Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Клиническая значимость разработок в области терапевтического ангиогенеза и актуальность задач 11
1.2 Механизмы васкуляризации в постнатальном периоде
1.2.1 Ангиогенез: механизмы и роль факторов, индуцируемых гипоксией (HIF) в его активации 13
1.2.2 Артериогенез и его механизмы: влияние напряжения сдвига и участие клеток воспаления 18
1.2.3 Васкулогенез в постнатальном периоде 21
1.2.4. Роль АФР как ключевых регуляторов ангиогенеза, артериогенеза и васкулогенеза.. 22
1.3 Факторы роста эндотелия сосудов (VEGF) и их роль в ангиогенезе 22
1.3.1 VEGF: краткая характеристика семейства факторов роста 22
1.3.2 Рецепторы VEGF и механизмы влияния VEGF нарост сосудов 23
1.3.3 Функциональная характеристика изоформ VEGF-A и их участие в ангиогенезе 24
1.4 Фактор роста гепатоцитов как плеотропный АФР и его биологическая активность25
1.4.1 Структура и механизмы активации HGF 25
1.4.2 Рецептор c-met и его тирозинкиназная активность 26
1.4.3 Роль PGF в развитии и его участие в постнатальной васкуляризации и регенерации. 1.5 Взаимодействие между VEGF165 и HGF в регуляции ангиогенеза 28
1.6 Клиническая и прогностическая значимость уровня VEGF165 и HGF при ишемических заболеваниях
1.6.1 Клиническая и прогностическая значимость VEGF165 в патогенезе ишемических заболеваний 30
1.6.2 Изменения содержания HGF при сердечно-сосудистых заболеваниях 31
1.7 Терапевтический ангиогенез: развитие направления и генная терапия 33
1.7.1 Клинические исследования генной терапии VEGF165 приКИНК и ИМ 33
1.7.2 Клинические исследования генной терапии HGF приКИНК 36
1.7.3 Клинические исследования генной терапии с помощью FGF 37
1.8 Факторы, определяющие эффективность генной терапии и возможности
усовершенствования существующих методов 38
1.8.1 Выбор вектора для генной терапии: баланс эффективности и безопасности 38
1.8.2 Выбор способа доставки вектора в ишемизированную ткань з
1.8.3 Дозировка и продолжительность лечения 42
1.8.4 Использование комбинированной генной терапии для стимуляции ангиогенеза 43
1.9 Заключение 45
Глава 2. Материалы и методы 47
2.1 Группа больных ИБС с постинфарктной ХСН и контрольная группа здоровых добровольцев 47
2.2 Молекулярные и биохимические методы 48
2.3 Цитологические методы 53
2.4 Эксперименты на животных 56
2.5 Гистологические методы и опыты ex vivo 58
2.6 Микроскопические методики 60
2.7 Статистическая обработка данных 61
Глава 3. Результаты 62
3.1 Исследование содержания VEGF165 и HGF в сыворотке крови и определение их
значимости как биомаркеров тяжести течения и развития постинфарктной ХСН 62
3.1.2 Оценка содержания VEGF165 и HGF в сыворотке крови больных ИБС 65
3.1.3 Корреляционный анализ содержания VEGF165 и HGF и уровня маркеров тяжести ХСН в сыворотке крови больных ИБС 66
3.1.4 Регрессионный анализ показателей содержания VEGF165 и HGF и выявление пороговых значений, ассоциированных с ИБС 67
3.2 Конструирование и оценка экспрессионной активности плазмид с генами
человеческих VEGF165 и HGF in vitro 71
3.2.1 Конструирование плазмид с генами VEGF165 и HGF и амплификация пДНК в бактериях Е. Coli 71
3.2.2 Определение содержания бактериального эндотоксина в плазмидной ДНК 71
3.2.3 Продукция VEGF165 и HGF трансфицированными клетками НЕК293Т 71
3.2.4 Оценка функциональных свойств секретируемых VEGF165 и HGF на культуре клеток HUVEC 73
3.3. Отработка плазмидной трансфекции in vivo и оценка продукции человеческих VEGF165 и HGF в ткани экспериментальных животных 75
3.3.1 Оценка эффективности трансфекции скелетной мышцы мыши in vivo при использовании чрескожной электропорации 75
3.3.2 Оценка продукции VEGF165 и HGF человека в скелетной мышце мыши и миокарде крысы с помощью эксплантной культуры 76
3.3.3 Определение содержания VEGF и HGF человека в гомогенатах скелетной мышцы мыши и миокарда крысы после введения плазмид 79
3.4 Оценка ангиогенной эффективности плазмид с генами VEGF165 и HGF на мышиной модели ишемии задней конечности 81
3.4.1 Динамика восстановления кровотока в ишемизированной задней конечности мыши после введения плазмид с генами VEGF165, HGF или их комбинации 81
3.4.2 Гистологический анализ образцов ишемизированных скелетных мышц после введения плазмид с генами VEGF 165, HGF или их комбинации 83
3.5 Оценка ангиогенных свойств плазмид с генами VEGF165 и HGF при введении в ишемизированный миокард крысы 86
3.5.1 Влияние введения плазмид с генами VEGF 165 и HGF на размер ИМ и площадь постинфарктного фиброза 86
3.5.2 Оценка плотности сосудов в периинфарктной зоне после введения плазмид с генами VEGF 165, HGF или их комбинации 87
3.5.3 Гистологическая оценка моноцитарной инфильтрации периинфарктной зоны миокарда после введения плазмид с генами VEGF 165 и HGF 90
