Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Патогенез атеросклероза 13
1.2. Роль инфекционных агентов в патогенезе атеросклероза
1.3 Характеристика 8 типов вирусов герпеса человека. 18
1.4 Герпесвирусы и атеросклероз. История вопроса .22
1.5 Вирусы герпеса человека и атеросклероз. 28
1.6 Возможные механизмы влияния вирусов герпеса человека на патогенез атеросклероза 32
ГЛАВА 2. Методы обследования и общая характеристика больных .38
2.1 Общая характеристика больных .38
2.1.1. Характеристика пациентов, умерших вследствие ОИМ и его осложнений 38
2.1.2. Характеристика пациентов, умерших вследствие некоронарогенных причин 39
2.1.3. Характеристика пациентов с распространенным атеросклерозом каротидных артерий и аорты .40
2.2. Забор и дальнейшая обработка операционного и аутопсийного материала 42
2.2.1. Методика выделения геномной ДНК из коронарных, каротидных артерий и аорты .42
2.2.2. Протокол ПЦР в реальном времени 43
2.3. Характеристика больных с различными формами ИБС и здоровых добровольцев .48
2.3.1. Методика забора крови и хранения материала 50
2.3.2. Методика выделения плазмы и
мононуклеаров периферической крови 51
2.3.3. Методика выделения ДНК
из мононуклеаров периферической крови 52
2.3.4. Методика выделенияДНК из плазмы крови 52
2.3.5. Методика мультиплексной ПЦР в реальном времени
2.4. Методика определения СРБ высокочувствительным методом 59
2.5. Статистическая обработка данных 60
Глава 3. Результаты 60
3.1 Определение герпесвирусного генома в образцах коронарных артерий пациентов, умерших вследствие ОИМ и некоронарогенных причин .60
3.1.2 Оценка встречаемости герпесвирусной инфекции в аортах в различных группах пациентов 66
3.1.3 Оценка герпесвирусной инфекции в каротидных артериях .68
3.2 Определение герпесвирусного генома в мононуклеарах периферической крови пациентов с различными формами ИБС .70
3.3 Анализ плазмы крови на наличие вирусов герпеса у пациентов с различными формами ИБС 71
3.4 Оценка взаимосвязи между ВГЧ и госпитальным исходом 74
3.5 Определение взаимосвязи между ВГЧ и маркером острой фазы воспаления вч-СРБ в плазме крови 75
3.6 Определение взаимосвязи между количеством копий ВГЧ в плазме крови и параметрами общего анализа крови 76
3.7 Определение взаимосвязи между ВГЧ и пародонтозом .78
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования .80
Заключение 88
Выводы .90
Практические рекомендации 91
Перспективы дальнейшей разработки темы 92
Список сокращений 93
Список литературы
- Роль инфекционных агентов в патогенезе атеросклероза
- Характеристика пациентов, умерших вследствие ОИМ и его осложнений
- Оценка встречаемости герпесвирусной инфекции в аортах в различных группах пациентов
- Определение взаимосвязи между ВГЧ и маркером острой фазы воспаления вч-СРБ в плазме крови
Роль инфекционных агентов в патогенезе атеросклероза
Согласно этой теории в результате контакта Т-лимфоцитов с антиген-презентирующими клетками (макрофагами, дендритными или эндотелиальными клетками) несущими антигены, ассоциированные с комплексами гистосовместимости, Т-лимфоциты активируются и могут секретировать огромные количества цитокинов, которые модулируют атерогенез . F. Crea и многими другими авторами было показано, что именно активированные лимфоциты могут играть важную роль в атерогенезе, приводя к разрыву бляшки или развитию эрозий на ее поверхности, что, в свою очередь, может служить причиной для таких осложнений атеросклероза как острый инфаркт миокарда или острое нарушение мозгового кровообращения [60-63].
К клеткам, вовлеченным в процесс атерогенеза, относятся эндотелиальные клетки, моноциты, гладкомышечные клетки и многие другие.
