерогенеза, иммунного ответа, дегенерации нервов, сахарного диабета, репарации ран, внутриклеточной сигнализации и взаимодействия клеток с матриксом и между собой [251].
Методы исследования функции почек
Определение окисляемости липопротеинов низкой плотности [78]. Окислительная модификация аполипопротеинов в ЛПНП приводит к их фрагментации, патологической конформации и сходству к скэвенджер рецепторам макрофагов. Оценка окисляемости ЛПНП in vitro ионами меди позволяет выявить готовность ЛПНП к окислительной модификации in vivo.
Ход исследования: ЛПНП получали из 0,5 мл сыворотки крови осаждением в присутствии гепарина и хлорида марганца, и промывали 0,9% NaCl. Осаждали ЛПНП центрифугированием при 3000 об/мин, затем растворяли в 1М растворе NaCl.
Окислительную модификацию ЛПНП in vitro проводили в среде Дульбекко без Са2+ и Mg2+ содержащей 50 мкМ/л концентрацию ионов меди (Си2+) при 37С. До и после 3-х часовой инкубации оценивали степень окислительной мо дификации по концентрации малонового диальдегида, определяемой спектро фотометрическим методом. Определение активности глутатионпероксидазы плазмы и эритроцитов [65]. Селеновые глутатионзависимые пероксидазы (ГПО) представляют собой группу ферментов, катализирующих восстановление пероксида водорода (Н2О2) и органических пероксидов (ROOH) с использованием в качестве доноров электронов восстановленной формы глутатиона (GSH). ROOH + 2GSH - ROH + Н20 + GSSG Н202 + 2GSH - ROH + Н20 + GSSG В нашем исследовании в качестве субстрата использовалась гидроперекись третбутила, имеющая чрезвычайно большую устойчивость при хранении в отличие от пероксида водорода, который неустойчив и быстро разлагается при хранении. Принцип метода состоит в том, что активность ГПО определяли по количеству израсходованного в ферментативной реакции восстановленного глутатио на в присутствии гидроперекиси третбутила. Ход исследования: смесь восстановленного глутатиона, 0,35 мг и 0,68 мг азида натрия растворенных в 0,5М растворе трис НС1 буфера (рН=8,5) в количестве 890 мкл преинкубировали 5 минут при 37С, затем вносили 90 мкл неразбавленной сыворотки крови или 200 мкл гемолизата эритроцитов и перемешивали. Через 15 секунд добавляли 20 мкл раствора гидроперекиси третбутила и инкубировали 5 минут. Далее белки осаждали 20% трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Затем к 2,45 мл трис НС1 буфера добавляли 200 мкл су-пернатанта и 100 мкл раствора NaOH, после чего вносили 25 мкл раствора 5,5 дитиобис(2-нитробензойной) кислоты. Через 5 минут пробу фотометриро-вали при длине волны 412 нм. Контрольная проба отличалась тем, что биологический материал вносили непосредственно перед осаждением белков ТХУ. Расчет вели на 1мл сыворотки крови или на 1 г гемоглобина.
Методы исследования эритроцитарного окислительного стресса. Для получения эритроцитов кровь забиралась венепункцией в пластиковые пробирки с добавлением ,8% раствора_цитратанатрия в соотношении 9:4 т-3а-тем кровь с консервантом осторожно и тщательно перемешивалась стеклянной палочкой. Для осаждения эритроцитов проводилось центрифугирование при 1500 об/мин в течение 10 минут. Супернатант отбрасывали. В полученном осадке эритроцитов удаляли белый слой лейкоцитов и трижды отмывали 0,154М раствором хлористого натрия, содержащего 0,058 мМ ЭДТА, путём тщательного перемешивания и центрифугирования. Вначале центрифугировали 10 минут при скорости 1000 об/мин. Эта суспензия использовалась для выделения мембран эритроцитов и приготовления гемолизатов. При вычислении параметров учитывалась концентрация гемоглобина (определение проводилось циангемоглобиновым тестом) и белка (определяли по методу Лоури).
Подготовка гемолизата для проведения исследований: в 0,1 мл упакованных эритроцитов добавляли 0,2 мл 0,2% раствора Тритона Х-100 и 0,7 мл дистиллированной воды. Полученный гемолизат использовали для определения актив ности ферментов и восстановленного глутатиона в эритроцитах (основной ге-молизат). Мембраны эритроцитов выделяли по методу, описанному в монографии [41]. Оценка ОС эритроцитов производилась по активности их антиокси-дантных ферментов ГПО и СОД, активности СРО, индуцированного in vitro по содержанию МДА.