3.6 Изучение молекулярных механизмов действия комбинации VEGF165 и HGF на ангио- и артериогенез 92
3.6.1 Анализ активации МАР-киназных сигнальных молекул при стимуляции эндотелия VEGF 165, HGF или их комбинацией 92
3.6.2 Влияние VEGF165 и HGF на продукцию эндотелием МСР-1 и интерлейкина-8 93
3.6.3 Оценка активации транскрипции генов МСР-1 и IL-8 в культурах HUVEC и ТГМЕ после стимуляции VEGF 165 и HGF 95
3.6.4 Анализ активности регуляторного каскада NFKB методом иммуноблоттинга 96
3.6.5 Оценка активности транскрипционных факторов HIF и промотора гена IL-8 с помощью плазмид с генами люцифераз 98
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 103
Заключение 127
Выводы 129
Список сокращений и обозначений 130
Список литературы
- Артериогенез и его механизмы: влияние напряжения сдвига и участие клеток воспаления
- Молекулярные и биохимические методы
- Оценка содержания VEGF165 и HGF в сыворотке крови больных ИБС
- Оценка плотности сосудов в периинфарктной зоне после введения плазмид с генами VEGF 165, HGF или их комбинации
Артериогенез и его механизмы: влияние напряжения сдвига и участие клеток воспаления
По данным ВОЗ на долю ССЗ приходится около 33% всей смертности [208; 209]. Одной из основных причин развития ССЗ является связанное с развитием атеросклероза сужение просвета или полная окклюзия сосудов [116; 143]. Таким образом, основной задачей в их лечении становится восстановление кровоснабжения ткани с целью сохранения ее функциональной активности, уменьшения выраженности ишемии и связанных с ней тяжелых состояний (ИМ, ОНМК, трофических язв и гангрен конечностей).
Несмотря на широкие возможности медикаментозных, эндоваскулярных и хирургических методов лечения ССЗ существует достаточно многочисленная когорта больных с тяжелыми хроническими поражениями сосудистого русла и тканей, у которых невозможно проведение интервенционных процедур: шунтирования, стентирования и ангиопластики. Достаточно частыми противопоказаниями являются сопутствующие заболевания -онкологические, расстройства в эндокринной сфере и др. [118].
С учетом высокой стоимости и потенциальных осложнений возможности реваскуляризации ограничены у пациентов с хроническими диффузными окклюзиями и протяженными атеротромботическими поражениями в магистральных артериях. У таких пациентов имеется повышенный риск острого тромбоза или рестеноза после оперативного или интервенционного вмешательства [70; 214]. Отдельного упоминания заслуживают пациенты, которым уже были проведены операции шунтирования или стентирования с последующим развитием рестенозов, т.е. возможности хирургического лечения оказываются фактически исчерпаны [84; 244].
В связи этим приобрела актуальность разработка способов восстановления кровотока, базирующихся на принципиально новых подходах. Одним из таких методов стал терапевтический ангиогенез, включающий методы, направленные на стимуляцию естественных процессов восстановления кровотока в ишемизированных тканях. При этом последнее происходит не за счет формирования искусственного анастомоза или пластики сосудов, пораженных атеросклерозом, а в результате экзогенной активации физиологических процессов, приводящих к росту новых сосудов и ремоделированию существующих коллатералей[234]. Естественные процессы роста сосудов обладают достаточно высокой эффективностью, о которой свидетельствуют многолетние резервы компенсации недостаточного кровоснабжения у пациентов с ИБС и КИНК. При этом следует принимать во внимание комплексность данных процессов, сложность их регуляции и большое количество участников процесса, каждый из которых имеет важную, а иногда и критическую значимость для успешности восстановления перфузии ткани.
В настоящее время выделяют три способа формирования сосудов в постнатальном периоде: васкулогенез, ангиогенез и артериогенез [34; 267].
Васкулогенезом принято называть истинное формирование кровеносного сосуда de novo из прогениторных клеток, дифференцирующихся в клетки сосудистой стенки. В основном данное понятие относится к периоду эмбрионального развития и закладке кровеносной системы из первичного сосудистого сплетения и ангиобластных клеток мезенхимного происхождения [117; 206]. Однако имеются данные, указывающие на то, что в постнатальном и взрослом организме также могут происходить процессы васкулогенеза за счет эндотелиальных прогениторных клеток (ЭПК) [15; 121; 167; 254]. В некоторых работах концепция постнатального васкулогенеза за счет дифференцировки ЭПК подвергается сомнению а их участие в стимуляции роста сосудов ограничивается паракринными эффектами - продукцией АФР и других цитокинов [22; 88; 187; 224],.