На начальных этапах формирования атеросклеротической бляшки важнейшую роль играет состояние клеток эндотелиального монослоя. Эндотелий – важнейший регулятор сосудистого гомеостаза, обладает вазопротекторным действием и набором таких эффектов, как вазодилатация, подавление фактора роста гладкомышечных клеток или ингибирование провоспалительного ответа иммунной системы. Оксид азота – наиболее сильный вазодилатирующий фактор, который, в частности, ингибирует окисление липопротеинов низкой плотности. Дефект его продукции приводит к развитию эндотелиальной дисфункции и является ранним проявлением начальных этапов атеросклероза, возникающим еще до появления визуально детектируемых изменений [64]. Последующее поступление липопротеинов в сосудистую стенку и их быстрая модификация приводит, в конечном итоге, к инфильтрации сосудистой стенки клетками воспаления [65]. На состояние эндотелиального монослоя влияет и ряд факторов, таких как курение, гипертензия, сахарный диабет [66]. Хотя перечисленные выше факторы, несомненно, способствуют развитию атеросклероза, у многих пациентов болезнь развивается и в отсутствие этих факторов [67]. По данным ряда ученых, начальные этапы атеросклероза являются обратимыми, то есть, окисление и другие химические модификации липопротеинов интимы служат пусковым этапом изначально обратимого процесса [18,64,68,69].
Как было показано в ряде исследований, не только дифференцировка моноцитов в макрофаги играет важную роль в атеросклерозе, также и Т-лимфоциты имеют тенденцию аккумулироваться в ранних атеросклеротических бляшках как у человека, так и у животных [51]. На последующих этапах, когда в развитие атеросклеротической бляшки оказываются вовлеченными и другие типы клеток, в том числе макрофаги, а также биологически активные вещества, процесс становится необратимым [70].
Как известно, цитокины вовлечены во многие физиологические процессы и особенно значимы в регуляции воспаления и иммунного ответа [71]. Цитокины и ряд других растворимых факторов (разнообразные эйкозаноиды и фактор активации тромбоцитов, которые могут выделять макрофаги, рекрутированные в сосудистую стенку [72] играют важнейшую роль в развитии атеросклероза на всех этапах формирования атеросклеротической бляшки. Практически все клетки, вовлеченные в процесс атеросклероза, способны их секретировать. В частности, провоспалительные и Т-хелпер1 (Th1)-ассоциированные цитокины способствуют развитию и прогрессированию атеросклеротических заболеваний, тогда как противовоспалительные цитокины, ассоциированные регуляторными Т-клетками (Treg), оказывают явное антиатерогенное действие [73]. К первым относятся интерлейкин-1 (IL-1) и фактор некроза опухолей- (TNF-), под влиянием которых происходит дифференцировка моноцитов в макрофаги и пенистые клетки [72, 74] и миграция гладкомышечных клеткок из медии в интиму. TNF- и интерферон- (IFN-) способствуют запуску механизмов гибели гладкомышечных клеток [19,75-77], что приводит к дестабилизации бляшки.
К группе антиатерогенных цитокинов относится, например, IL-33, который угнетает формирование пенистых клеток, уменьшает захват окисленных липопротеинов низкой плотности, а так же снижает содержание внутриклеточного общего и этерифицированного холестерина и повышает выведение холестерина [78].
Гладкомышечные клетки продуцируют большое количество макромолекул внеклеточного матрикса, в частности, коллаген I и III типов и протеогликаны. Волокна эластина также могут аккумулироваться в атеросклеротических бляшках. Этот процесс напоминает ангиогенез нормальных артерий. Коллаген обеспечивает биомеханическую прочность фиброзной бляшки. Разрушение межтканевого коллагена ведет к дестабилизации атероматозной бляшки. Регуляторную роль в данном случае выполняют матричные металлопротеиназы (MMP). Эти ферменты контролируют балланс между образованием и деградацией внеклеточного матрикса, который образуется гладкомышечными клетками. Растворение внеклеточного матрикса металлопротеиназами способствует миграции гладкомышечных клеток из медии в интиму. Цитокины могут регулировать активность металлопротеиназ, влияя на выделение тканевых ингибиторов металлопротеиназ [79]. Провоспалительные цитокины IL-1, TNF- и CD40L увеличивают образование фибриллярных и нефибриллярных металлопротеиназ в клетках атеромы [80,81]. IL-1 и TNF- повышают уровень плазминогена и тромбина, которые, в свою очередь, приводят к протеолитической активации проферментов металлопротеиназ (например, про-ММР-2 переходит в ММР-2), а также к уменьшению уровня тромбомодулина, который имеет обратный эффект на проферменты [82,83]. Противоположное действие оказывают IL-4 и IL-10 [84].
