Содержание к диссертации
Стр.
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ КОНСТ- 14
РУИРОВАНИЯ ЧУМНОЙ ВАКЦИНЫ
Традиционные вакцинные препараты и перспективы их совер- 14 шенствования
Средства индукции неспецифического иммунного ответа 25
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 39
Экспериментальные животные 39
Штаммы бактерий 40
Питательные среды 41
Получение макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов 41
Получение резидентных перитонеальных макрофагов 41
Получение полиморфноядерных лейкоцитов 42
Определение фагоцитарной активности макрофагов 42
Определение метаболитов кислорода в фагоцитах 44
Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 45
Определение активности НАДФ-Н-оксидазы 45
Определение активности миелопероксидазы 46
Определение содержания неферментных катионных белков... 46
Определение активности NO-синтазы 46
Определение активности супероксиддисмутазы 47
Определение цитокинпродуцирующей активности 48
Гистологические методы исследования 49
Статистические методы 50
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 3. ДЕЙСТВИЕ ИАНОБИОКОМПОЗИТОВ НА ОСНОВЕ АРАБИНОГАЛАКТАНА НА НЕСПЕЦИФИЧЕСКУЮ РЕЗИСТЕНТ-
НОСТЬ ОРГАНИЗМА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЖИВОТНОГО.... 51
Фагоцитарная активность и завершенность фагоцитоза 52
Бактерицидные системы фагоцитов при взаимодействии с на- „ нобиокомпозитами на основе арабиногалактана
Кислородзависимыйметаболизм фагоцитов 53
Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФ-Н- _. оксидазы
Активность супероксиддисмутазы 55
Синтез монооксида азота фагоцитами морской свинки 56
Активность миелопероксидазы 57
Содержание неферментных катионных белков 58
Влияние арабиногалактана, феррогала и кобальтсодероіса-щего производного арабиногалактана на продукцию ИЛ-1, ИЛ-б, _„
ФНО-а
ГЛАВА 4 ИЗМЕНЕНИЯ В ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ОРГАНАХ
ЖИВОТНЫХ В ДИНАМИКЕ ВАКЦИНАЛЬНОГО ПРОЦЕССА, ВЫ
ЗВАННОГО Y. PESTIS EV С ИММУНОМОДУЛЯТОРАМИ
Изменения в иммунокомпетентных органах эксперименталь- ,_ ных животных, привитых Y. pestis EV
Влияние арабиногалактана, феррогала и кобальтсодержащего нанокомпозита на иммунокомпетентные органы экспериментальных „<.
животных
4.3 Морфологические изменения в иммунокомпетентных органах
экспериментальных животных после введения Y pestis EV с иммуно- 8fi
модуляторами
4.3.1 Изменения в тимусе животных после введения Y. pestis EV с 0,.
. ' ^86
иммуномодуляторами
Морфологические изменения в лимфатических узлах жи- Q9 вотных после введения Y. pestis EV с иммуномодуляторами
Морфологические изменения в селезенке животных после Q„
введения Y. pestis EV с иммуномодуляторами
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 107
ВЫВОДЫ 134
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 135
АГ АГПР АФК АёАГ
Г6ФДГ
ДМСО
ИЗФ ИЛ-1, -6 ИФН-у KB КЗ
кДа КОЕ КП КСНК
Л ЛБ
ЛД50
м.м.
НАДФ
НАД-Н
НСТ- тест
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
арабиногалактан
асиалогликопротеиновый рецептор
активные формы кислорода
серебросодержащий нанобиокомпозит на основе ара-биногалактана
бластные формы клеток
белая пульпа
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
глобулинпродуцирующие клетки
дезоксирибонуклеиновая кислота
диметилсульфоксид
додецилсульфат натрия
забуференный 0,9 % раствор хлористого натрия рН7,2
доза антигена, вызывающая защитный эффект у 50 % животных
индекс завершенности фагоцитоза
интерлейкины-1, -6
интерферон гамма
корковое вещество
краевая зона
кислородзависимый метаболизм
килодальтон
колонии образующие единицы
красная пульпа
кобальтсодержащий нанобиокомпозит на основе ара-биногалактана
корона узелка
лимфоцит
лимфобласт
доза испытуемого агента, вызывающая гибель 50 % взятых в опыт животных
липополисахарид
мозговое вещество
мегодальтон
мантийная зона
микромоль
малые лимфоциты
молекулярная масса
миелопероксидаза
макрофаг
никотинамидадениндинуклеотид фосфат
никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
тест с нитросиним тетразолием
Введение к работе
Актуальность исследования
Чума нанесла неисчислимые жертвы человечеству исторически и продолжает оставаться серьезной угрозой для здоровья населения не только в природных очагах этой инфекции, но и за пределами энзоотичной территории вследствие возможности выноса возбудителя. Увеличение миграции населения, коммерческий туризм, военные конфликты усиливают не только потенциальную, но и реальную опасность завоза этой инфекции в любую страну мира.