В постнатальном периоде ключевую роль играют процессы ангиогенеза, под которым понимают формирование нового сосуда за счет пролиферации и миграции клеток эндотелия с образованием нового отростка. Начинаясь еще в эмбриогенезе после формирования первичного сосудистого сплетения, во взрослом организме он является основным способом расширения кровеносного русла (в основном, капиллярного), играя роль в восстановлении трофики при ишемии, участвуя в заживлении ран и некоторых патологических процессах [196]. К последним относятся рост опухолей, диабетическая ретинопатия и др.
Третьим процессом, обеспечивающим поддержание адекватного кровотока и его восстановление, является артериогенез - увеличение просвета сосуда и толщины его стенки под влиянием возросшего напряжения сдвига (англ. shear stress) и механического растяжения стенки сосуда. Артериогенез играет ведущую роль в компенсации потерь кровоснабжения при стенозах или полных окклюзиях сосудов и приводит к формированию коллатерального кровотока [196]. Наиболее чувствительными к возникающему градиенту давления являются области артерио-артериолярных анастомозов, однако показана обратимость начальных этапов артериогенеза при недостаточно длительном повышении давления или его быстрой нормализации [98].
Таким образом, при ишемических заболеваниях компенсация кровоснабжения возможна за счет формирования новых сосудов - ангиогенеза и ремоделирования предсуществующих артериол с превращением их в функциональные коллатеральные артерии - артериогенеза. Также нельзя исключать вклада постнатального васкулогенеза, хотя его роль в восстановлении кровоснабжения при ишемической патологии остается предметом дискуссий. Остановимся подробнее на двух первых процессах.
Основным стимулом для ангиогенеза является гипоксия [73], которая может быть связана как с ускорением потребления кислорода тканями (при активном росте организма, физических нагрузках, эндокринных расстройствах, ускорении обмена при анаболических процессах), так и с уменьшением его поступления (нарушение притока крови, анемия и другие причины).
В нормальных условиях кровеносный сосуд представляет собой структуру, состоящую из неделящихся клеток. Стабильность сосуда поддерживается уравновешивающими сигналами от белков, стимулирующих или подавляющих ангиогенез (VEGF, Notch-1, ангиопоэтин-1, FGF, тромбоспондин и др.). При ишемии, воспалении, заживлении ран и опухолевом росте это состояние смещается, и компоненты сосудистой стенки выходят из стабильного статуса. Клетки эндотелия, стромы и ГМК обладают способностью к рецепции парциального напряжения кислорода за счет наличия у них чувствительных к гипоксии молекул из класса пролилгидроксилаз (PHD-1, PHD-2) [54]. Основной функцией PHD является регуляция активности транскрипционных факторов, индуцируемых гипоксией (HIF). Последние представляет собой гетеродимеры, состоящие из конститутивно экспрессирующейся HIF-P субъединицы (известной также как ARNT) и одной из трех кислород-зависимых субъединиц (НГГ-1а, HIF-2a или НГГ-За). Гетеродимеры HIF-P и одной из а-субъединиц формируют факторы транскрипции HIF-1, HIF-2 и НГГ-З соответственно [400].
Наиболее хорошо изучены структура и функциональная активность субъединиц HIF-la и HIF-2a. Аминокислотные последовательности HIF-la и HIF-2a идентичны на 48%, а различия между HIF-la и HIF-2a заключаются в структуре N-концевого трансактивационного домена, определяющего специфику регулируемых ими генов [73; 317].
Эффекты HIF реализуются за счет наличия сайтов их связывания, которые получили название элементов, чувствительных к гипоксии (англ. hypoxia responsive elements, HRE). HRE-сиквенсы обнаружены в промоторных областях генов многих АФР, цитокинов, протеаз и молекул адгезии [342].
Гипоксическая индукция факторов из семейства HIF связана со стабильностью их а-субъединиц, так как Р субъединица экспрессируется на постоянном уровне и локализуется в ядре клетки. В условиях нормоксии а-субъединицы HIF имеют средний период полужизни около 5 минут за счет активности PHD, которые гидроксилируют HIF-la и -2а по консервативным остаткам пролина в домене кислород-зависимой деградации (ODD). Гидроксилирование пролина приводит к присоединению к этому домену белка фон Хиппель-Ландау (VHL), который формирует ЕЗ-убиквитинлигазный комплекс. Последний способствует полиубиквитинированию a-субъединиц с последующей их протеасомной деградацией [401]. В условиях гипоксии активность обеих изоформ PHD ингибируется, что приводит к стабилизации HIF-1 а и HIF-2a. Альфа-субъединицы перемещаются в ядро, где гетеродимеризуются с HIF-P, после чего факторы транскрипции связываются с HRE и активируют экспрессию HIF-зависимых генов.