Характеристика пациентов, умерших вследствие ОИМ и его осложнений
Многие исследователи пытались установить связь атеросклероза с герпесвирусной инфекцией, сравнивая частоту встречаемости вирусной ДНК в атеросклеротически изменных и нормальных стенках артерий. Эти исследования проводили либо на аутопсийном материале, либо исследовались биоптаты, полученные при операции аорто-коронарного шунтирования (АКШ) или операциях по замене клапана. К сожалению, результаты этих работ противоречивы.
Еще в 1994 году Melnick и соавторы в своем исследовании при сравнении атеросклеротически измененных артерий и артерий, не вовлеченных в процесс атеросклероза, не выявили достоверных различий во встречаемости ДНК ЦМВ при исследовании образцов методом ПЦР [119]. Напротив, Shi и соавторы обнаружили, что ЦМВ также чаще выявлялся в участках с атеросклерозом по сравнению с контрольными образцами – 40% против 4%, соответственно [50]. С этими результатами согласуются данные Radke и др., которые выявили ЦМВ ДНК в 30% образцов артерий с атеросклерозом у 53 пациентов с ИБС [120]. С другой стороны, Virok D. и соавторы не выявили корреляции между наличием ДНК ЦМВ и структурой атеросклеротических бляшек в сонных артериях. ЦМВ ДНК была выявлена в половине случаев [121]. Напротив, Westphal M., Lautenschlager I. и соавторы при исследовании биоптатов из коронарных артерий и образцов крови методом ПЦР и гибридизации in situ у 68 пациентов с АКШ, выявили не только большее количество ЦМВ ДНК в артериях, но и отметили наличие достоверной положительной корреляционной связи с вч-СРБ, выработкой некоторых молекул адгезии и цитокинами (по сравнению с пациентами без ЦМВ инфекции) [122].
Для более распространенных в человеческой популяции ВГЧ 1 и 2 типов такие различия были выявлены в работе Kotronias и Kapranos. Эти авторы 4 исследовали наличие вирусной ДНК методом ПЦР с внутренними праймерами и гибридизации in situ в 70 участкax коронарных артерий различных пациентов (42 пациента умерли вследствие ОИМ, 28 – молодые жертвы фатальных травм). ВГЧ 1 типа был выявлен у 43% пациентов с ОИМ, и у 28% – в контрольной группе [123]. С этими результатами согласуются данные Shi и Tokunaga: при исследовании 33 образцов ткани аорты (10 из них с гистологическими признаками атеросклероза) методом ПЦР, ВГЧ 1 типа достоверно чаще выявлялся в группе с гистологическими признаками атеросклероза по сравнению с образцами аорты без атеросклеротических измененеий (80% против 13%) [50]. Однако, при оценке коронарных больных, Nez J. и соавторов [124] отметили низкий уровень детекции ДНК ЦМВ у больных в ранние сроки инфаркта миокарда. Данные Schlitt A. и др. также не подтвердили гипотезу о связи выявляемости вирусной ДНК ВГЧ 1 типа, ЭБВ, ЦМВ и заболеваемостью ИБС, возможно вследствие того, что в данной работе исследовали только популяцию моноцитов периферической крови [48].
Частота встречаемости герпесвирусной ДНК оценивалась не только в артериях, но и в венах, где она оказалась значительно ниже. ДНК ВГЧ 1 типа была выявлена и в образцах вен (9% против 35% в артериях) и в маммарной артерии (22%), в то время как ДНК ЦМВ и ВЭБ в венах не были найдены [125]. Аналогично Horvth R., Cern J. при исследовании венозных шунтов не выявили ДНК ВЭБ и ЦМВ. Отсутствие ЦМВ ДНК в венах подтвердили Bartels C. и соавторы [126]. В одной из немногих работ, где проводились попытки выделить ДНК ВГЧ 3 типа из церебральных артерий, ДНК данного возбудителя, а также ВГЧ 1 типа обнаружена не была [127]. Однако de Boer O.J., Teeling P. выявили ДНК ВЭБ 79% образцов тканей пациентов с симптоматическим стенозом сонных артерий [128]. В своей недавно опубликованной работе, Grose C, Adams H.P. отметили достоверное и значительное (в 4,5 раза) повышение риска развития инсульта при офтальмогерпесе. По предположению авторов, индуцированное герпесвирусом воспаление церебральных артерий может приводить к развитию окклюзии