Определение активности индуцированного СРО (МДА) в эритроцитах (in vitro). Окислительный стресс вызывали добавлением смеси 25 мМ раствора FeS04x7H20 и желточных липопротеидов [40].
Источником желточных липопротеидов (ЖЛП) служил желток куриного яйца, содержащий два типа липидно-белковых комплексов, соответствующих липопротеидам низкой плотности (ЛПНП) и липопротеидам очень низкой плотности (ЛПОНП) плазмы крови. Суспензию желточных липопротеидов получали путём гомогенизации желтка в равном объёме фосфатного буфера (40 мМ КН2РО4 , 105 мМ КС1, рН 7,45). Полученную смесь перед использованием разводили в 25 раз тем же буфером. Далее к 8 мл данной смеси добавляли 1 мл суспензии эритроцитов. Реакцию інициировали добавлениемЛ мл 25 мМ_рас- твора FeS04x7H20. Инкубировали 20 минут при 37С. Далее суспензию центрифугировали, эритроциты отмывали буфером. Затем в полученной фракции эритроцитов определяли содержание малонового диальдегида (МДА).
Определение содержания малонового диальдегида в мембранах эритроцитов [83]. МДА - маркер окислительного стресса, составляет основную часть продуктов СРО. Ход исследования: к пробам биологического материала (200 мкл мембран эритроцитов) в 1 мл фосфатного буфера добавляли 0,1 мл 10 М раствора FeS04x7 Н20; 10 минут встряхивали, затем добавляли 2,8 мл 2% раствора Н3РО4 и 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты. Смесь инкубировали при 95С в течение 30 минут, охлаждали, добавляли 4 мл бутанола. После экстракции розовой окраски смесь центрифугировали и измеряли оптическую плотность при длине волны 532 нм.
Состояние миокардиального окислительно-нитрозилирующего стресса у больных с ХСН
В настоящее время предполагается участие в формировании кардиореналь- ного синдрома метаболитов окислительно-нитрозилирующего стресса [93, 94]. Нами проведен корреляционный анализ индексов ОС с показателями функционального состояния почек у больных ХСН (табл. 31).
Корреляционный анализ показал, что самые слабые положительные связи наблюдались в парах ИОСі 2,з - Кр. В парах ИОС і,2,з - МАУ отмечались корреляционные связи средней силы. И, наконец, в парах ИОСідз - ЦИС устанавливались самые сильные достоверные положительные связи.
При этом у всех групп больных (1, 2 и 3) среди всех коэффициентов корреляции, взятых в сравнительных аспектах, наиболее сильные связи наблюдались у индексов ИОСі и особенно ИОС2. Причем их сила нарастала от 1 группы к 3-ей, достигая здесь своего максимума.
Полученные результаты подтверждают участие метаболитов окислительного стресса в поражении почек у больных с ХСН, особенно во 2 и 3 группах.
При анализе взаимосвязей между показателями функционального состояния почек и эндогенного воспаления (рис. 13, 14) выявлены разной силы, но практически все достоверные корреляции в группах больных с ХСН. Наиболее сильные положительные связи были установлены в парах ИЛ-6 - МАУ и ИЛ-6 - ЦИС. Самые слабые связи наблюдались в парах СРБ - Кр. Полученные результаты с высокой долей вероятности предполагают участие фактора эндоген ного воспаления в патогенезе повреждения почек у больных всех групп ХСН уже с начальной стадии заболевания.
Гиперурикимия (ГУ) при хронической сердечной недостаточности является актуальной проблемой кардиологии. Установлено, что повышение уровня мочевой кислоты является ключевым компонентом «кардиометаболического континуума» [44]. Показана значимость ГУ как фактора риска ССР и маркера их неблагоприятного течения с развитием осложнений. В то же время остается не ясной роль ГУ в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний и, в частности, хронической сердечной недостаточности [43, 56, 57]. Медиана содержания МК в сыворотке крови обследуемых контрольной группы (табл. 33) составила 285 (235;340) мкМ/л.
В группах больных концентрация мочевой кислоты прогрессирующе возрастала соответственно на 19% (р 0,05), 45,6% (р 0,01) и 96,5% (р 0,001). При этом во 2 и 3 группах ее уровень превышал таковой у пациентов 1 группы на 22% (р 0,05) и на 64,7% (р 0,001) соответственно.
Корреляционные связи между содержанием мочевой кислоты и показателями функционального состояния почек. Наиболее сильные положительные связи установлены в парах МК - Цис С у больных всех групп (рис. 15). Менее сильные связи отмечены в парах МК -МАУ (положительные) и в парах МК - СКФ (отрицательные). И, наконец, положительные корреляционные связи средней силы были выявлены в парах МК -Кр.