В условиях нормоксии транскрипционная активность HIF-1 а и HIF-2a регулируется также за счет другого кислород-зависимого фермента, FIH-1 (аятл. factor inhibiting HIF-1). FIH-1 гидроксилирует 803-ий остаток аспарагина HIF-la и HIF-2a, препятствуя их взаимодействию с кофактором рЗОО/СВР. По аналогии с PHD активность FIH-1 ингибируется в гипоксических условиях, что позволяет комплексу кофакторов рЗОО/СВР связываться с HIF-la и HIF-2a, обеспечивая активацию экспрессии генов, несущих HRE-сиквенс (рисунок 1) [317].
Молекулярные и биохимические методы
По данным ВОЗ на долю ССЗ приходится около 33% всей смертности [208; 209]. Одной из основных причин развития ССЗ является связанное с развитием атеросклероза сужение просвета или полная окклюзия сосудов [116; 143]. Таким образом, основной задачей в их лечении становится восстановление кровоснабжения ткани с целью сохранения ее функциональной активности, уменьшения выраженности ишемии и связанных с ней тяжелых состояний (ИМ, ОНМК, трофических язв и гангрен конечностей).
Несмотря на широкие возможности медикаментозных, эндоваскулярных и хирургических методов лечения ССЗ существует достаточно многочисленная когорта больных с тяжелыми хроническими поражениями сосудистого русла и тканей, у которых невозможно проведение интервенционных процедур: шунтирования, стентирования и ангиопластики. Достаточно частыми противопоказаниями являются сопутствующие заболевания -онкологические, расстройства в эндокринной сфере и др. [118].
С учетом высокой стоимости и потенциальных осложнений возможности реваскуляризации ограничены у пациентов с хроническими диффузными окклюзиями и протяженными атеротромботическими поражениями в магистральных артериях. У таких пациентов имеется повышенный риск острого тромбоза или рестеноза после оперативного или интервенционного вмешательства [70; 214]. Отдельного упоминания заслуживают пациенты, которым уже были проведены операции шунтирования или стентирования с последующим развитием рестенозов, т.е. возможности хирургического лечения оказываются фактически исчерпаны [84; 244].
В связи этим приобрела актуальность разработка способов восстановления кровотока, базирующихся на принципиально новых подходах. Одним из таких методов стал терапевтический ангиогенез, включающий методы, направленные на стимуляцию естественных процессов восстановления кровотока в ишемизированных тканях. При этом последнее происходит не за счет формирования искусственного анастомоза или пластики сосудов, пораженных атеросклерозом, а в результате экзогенной активации физиологических процессов, приводящих к росту новых сосудов и ремоделированию существующих коллатералей[234]. Естественные процессы роста сосудов обладают достаточно высокой эффективностью, о которой свидетельствуют многолетние резервы компенсации недостаточного кровоснабжения у пациентов с ИБС и КИНК. При этом следует принимать во внимание комплексность данных процессов, сложность их регуляции и большое количество участников процесса, каждый из которых имеет важную, а иногда и критическую значимость для успешности восстановления перфузии ткани.
В настоящее время выделяют три способа формирования сосудов в постнатальном периоде: васкулогенез, ангиогенез и артериогенез [34; 267].
Васкулогенезом принято называть истинное формирование кровеносного сосуда de novo из прогениторных клеток, дифференцирующихся в клетки сосудистой стенки. В основном данное понятие относится к периоду эмбрионального развития и закладке кровеносной системы из первичного сосудистого сплетения и ангиобластных клеток мезенхимного происхождения [117; 206]. Однако имеются данные, указывающие на то, что в постнатальном и взрослом организме также могут происходить процессы васкулогенеза за счет эндотелиальных прогениторных клеток (ЭПК) [15; 121; 167; 254]. В некоторых работах концепция постнатального васкулогенеза за счет дифференцировки ЭПК подвергается сомнению а их участие в стимуляции роста сосудов ограничивается паракринными эффектами - продукцией АФР и других цитокинов [22; 88; 187; 224],.
В постнатальном периоде ключевую роль играют процессы ангиогенеза, под которым понимают формирование нового сосуда за счет пролиферации и миграции клеток эндотелия с образованием нового отростка. Начинаясь еще в эмбриогенезе после формирования первичного сосудистого сплетения, во взрослом организме он является основным способом расширения кровеносного русла (в основном, капиллярного), играя роль в восстановлении трофики при ишемии, участвуя в заживлении ран и некоторых патологических процессах [196]. К последним относятся рост опухолей, диабетическая ретинопатия и др.
Третьим процессом, обеспечивающим поддержание адекватного кровотока и его восстановление, является артериогенез - увеличение просвета сосуда и толщины его стенки под влиянием возросшего напряжения сдвига (англ. shear stress) и механического растяжения стенки сосуда. Артериогенез играет ведущую роль в компенсации потерь кровоснабжения при стенозах или полных окклюзиях сосудов и приводит к формированию коллатерального кровотока [196]. Наиболее чувствительными к возникающему градиенту давления являются области артерио-артериолярных анастомозов, однако показана обратимость начальных этапов артериогенеза при недостаточно длительном повышении давления или его быстрой нормализации [98].