этих артерий и, вследствие этого, к инсульту [129]. Ряд исследователей пытались связать атеросклеротические измененеия с наличием ДНК других герпесвирусов, помимо 1, 2 и 5. Kaklikkaya с соавторами при исследовании аутопсийного материала (артерий с атеросклерозом IV степени и артерий без признаков атеросклероза) не обнаружили ДНК ВГЧ 7 и 8 типов, а обнаружили ДНК ВГЧ 6 типа всего в 3х случаях (2 – с атеросклерозом, 1 – контрольном) [130]. Также, по данным Ye, не обнаружено ДНК ВГЧ 8 типа в участках коронарных артерий, пораженных атеросклерозом [131]. Xenaki E. и соавторы также не выявили достоверных отличий по количеству ДНК ЦМВ в атеросклеротических бляшках и сосудах без признаков атеросклероза у пациентов при проведении АКШ [132]. В работе Maseri A. и соавт., исследовавших ВГЧ 6 и ВГЧ 8 типа, имеющих выраженный тропизм к эндотелию и лимфоцитам, было показано, что ДНК ВГЧ 8 не была обнаружена как у больных острым инфарктом миокарда, стабильной стенокардией так и у пациентов без клинических проявлений атеросклероза, в то время как ДНК ВГЧ 6 была обнаружена в значительной доле исследованных образцов (18,6%) без значимых различий между тремя группами (при инфаркте миокарда с подъемом сегмента ST в 17,2%; у пациентов со стабильной ишемической болезнью сердца в 14,3%; у пациентов без признаков атеросклероза коронарных и сонных артерий в 25%). Кроме того, авторы не выявили никаких существенных различий нагрузки ВГЧ-6 в плазме среди трех групп пациентов. Эти данные показывают, что коронарная нестабильность не связана конкретно с активностью ВГЧ 6 или ВГЧ 8 – инфекции. Тем не менее, необычно высокий уровень активности ВГЧ 6 – инфекции был зарегистрирован среди пациентов без атеросклероза, поступивших в больницу по поводу дисфункции клапанов сердца [133].
Оценка встречаемости герпесвирусной инфекции в аортах в различных группах пациентов
В дальнейшем, в первые сутки пребывания в стационаре на основании клинической картины и результатов обследования пациенты с ОКС были разделены на 3 группы: ОИМ с подъемом сегмента ST, ОИМ без подъема сегмента ST и нестабильная стенокардия. Диагноз инфаркта миокарда выставлялся на основании критериев Универсального определения Европейского Общества Кардиологов, Американского Колледжа Кардиологии, Американской Ассоциации Сердца и Всемирной Федерации Сердца 2013г. [10].
У 26 пациентов, госпитализированных в нашу клинику была диагностирована хроническая форма ИБС (ХИБС). Этот диагноз ставили на основании клинической картины и положительных результатов стресс-теста, что впоследствии был подтверждено при проведении коронарографии, эти пациенты были включены в группу «Хроническая ИБС».
Здоровые добровольцы были полностью обследованы, включая опрос, биохимический анализ крови, а также ультразвуковое исследование сердца и сонных артерий, кроме того, проводился стресс-тест. В контрольной группе не было людей с признаками атеросклероза по данным обследования.
Все участники исследования подписали информированное согласие пациента, одобренное этическим комитетом Московского медико стоматологического университета им. А.И. Евдокимова (МГМСУ).
Забор крови у пациентов с ОКС осуществляли в первые сутки пребывания в стационаре путем пункции периферической вены с использованием вакуумных пробирок с цитратом (S-monovette, Sarstedt, Germany), ЭДТА (S-monovette, Sarstedt, Germany), РНК-стабилизирующим раствором. Всем больным проводили общий и биохимический анализ крови (определение уровня КФК, КФК-МВ, холестерина и его фракций, глюкозы), а также определяли уровень Т или I-тропонина иммунохимическим методом на анализаторе Immulate 2000XPI с использованием реактивов производства фирмы «Siemens». Повышенным считался уровень Т-тропонина выше 0,1нг/мл, I-тропонина более 2,5 нг/мл. Пробирки с РНК-стабилизирующим раствором замораживали при температуре -20С и хранили при -80С до дальнейшей обработки материала.