Таким образом, изменение обмена мочевой кислоты тесно связано практически со всеми показателями функционального состояния почек, что позволяет относить ее к маркерам и, возможно, медиаторам почечного "континуума" у больных с ХСН.
Гиперурикемия также рассматривается как адаптивная реакция на окислительный стресс, развивающийся при ХСН. Эндогенная мочевая кислота продуцируется ксантинокиназой, которая является главным источником свободных радикалов.
При этом связь МК с окислительным стрессом подобной силы в парах МК -ИОС] отмечена только у пациентов 3 группы. В паре МК - вкСОД максималь ный положительный коэффициент корреляции наблюдался только у пациентов 1 группы, что свидетельствует о влиянии МК на активацию вкСОД. Во 2 группе подобная достоверная закономерность была существенно ниже, а в 3 группе корреляционные связи были сильными, но отрицательными. Это может быть связано с ингибирующим влиянием МК на эффективность действия СОД у пациентов данной группы.
В ряде экспериментальных исследований были обнаружены положительные корреляционные связи МК с сывороточными маркерами воспаления, кроме этого она стимулировала высвобождение хемокинов, интерлейкинов 1(3, синтез ИЛ-6 и фактора некроза опухоли а (ФНО-а). Вместе с тем отношения МК и факторов воспаления еще малоизучены.
Нами проведен корреляционный анализ между содержанием мочевой кислоты в сыворотке крови и наиболее чувствительными и общепринятыми маркерами эндогенного воспаления вчСРБ и ИЛ-6 (табл. 35).
У больных всех групп наблюдались достоверные положительные связи, которые имели среднюю силу, причем в парах МК - ИЛ-6 они были частично сильными или приближались к ним. На этом основании можно полагать, что фактор эндогенного воспаления и, в частности, интерлейкин-6 принимает участие в кардиоренальном континууме у больных с ХСН.
Взаимосвязь функционального состояния почек с индексами окислительного стресса, эндогенным воспалениеми и уровнем галектина-3
Исследования последних лет показали, что МК может активировать фермент внеклеточную супероксиддисмутазу, снижая при этом активность окислитель ного стресса в тканях, обусловленного влиянием пероксида водорода [147]. При корреляционном анализе содержания МК и активности вкСОД максимальный положительный коэффициент корреляции наблюдался только у пациентов 1 группы, что свидетельствовало об активирующем ее влиянии на эффективность действия вкСОД. Во 2 группе подобная достоверная закономерность была су щественно ниже, а в 3 группе корреляционные связи МК - вкСОД были силь ными, но отрицательными. Это может быть связано с ингибирующим влиянием МК на активность вкСОД. Таким образом, можно полагать, что умеренная эн догенная гиперурикемия (1,2 группы больных) выступает как адаптивная реак ция на окислительный стресс, развивающийся при ХСН, что подтверждается исследованиями [235], тогда как высокая способствует его инициации. У всех групп больных нами отмечены достоверные сильные положительные связи между уровнями МК и галектина-3. Полученные результаты показали, что кардиоренальный синдром начинает формироваться на ранней стадии хронической сердечной недостаточности и в последующем его выраженность значительно возрастает. При этом галектин-3 выполняет как функцию маркера, так и может иметь медиаторное значение в ренальных аспектах патогенеза ХСН.
В настоящее время актуальна проблема определения предикторов сердечнососудистых осложнений, прогнозирования течения заболевания и выявления лиц с неблагоприятным исходом. Для определения прогноза необходимо учитывать влияние множества факторов. По современным данным основными и наиболее независимыми из них являются: этиология ХСН, возраст пациента, функциональный класс сердечной недостаточности, размеры сердца и фракция выброса левого желудочка, активность нейрогормонов и проводимое лечение.
В последние годы были разработаны различные модели прогнозирования выживаемости больных с хронической сердечной недостаточностью. Одной из них является Сиэтлская модель сердечной недостаточности [170], которая позволяет оценить прогноз при наличии комплекса клинико-лабораторных показателей (28 различных параметров, из них 13 - клинические признаки, характеризующие состояние больного, 15 - варианты текущей терапии). Другим способом прогнозирования течения ХСН у пациентов старше 75 лет является модель НЕВА-75 [85, 95]. В ее основе лежит определение концентрации мозгового натрийуретического пептида и учет возраста пациента. Однако в названных моделях отсутствует определение маркеров, принимающих непосредственное участие в патогенезе и прогрессировании сердечной недостаточности (маркеров фиброза и ремоделирования сердца). Кроме того при стабильно выраженной хронической сердечной недостаточности концентрация мозгового натрийуретического пептида может иметь существенную вариабельность значений и зависеть от таких факторов как пол, возраст, вес тела пациента, функции почек, наличия фибрилляции предсердий. В последние годы описаны биологические вещества, участвующие в фиброзе и ремоделировании миокарда при ХСН, определение которых может быть использовано для оценки риска и прогнозирования течения ХСН. Именно такими маркерами являяются галектин-3 и циста-тин С. Получены данные о возможности использования галектина-3 в клинической практике в качестве прогностического критерия у больных с хронической сердечной недостаточностью [180]. Подобные работы существуют и для циста-тина С [116].