Таким образом, при ишемических заболеваниях компенсация кровоснабжения возможна за счет формирования новых сосудов - ангиогенеза и ремоделирования предсуществующих артериол с превращением их в функциональные коллатеральные артерии - артериогенеза. Также нельзя исключать вклада постнатального васкулогенеза, хотя его роль в восстановлении кровоснабжения при ишемической патологии остается предметом дискуссий. Остановимся подробнее на двух первых процессах.
Основным стимулом для ангиогенеза является гипоксия [73], которая может быть связана как с ускорением потребления кислорода тканями (при активном росте организма, физических нагрузках, эндокринных расстройствах, ускорении обмена при анаболических процессах), так и с уменьшением его поступления (нарушение притока крови, анемия и другие причины).
В нормальных условиях кровеносный сосуд представляет собой структуру, состоящую из неделящихся клеток. Стабильность сосуда поддерживается уравновешивающими сигналами от белков, стимулирующих или подавляющих ангиогенез (VEGF, Notch-1, ангиопоэтин-1, FGF, тромбоспондин и др.). При ишемии, воспалении, заживлении ран и опухолевом росте это состояние смещается, и компоненты сосудистой стенки выходят из стабильного статуса. Клетки эндотелия, стромы и ГМК обладают способностью к рецепции парциального напряжения кислорода за счет наличия у них чувствительных к гипоксии молекул из класса пролилгидроксилаз (PHD-1, PHD-2) [54]. Основной функцией PHD является регуляция активности транскрипционных факторов, индуцируемых гипоксией (HIF). Последние представляет собой гетеродимеры, состоящие из конститутивно экспрессирующейся HIF-P субъединицы (известной также как ARNT) и одной из трех кислород-зависимых субъединиц (НГГ-1а, HIF-2a или НГГ-За). Гетеродимеры HIF-P и одной из а-субъединиц формируют факторы транскрипции HIF-1, HIF-2 и НГГ-З соответственно [400].
Наиболее хорошо изучены структура и функциональная активность субъединиц HIF-la и HIF-2a. Аминокислотные последовательности HIF-la и HIF-2a идентичны на 48%, а различия между HIF-la и HIF-2a заключаются в структуре N-концевого трансактивационного домена, определяющего специфику регулируемых ими генов [73; 317].
Эффекты HIF реализуются за счет наличия сайтов их связывания, которые получили название элементов, чувствительных к гипоксии (англ. hypoxia responsive elements, HRE). HRE-сиквенсы обнаружены в промоторных областях генов многих АФР, цитокинов, протеаз и молекул адгезии [342].
Гипоксическая индукция факторов из семейства HIF связана со стабильностью их а-субъединиц, так как Р субъединица экспрессируется на постоянном уровне и локализуется в ядре клетки. В условиях нормоксии а-субъединицы HIF имеют средний период полужизни около 5 минут за счет активности PHD, которые гидроксилируют HIF-la и -2а по консервативным остаткам пролина в домене кислород-зависимой деградации (ODD). Гидроксилирование пролина приводит к присоединению к этому домену белка фон Хиппель-Ландау (VHL), который формирует ЕЗ-убиквитинлигазный комплекс. Последний способствует полиубиквитинированию a-субъединиц с последующей их протеасомной деградацией [401]. В условиях гипоксии активность обеих изоформ PHD ингибируется, что приводит к стабилизации HIF-1 а и HIF-2a. Альфа-субъединицы перемещаются в ядро, где гетеродимеризуются с HIF-P, после чего факторы транскрипции связываются с HRE и активируют экспрессию HIF-зависимых генов.
В условиях нормоксии транскрипционная активность HIF-1 а и HIF-2a регулируется также за счет другого кислород-зависимого фермента, FIH-1 (аятл. factor inhibiting HIF-1). FIH-1 гидроксилирует 803-ий остаток аспарагина HIF-la и HIF-2a, препятствуя их взаимодействию с кофактором рЗОО/СВР. По аналогии с PHD активность FIH-1 ингибируется в гипоксических условиях, что позволяет комплексу кофакторов рЗОО/СВР связываться с HIF-la и HIF-2a, обеспечивая активацию экспрессии генов, несущих HRE-сиквенс (рисунок 1) [317].
Оценка содержания VEGF165 и HGF в сыворотке крови больных ИБС
Если для возраста больных и ИМТ связь с формированием ИБС является доказанной, то возможная роль HGF стала интересной находкой. Поскольку была использована логистическая регрессия, то незначительное, на первый взгляд, отношение шансов для HGF объясняется тем, что оно является экспоненциальной функцией регрессионного коэффициента и, следовательно, отражает увеличение риска в ответ на прирост показателя на единицу измерения (1,0 пг/мл) [412]. Таким образом, на каждый 1,0 пг/мл, вероятность развития ИБС может увеличиваться на 1,22% (Д.И. 95%: 0,5-1,9%). Разумеется, эти данные должны подтверждаться в исследованиях с проспективным дизайном.