Плазму крови отбирали и аликвотили по 1 мл после центрифугирования пробирок с периферической кровью и цитратом натрия (2500 g х 10 минут при 20oC). Образцы плазмы замораживали и хранили при -80С до дальнейшей обработки. На последующих этапах работы в образцах плазмы крови определяли ДНК герпесвирусов, цитокины и уровень С-реактивного белка высокочувствительным способом. После отбора плазмы из пробирок с цитратом натрия собирали полученное на разделе двух фаз так называемое «лимфоцитарное кольцо», содержащее мононуклеары периферической крови. К нему добавляли лизирующий буфер для эритроцитов (Biolegend, SanDiego, CA), ресуспендировали в нем, проводили инкубацию в течение 10-15 минут при Ткомн, после чего два раза выполняли процедуру отмывки, состоящую из центрифугирования (400g х 5 минут при 20o С) и ресуспензирования образца в PBS (фосфатно-солевом буфере) (Gibko, USA). В последующем образцы замораживали и хранили при -80о С до момента выделения ДНК. 2.3.3. Методика выделения ДНК из мононуклеаров периферической крови
Образцы крови размораживали на водяной бане при температуре 37С, Выделение ДНК продолжали, учитывая лизис эритроцитов, проведенный перед заморозкой, согласно бесколоночному протоколу с использованием кита для выделения полноразмерной геномной ДНК Gentra Puregene Blood Kit (Qiagen, Germany). По протоколу выделенную ДНК растворяли в TE буфере или DNA Hydration Solution в течение 8 часов в термошейкере Eppendorf при комнатной температуре до полного растворения. Количество и чистота выделенной геномной ДНК оценивались с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA), чистоту оценивали по соотношению поглощения света при длинах волн 260/280 нм и 230/260 нм.
Для выделения ДНК из плазмы крови пациентов с ОКС проводили разморозку образцов плазмы крови при комнатной температуре в течение 15 минут. В дальнейшем, выделение ДНК производили по стандартному протоколу (с использованием колонок) Spin Protocol DNA Purification from Blood and Body Fluids и реактивов QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Germany). В конце протокола ДНК элюировали с колонок с помощью АЕ буфера в объеме 60 мкл. Аналогично предыдущему протоколу выделения, ДНК в выделенных образцах из плазмы оценивали с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA), чистоту оценивали по соотношению поглощения света при длинах волн 260/280 нм и 230/260 нм.
Определение взаимосвязи между ВГЧ и маркером острой фазы воспаления вч-СРБ в плазме крови
По нашим данным, в различных участках коронарных артерий пациентов, умерших вследствие ОИМ и его осложнений, выявляются все 8 типов ВГЧ с одинаковой частотой встречаемости вне зависимости от характера атеросклеротического поражения коронарных артерий. Однако, в целом ряде экспериментальных работ по заражению эндотелия в участках атеросклеротически измененных сосудов показано, что заражение ВГЧ 1 и 2 типов может быть ассоциировано с дальнейшим развитием и прогрессированием атеросклероза [210], в том числе отмечалось изменение характера обмена веществ в инфицированных участках сосудов [211], а также отложение в них иммунных комплексов [212]. В исследовании Epstein и соавторов в 1996 году была выявлена взаимосвязь между исходно повышенным титром антител к ЦМВ и частотой развития рестенозов в течение 6 месяцев после прямой коронарной атерэктомии (по данным ангиографии) у 75 последовательно набранных пациентов с симптоматической ИБС [190, 213]. Melnick и соавторы впервые показали, что ДНК ЦМВ содержится в стенках артерий пациентов с атеросклерозом. Концентрация вирусной ДНК была выше в артериальной стенке пациентов, перенесших реконструктивные сосудистые операции (аортокоронарное шунтирование), по сравнению с пациентами с ранним атеросклерозом. Позднее еще в нескольких работах находили ЦМВ в атеросклеротических бляшках [114]. Нашей группой также проводилось исследование пациентов, умерших вследствие острого инфаркта и его осложнений, однако достоверных отличий при сравнении количества копий ЦМВ в поврежденных атеросклеротических бляшках достоверно не отличалось от количества копий данного возбудителя в неповрежденных атеросклеротических бляшках и коронарных артериях без макроскопических признаков атеросклероза.