В нашем исследовании за время наблюдения, составившего 26 месяцев, от сердечно-сосудистых причин умерло 107 пациентов и у одного пациента развился ишемический инсульт. Медиана содержания галектина-3 в КГ составила 7,2 нг/мл, в группе выживших - 12 нг/мл, у умерших - 32,5 нг/мл. Медиана ци-статина С в КГ была 1000 пг/мл, в группе выживших - 2000 пг/мл, умерших -4000 пг/мл. Медиана NT-proBNP в КГ составила 195 пг/мл, в группе выживших 800 пг/мл, умерших - 2250 пг/мл. У умерших пациентов отмечались достоверно более высокие уровни плазменного галектина-3, цистатина С и NT-proBNP по сравнению с выжившими больными (во всех случаях р 0,01). Для выявления прогностической значимости концентраций галектина-3, цистатина С, NT-proBNP и определения точки отсечения был выполнен ROC-анализ. Его результаты показали, что для прогноза неблагоприятен уровень галектина-3 выше 21 нг/мл (чувствительность теста 87%, специфичность 83,1%, площадь под ROC-кривой (AUC) равна 0,924, р 0,0001). Для цистатина С этот уровень оказался выше 2800 пг/мл (чувствительность теста 84,3%, специфичность 82%, AUC=0,888, р 0,0001), а для NT-proBNP - выше 1500 пг/мл (чувствительность теста 74,1%, специфичность 79,8%, AUC=0,851, р 0,0001). Для построения модели прогнозирования выживаемости больных применялся метод регрессионной модели пропорциональных интенсивностей Кокса. По его результатам независимыми предикторами развития летального исхода в течение 26 месяцев явились: галектин-3 [ОР=1.1035; ДИ=1,0812-1,1245 р=0.00001], цистатин С [ОР=1.0002;_ДИ=1,000Ы,0004;_р=0.0039] и-возраст [ОР=1,0334; ДИ=1,0093 1,0590; р=0.0079]. NT-proBNP в нашем исследовании не имел независимой прогностической значимости: [ОР=1.0001; ДИ=0,984-1,007; р=0.22]. При использовании значений коэффициентов множественной регрессии Кокса получено следующее уравнение модели: S(t)=exp(-A х ехр((0,0985149930 х В)+(0,0002328366 х С)+(0,0328478062 х D)))xl00%; где: ехр - ех, е - основание натуральных логарифмов; А - коэффициент базового риска, равный для 6 месяцев - 0,0003, для 12 месяцев - 0,00056, для 24 месяцев - 0,0021; В - концентрация галектина-3, нг/мл; С - концентрация цистатина С, пг/мл; D - возраст пациента.
Полученные результаты показали, что галектин-3 и цистатин С имеют независимую прогностическую значимость, и могут быть использованы в оценке выживаемости больных с хронической сердечной недостаточностью ишемиче-ской этиологии. Разработанная в ходе исследования модель прогнозирования и программа для ЭВМ позволит врачу более точно выявлять пациентов с неблагоприятным течением ХСН, нуждающихся в более интенсивной терапии и в усилении приверженности к лечению.
Таким образом, настоящее исследование, помимо описанных ранее другими авторами эффектов, позволило установить не только участие галектина 3 в формировании окислительного стресса и кардиоренального синдрома при хронической сердечной недостаточности, но возможность его применения в качестве маркера этих процессов.
![Клиническое значение нарушений гемореологии у больных с хронической сердечной недостаточностью ишемической этиологии [Электронный ресурс]](/i/i/4269/206176.png "Клиническое значение нарушений гемореологии у больных с хронической сердечной недостаточностью ишемической этиологии [Электронный ресурс] Россошанская Светлана Игоревна")
![Эндотелиальная дисфункция и эндотелин в патогенезе и лечении хронической сердечной недостаточности различной этиологии при циррозе печени и хронической обструктивной болезни легких [Электронный ресурс]](/i/i/4716/175318.png "Эндотелиальная дисфункция и эндотелин в патогенезе и лечении хронической сердечной недостаточности различной этиологии при циррозе печени и хронической обструктивной болезни легких [Электронный ресурс] Сироткин Сергей Александрович")