Полученные результаты могут отражать компенсаторное повышение уровня HGF в ответ на ишемические изменения метаболизма миокарда, причем не только у больных с клинически выраженными признаками ИБС или сформировавшейся ХСН, но и на ранних этапах атеросклеротического поражения коронарных сосудов. Учитывая роль HGF, как фактора, подавляющего апоптоз кардиомиоцитов [177; 433] и регулирующего мобилизацию резидентных стволовых клеток сердца [252], участвующих в процессах обновления миокарда и его регенерации, обнаруженная зависимость указывает на участие HGF в ответе на развитие стенозирующего коронарного атеросклероза, приводящее к формированию ИБС [153].
Полученные результаты также указывают на возможность определения границ между уровнями HGF, которые характерны для групп «низкого» и «высокого» риска развития ИБС. Для этого был использован подход, известный как «деревья классификации», который часто дополняет регрессионный анализ и делает его результаты более применимыми в практическом плане. Несмотря на небольшой размер выборки (оптимальным для данного метода является объем выборки 150-200 человек), нам удалось выделить ряд подгрупп, и пограничных значений, которые приведены ниже (рисунок 7). Группа N=81
Дерево классификации подгрупп в зависимости от содержания HGF в крови и соотношения «здоровые/больные ИБС». Выборка исследования разделилась на 3 подгруппы с превалированием здоровых лиц или больных ИБС. Выделенные пороговые значения концентрации фактора роста приведены над группами 2.1-2.3. Столбцы отражают количественное соотношение больных ИБС (красные) и здоровых лиц (зеленые).
Хорошо видно, что в группе 2.1 "Здоровые" превалируют добровольцы из группы контроля (зеленый столбец, п=14), а больные ИБС (красный столбец, п=4) находятся в меньшинстве. Эта группа характеризуется низким ( 384,1 пг/мл) содержанием HGF.
В группе 2.2 "Переходные значения" отмечены промежуточные значения содержания HGF (348,1-661,1 пг/мл), а также наблюдается тенденция к уменьшению кол-ва здоровых лиц (п=10) с превалированием больных ИБС (п=30).
В группе 2.3 «Больные ИБС» наблюдались высокие значения концентрации HGF ( 661,1 пг/мл). В нее не вошло ни одного здорового добровольца, и она полностью состояла из больных ИБС с постинфарктной ХСН (п=23).
В приведенной модели были подтверждены данные регрессионного анализа, а также предложено дискриминирующее значение уровня HGF в периферической крови равное 661,1 пг/мл. В обследованной выборке превышение данного порога было характерно только для больных ИБС и не встречалось среди здоровых добровольцев. Необходимо еще раз подчеркнуть, что проведенный анализ позволяет выявить факторы, статистически ассоциированные с развитием болезни. Верификация такого рода результатов требует проведения проспективных исследований и более широких когорт для достижения соответствующей статистической мощности.
Для создания плазмидных конструкций с генами АФР был использован оригинальный плазмидный вектор pC4W, созданный сотрудниками ФГБУ РКНПК и фирмы «МОНА» (патент на изобретение RU2364627C2), в который были встроены оптимизированные последовательности кДНК VEGF и HGF человека. В рамках данной диссертационной работы была проведена сравнительная оценка функциональной активности новых плазмидных конструкций и плазмидных конструкций, полученными на основе референсного коммерческого вектора pcDNA3 (Invitrogen, США). Для проведения этих сравнительных исследований была получена панель плазмидных конструктов, кодирующих гены VEGF165 и HGF человека с различной степенью оптимизации, встроенных в новый экспрессионный вектор pC4W и референсный коммерческий вектор pcDNA3 (Invitrogen, США). Все полученные плазмиды и последовательности оптимизированных кДНК были проанализированы рестрикционным методом и секвенированием. Для амплификации плазмидной ДНК были использованы компетентные бактерии Е. Coli штамма DH5a. Выделение плазмидной ДНК проводилось с использованием наборов Endofree производства компании Qiagen согласно протоколу производителя, после чего пДНК ресуспендировали в 0,9% NaCl.
Клетки НЕК293Т трансфицировали плазмидами, несущими кДНК VEGF165 или HGF, с помощью кальций-фосфатного метода. Его эффективность, оцененная по количеству GFP-позитивных клеток после трансфекции плазмидой pcDNA3-EGFP, составила 70-75%. Содержание факторов роста в образцах культуральной среды, собранных через 48 часов после трансфекции, определяли при помощи ИФА (рисунок 8) и методом вестерн-блоттинга (рисунок 9).
При использовании плазмидных конструкций на базе нового вектора pC4W содержание соответствующих факторов роста в культуральной среде во всех случаях оказалось выше, чем при использовании конструкций с теми же генами на базе традиционного вектора pcDNA3. Кроме того, оптимизация нуклеотидных последовательностей в генах VEGF165 и HGF приводила к существенному увеличению продукции факторов трансфицированными клетками.
Оценка плотности сосудов в периинфарктной зоне после введения плазмид с генами VEGF 165, HGF или их комбинации
NFKB контролирует экспрессию широкого спектра генов и может модулировать продукцию не только хемокинов, но и других белков системы воспаления. Проведенный анализ влияния VEGF165 и HGF на экспрессию молекул адгезии ICAM-1 и VCAM-1 показал, что изменение количества их мРНК совпадало с действием этих ФР на фосфорилирование ІкВа и с изменениями моноцитарной инфильтрации миокарда в группах VEGF165, HGF или их сочетания.