Многие герпесвирусы персистируют у пациентов с иммунодефицитом, как например, ВГЧ 8 типа. Вирус наиболее хорошо изучен у пациентов с саркомой Капоши, которая, как известно возникает лишь при тяжелом иммунодефиците [215, 216]. Ряд исследователей считают ВГЧ 8 типа ассоциированным с этим заболеванием [191]. Однако работ, посвященных исследованию ВГЧ 6, 7 и 8 типов у пациентов с ишемической болезнью сердца и острым инфарктом миокарда практически нет. В 1997 году Ye D., Nichols T.C. и соавторы предположили, что ВГЧ 8 типа может вносить свой вклад в патогенез атеросклероза, однако при исследовании эндотелия коронарных артерий и веретенообразных клеток саркомы Капоши у 38 пациентов ВГЧ 8 типа выявлен не был [131]. По данным Kaklikkaya I, Kaklikkaya N, исследовавших различные сосуды на наличие герпесвирусной ДНК у 28 пациентов с макроскопически выраженным атеросклерозом (IV степени) и у 25 пациентов без него, ДНК ВГЧ 6 типа была выявлена в 3-х случаях (один из которых – контроль), ДНК ВГЧ 7 и 8 типа обнаружена не была [130]. Интересно, что нами была выявлена ДНК ВГЧ 8 типа в коронарных артериях пациентов, умерших вследствие ОИМ вне зависимости от характера атеросклеротического поражения сосудов, хотя мы не включали в исследование пациентов с доказанным иммунодефицитом. Мы также выявили ВГЧ 6 и 7 типов в участках коронарных артерий пациентов умерших вследствие ОИМ и пациентов, умерших вследствие некоронарогенных причин. Таким образом, учитывая, что нами не было выявлено достоверных отличий ВГЧ в сосудах с различными проявлениями атеросклероза, нами было принято решение о проведении исследования периферических клеток крови, т.к. по ряду данных, герпесвирусная инфекция, выявляемая в мононуклеарах периферической крови может ассоциироваться с ИБС и ее различными проявлениями [216].
В нескольких работах, в которых проводилось исследование герпес-вирусов методом ПЦР РВ в крови, определение проводили в мононуклеарах . Так, в работе M.Smieja с соавторами ЦМВ был выявлен у 17.3% пациентов, которым проводилась коронарография, однако ассоциации с характером поражения коронарных артерий и необходимостью последующего вмешательства на коронарных артериях получено не было. После процедуры уровень ЦМВ не повышался [217]. По ряду данных, ЦМВ редко встречается в мононуклеарах периферической крови, и его выявление не свидетельствует о наличии активной инфекции [218-220].
Нашей группой было получено, что все 8 типов ВГЧ встречаются в мононуклеарах периферической крови одинаково часто у пациентов с ОКС, ХИБС и у здоровых добровольцев.
Таким образом, следующим этапом нашей работы стала оценка встречаемости и копий герпесвирусного генома в плазме крови пациентов с ОКС, ХИБС и здоровых добровольцев. Мы впервые показали, что частота встречаемости и количество копий ЦМВ в плазме больных острыми формами ИБС достоверно больше, чем у здоровых. Различий между хроническим формами ИБС и контрольной группой не было обнаружено. Как недавно было показано, появление вируса в плазме говорит о его репликации [200,221-225]. Таким образом, можно предположить, что ЦМВ активно реплицируется у пациентов с ОКС. Возможно, активация ЦМВ инфекции вносит вклад в дестабилизацию атеросклеротических бляшек, что в свою очередь приводит к развитию ОКС. Частота встречаемости ЦМВ в плазме крови у здоровых добровольцев, по нашим данным составила 46%, что хорошо согласуется с данными эпидемиологических исследований, где, по разным данным, серопозитивность ЦМВ варьирует от 50 до 85% в различных группах населения США [226, 227]. Кроме того, недавнее эпидемиологическое исследование показало связь между смертностью вследствие сердечно-сосудистых заболеваний и титрами антител к ЦМВ [41]. Однако, результаты сероэпидемиологических исследований нельзя назвать однозначными. Например, в проспективном контролируемом исследовании типа случай-контроль Ridker Р.M. и соавторы не выявили взаимосвязи между наличием антител к ЦМВ и риском атеротромботических событий, но следует отметить, что при этом отдельно не оценивалась величина титра антител [228]. С другой стороны, исследование ARIC, наоборот, показало, что титр антител к ЦМВ связан с увеличением толщины интима-медиа [94]. Аналогичные наблюдения были получены и другими авторами: риски сердечно сосудистых заболеваний увеличивались по мере увеличения титра антител к ЦМВ [229]. Попытка связать наличие патогенной нагрузки (оценивалась серопозитивность к Chlamidia pneumonia, ВГЧ 1 типа, ЦМВ, H. pylori и вирус гепатита А) с высоким кальциевым индексом у пациентов не увенчалась успехом: ни один из 5 патогенов не ассоциировался с увеличением кальциевого индекса [230].