В ряде работ показано, что АФР регулируют таксис моноцитов в ишемизированные ткани за счет модуляции адгезивных свойств эндотелия [347; 348]. Вкупе с полученными данными можно предположить, что разнонаправленное действие VEGF165 и HGF на моноцитарную инфильтрацию периинфарктной зоны обусловлено их влияние на активность NFKB В эндотелии коронарных сосудов. Изменяя активность данного фактора транскрипции они модулируют продукцию хемокинов (МСР-1) и молекул адгезии (ICAM-1 и VCAM-1), которые являются одними из ключевых медиаторов инвазии моноцитов в миокард [126].
Похожие результаты получены Min и соавт. [165] при анализе эффектов VEGF165 и HGF в культуре HUVEC. Под действием VEGF165 авторы наблюдали увеличение адгезии лейкоцитов, которое подавлялось при добавлении HGF к ЭК. Эти результаты коррелировали с изменениями активности NFKB И экспрессией молекул адгезии ICAM-1 и VCAM-1 на поверхности ЭК. При оценке действия VEGF165 и HGF in vivo на кожной модели воспаления было показано, что они обладают разнонаправленным действием на экстравазцию лейкоцитов. Авторы также предположили, что разнонаправленное действие этих АФР может быть использовано для создания метода стимуляции «ангиогенеза без воспаления». В этой работе не было проведено исследования активности ангио- или артериогенеза, которая в нашем случае выявила описанные выше особенности регуляции этих процессов под действием VEGF165 и HGF.
Другим хемокином, продукция которого изменялась при стимуляции эндотелия VEGF165 и HGF, был IL-8. При этом оба фактора роста оказывали однонаправленное влияние на количество нарабатываемого IL-8. Под влиянием как HGF, так и VEGF165, его концентрация в кондиционированной среде увеличивалась, а при действии их комбинации отмечался аддитивный эффект с достижением высоких концентраций IL-8 уже через 2-4 ч от начала эксперимента. Возможным механизмом такого быстрого увеличения содержания IL-8 в кондиционированной среде является секреция из телец Вейбела-Палада - специфических внутриклеточных гранул ЭК [395]. Их дегрануляция может происходить в ответ на различные стимулы, включая воздействие факторов роста, воспалительных цитокинов и токсинов бактерий [374]. Основным компонентом телец Вейбела-Палада являются тубулярные структуры, состоящие из фактора фон Виллебранда, однако помимо последнего они содержат большое количество IL-8 [426].
При этом данные ПЦР выявили увеличение содержания мРНК IL-8 при действии обоих факторов роста с выраженным аддитивным эффектом их комбинации. По этой причине рост концентрации IL-8 под действием VEGF165 и HGF на ЭК не мог объясняться только дегрануляцией телец Вейбела-Палада, так как сопровождался увеличением количества транскриптов соответствующего гена.
При этом возникал вопрос о механизме, за счет которого HGF мог бы стимулировать экспрессию IL-8, так как в предыдущих экспериментах было показано его подавляющее влияние на активность NFKB И продукцию МСР-1. IL-8 также относится к регулируемым NFKB генам, а его промоторная область содержит сиквенс для связывания с его RelA субъединицей [356], однако наши результаты выявили расхождение между характером влияния HGF на активность NFKB И экспрессию IL-8. В данной ситуации наиболее вероятным представлялось наличие альтернативного пути регуляции экспрессии IL-8, активируемого HGF и опосредованного другими факторами транскрипции.
Среди многообразия белков, участвующих в контроле экспрессии IL-8, важную роль играют факторы, индуцируемые гипоксией - HIF [366; 367]. Внимание к ним также было привлечено тем, что стабильность а-субъединиц HIF может увеличиваться при активации MAP 123 киназ, которая в данной работе была показана на культуре HUVEC. В этих опытах наблюдалось увеличение активности ERK-1/2, р38 и Akt, для которых показано участие в стабилизации субъединиц HIF-la и HIF-2a за счет прямого фосфорилирования [351; 376].
Для количественной оценки активности HIF в эндотелиальных клетках была использована плазмидная конструкция, в которой экспрессия гена люциферазы находилась под контролем элемента, чувствительного к гипоксии - HRE. Такой подход позволял оценить влияние VEGF165 и HGF на стабилизацию HIF в условиях нормоксии, при которой количество этого фактора транскрипции крайне мало, что не позволяет детектировать его методом вестерн-блоттинга. Проведенный анализ показал, что VEGF165 и HGF вызывали увеличение HIF-зависимого сигнала. Последний положительно коррелировал с активацией промотора IL-8, который был клонирован в другую репортерную конструкцию с геном люциферазы и использован в параллельном опыте с аналогичным дизайном. Максимальные значения обоих показателей были отмечены после стимуляции эндотелиальных клеток комбинацией двух факторов роста. Таким образом предполагавшееся повышение активности HIF за счет его стабилизации было показано с помощью люминесцентных репортеров, причем рост HIF-зависимого сигнала совпадал с увеличением активности промотора гена IL-8. В обоих случаях VEGF165 и HGF характеризовались аддитивным положительным влиянием на изучаемые параметры.
При этом известно, что HIF-1 и HIF-2, участвуя в регуляции экспрессии IL-8, обладают разнонаправленным действием - HIF-1 снижает, а HIF-2 увеличивает экспрессию IL-8 [366]. Сайтом связывания обеих форм HIF является сиквенс HRE, однако противоположное действие двух АФР может реализовываться за счет кофакторов, которые формируют гетеромерный комплекс в промоторе гена IL-8, приводя к стимуляции или подавлению экспрессии хемокина [366].
Предпринятый анализ с использованием РНК-интерференции показал, что селективное подавление экспрессии HIF-la приводило к увеличению продукции IL-8 в ответ на стимуляцию факторами роста. При этом особенно значимый прирост был зафиксирован в ответ на HGF или его комбинацию с VEGF. Такой результат подкрепляет существующее мнение о возможном подавляющем действии HIF-1 на экспрессию IL-8. Действительно, прирост количества IL-8 в ответ на HGF мог быть связан с тем, что в отсутствие подавляющего действия HIF-1 экспрессия гена IL-8 в ответ на АФР возрастала по сравнению с исходным уровнем ответа. Эти данные хорошо согласуются с результатами работы Loboda и соавт. [366], в которой показана отрицательная корреляция между количеством HIF-1 и экспрессией гена IL-8.
Подавление экспрессии HIF-2a, входящего в состав HIF-2, являющегося активатором экспрессии IL-8, приводило к резкому падению продукции этого хемокина эндотелиальными клетками в ответ на стимуляцию HGF; аналогичным образом изменялся ответ и на комбинацию erocVEGF165.
Таким образом, проведенные исследования показали, что механизм увеличения продукции IL-8 эндотелиальными клетками при их стимуляции HGF может быть обусловлен стабилизацией HTF-2. Вероятными посредниками здесь выступают МАР-киназы, активация которых под влиянием этого фактора роста была показана в данной работе ранее. Влияние HGF на стабильность HIF также может быть обусловлено его выраженным стимулирующим действием на фосфорилирование Akt, которая является частью регуляторной оси Akt/mTOR, задействованной в регуляции активности многих факторов транскрипции, включая HIF [274].
При подавлении экспрессии а-субъединиц HTF не было обнаружено сколько-нибудь значимых изменений продукции IL-8 в ответ на VEGF165. Вероятнее всего, его действие на продукцию IL-8 ЭК в значительной опосредовано влиянием на NFKB, который также положительно регулирует экспрессию гена этого хемокина [356].
Хорошо известно, что IL-8 обладает собственным проангиогенным действием [320; 361] и усиление его продукции под действием VEGF165 и HGF может являться дополнительным стимулом к увеличению капилляризации ткани. Это предположение подкреплялось гистологической картиной, наблюдавшейся при анализе скелетных мышц и периинфарктной зоны миокарда. Увеличение плотности сосудов с максимальным количеством капилляров при введении комбинации генов может быть отчасти и результатом проангиогенного действия IL-8, продуцируемого эндотелием под влиянием АФР по описанному выше механизму. Таким образом, плеотропное действие АФР на продукцию хемокинов и экспрессию молекул адгезии эндотелием может быть фактором, модулирующим терапевтическую ангиогенную эффективность этих факторов при их совместном действии. Такой характер их взаимодействия должен учитываться при разработке комбинированных методов с использованием различных факторов роста или их генов для терапевтического ангиогенеза.
Суммируя полученные результаты по выяснению механизмов влияния комбинированного применения VEGF165 и HGF на ангио- и артериогенез в миокарде и скелетных мышцах, можно предложить следующую схему.
При доставке в скелетные мышцы и периинфарктную зону миокарда VEGF165 и HGF связываются со своими рецепторами на ЭК (VEGFR2 и c-met соответственно). Это приводит к активации внутриклеточных сигнальных каскадов, которые вызывают фосфорилирование МАР-киназ ERK1/2 и р38, причем при совместном действии АФР доля фосфорилированных форм этих киназ увеличивается по сравнению с одиночным АФР (рисунок 32). Активация ERK1/2 и р38 вызывает увеличение пролиферации ЭК и рост их миграционной активности, которые и приводят к аддитивному усилению капиллярогенеза, которое наблюдалось при исследовании образцов скелетных мышц и миокарда.
Кроме того, свой вклад в ангиогенные процессы может вносить и IL-8, который продуцируется ЭК по HIF-2-зависимому механизму, связанному со стабилизацией этого фактора транскрипции под действием упомянутых выше МАР-киназ. VEGF165 и HGF характеризуются аддитивным стимулирующим влиянием на активность HIF и продукцию IL-8 клетками эндотелия, что может приводить к аутокринному запуска ангиогенного ответа. Кроме того, стабилизация HIF может вызывать экспрессию целого ряда проангиогенных молекул, гены которых имеют в своем промоторе сиквенс HRE, необходимый для связывания с HIF (рисунок 34).