В последние годы возбудитель чумы привлекает внимание с точки зрения наиболее вероятного агента биотерроризма [61].
Несмотря.на большие достижения в борьбе с чумой, связанные с использованием антибактериальных препаратов, контролем за носителями и переносчиками чумного микроба в природных очагах, нет уверенности в том, что эпидемии чумы не будут повторяться. Поэтому проблема специ-фической профилактики чумы по-прежнему актуальна. Как и раньше, нет единого мнения о преимуществах тех или иных вакцин, методах учета эффективности прививок и способах проведения иммунизации [27, 28, 31, 56, 85]. .
Современная стратегия иммунопрофилактики чумы во многом определяется поиском средств, способных потенциировать иммунные реакции макроорганизма в ответ на введение иммуногенного препарата, повышая, таким образом, эффективность-вакцины при одновременном снижении ее иммунизирующей дозы и уменьшении побочного действия [14, 28, 34, 56, 68].
Приоритетными являются исследования, направленные на создание средств «неспецифической защиты», в частности, путем стимуляции системы врожденного иммунитета, а также разработки алгоритмов на инфицирование патогеном, независимо от вида возбудителя*[34, 35, 36].
Для стимуляции неспецифической резистентности организма большое
7 внимание уделяется полисахаридам растительного происхождения, обладающим широким спектром действия и лишенным ряда недостатков, присущих искусственно синтезированным химическим веществам. Из новых природных соединений можно назвать полисахарид, полученный из клеточных стенок древесины лиственницы - арабиногалактан, обладающий иммуномодулирующим действием, способный вступать в реакции с различными функциональными реагентами, образовывать с ними конъюгаты, уменьшать интенсивность свободно-радикальных процессов, активировать фагоцитоз [62, 28, 54, 137 и др.].
Одним из актуальных направлений для создания новых наноматериа-лов (содержащих биогенные металлы и микроэлементы) с заданными биологическими свойствами [23, 58, 72] является использование в качестве биоактивной полисахаридной оболочки макромолекулы арабиногалактана. В связи с тем, что наличие того или иного металла в клетке имеет важное значение для ее жизнедеятельности, изучение характера воздействия ме-таллосодержащих нанобиокомпозитов на основе арабиногалактана (ферро-гал, кобальт- и серебросодержащий нанокомпозиты) на неспецифическую резистентность организма экспериментальных животных перспективно.
Создание новых и усовершенствование уже имеющихся вакцин тесно связано с поиском адекватных методических приемов оценки реакций макроорганизма на эти препараты и эффективности защиты от чумы после иммунизации ими. В этой связи морфологическая характеристика изменений иммунокомпетентных органов, обусловленных вакцинацией, занимает важное место в системе контроля препаратов специфической профилактики инфекционных заболеваний [39, 87].
Использование морфометрического метода для изучения морфологических изменений, происходящих в иммунной системе организма, перспективно и позволяет количественно характеризовать состояние клеточных популяций и взаимоотношения отдельных органных структур [87].
Участие центральных и периферических органов иммунной системы в
8 реализации иммунных реакций и особенности течения вакцинального процесса, вызванного сочетанным применением живой чумной вакцины и им-муномодуляторов природного происхождения, до настоящего времени мало исследованы. В связи с чем, изучение морфофункционального состояния иммунокомпетентных органов, а также их клеточного состава, весьма актуально и может служить прогностическим критерием действия иммунобиологических препаратов на макроорганизм.
Цель работы — выявить закономерности формирования иммунного ответа макроорганизма на введение Yersinia pestis EV НИИЭГ в сочетании с металлосодержащими нанобиокомпозитами на основе арабиногалактана.
Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие основные задачи:
Исследовать характер воздействия металлосодержащих нанобио-композитов на основе арабиногалактана на неспецифическую резистентность организма экспериментальных животных.
Оценить структурную перестройку иммунокомпетентных органов экспериментальных животных, привитых Y. pestis EV НИИЭГ.
3. Выявить изменения в иммунокомпетентных органах эксперимен
тальных животных в динамике вакцинального процесса, вызванного
Y. pestis EV НИИЭГ в сочетании с металлосодержащими нанобиокомпо
зитами на основе арабиногалактана.
Научная новизна
Впервые для усиления иммунного ответа на введение Y. pestis EV испытаны железо- (феррогал), кобальт- (КСНК) и серебросодержащий нано-биокомпозиты (AgAT) на основе арабиногалактана. Показано, что эти на-нобиокомпозиты in vitro стимулируют кислородзависимые, нитроксидза-висимые и кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов, способствующие захвату и внутриклеточной деградации микроба путем одновременной активации.
Впервые результаты сравнительного исследования позволили установить ряд важнейших параметров морфологических изменений в иммуно-компетентных органах экспериментальных животных в динамике вакцинального процесса, вызванного Y pestis EV и Y. pestis EV в сочетании с ме-таллосодержащими нанобиокомпозитами на основе арабиногалактана.
Приоритетными являются данные о том, что арабиногалактан, ферро-гал и КСНК способствуют усилению иммунного ответа макроорганизма на введение Y. pestis EV в сочетании с иммуномодуляторами, повышая тем самым резистентность организма к возбудителю чумы.
Теоретическое и практическое значение работы
Получены новые данные о морфологических изменениях в иммуно-компетентных органах экспериментальных животных, привитых Y. pestis EV, которые дополняют теоретические знания и определяют направления изысканий в области изучения механизмов формирования резистентности макроорганизма к чумному микробу.
Патогенетически обоснована возможность тестирования показателей клеточного состава центральных и периферических органов иммунной системы экспериментальных животных в динамике вакцинального процесса, вызванного Y. pestis EV в сочетании с иммуномодуляторами для оценки иммунной перестройки организма в процессе формирования иммунитета к чуме.
Экспериментально показано, что биоактивная полисахар и дная оболочка макромолекулы арабиногалактана может быть использована для создания новых наноматериалов, способных повышать неспецифическую резистентность организма.
Материалы исследований, представленные в диссертации, использованы при составлении методических рекомендаций:
«Использование показателей NO-синтазной активности макрофагов для оценки иммунной перестройки организма» (Иркутск, 2003);
10 «Использование показателей клеточного состава иммунокомпетент-
ных органов экспериментальных животных для оценки иммунной перестройки организма в процессе формирования иммунитета к чуме» (Иркутск, 2007).
«Определение функциональной способности фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма» (Иркутск, 2008).
По результатам работы оформлено два рационализаторских предложения (Иркутск, 2004).
Разработанные методы внедрены в практику научно-исследовательской работы Иркутского противочумного института, Улан-Удэнс-кого института общей и экспериментальной биологии СО РАН, Новосибирского ГНЦВБ «Вектор», Новороссийской противочумной станции.
Материалы исследований включены в лекционные курсы дополнительного послевузовского образования при Иркутском научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока.
Положения исследования, выносимые на защиту
1. Фагоциты, стимулированные металлосодержащими нанобиокомпо-
зитами на основе арабиногалактана (феррогал, КСНК, AgAT), продуциру
ют медиаторы воспаления (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6), индуцирующие запуск
каскада иммунных реакций и активацию систем, способствующих захвату
и внутриклеточной деградации чумного микроба путем стимуляции кисло-
родзависимых, нитроксидзависимых и кислороднезависимых бактерицид
ных факторов.
2. Применение металлосодержащих нанобиокомпозитов на основе
арабиногалактана в условиях иммунизации Y. pestis EV активизирует им
мунологическую перестройку в тимусе, селезенке и лимфатических узлах
животных, которая выражается гиперпластическими процессами (измене
ние соотношений структурных зон, клеточного состава за счет увеличения
количества бластных форм клеток, плазмоцитов и стромальных элементов).
Апробация работы
Материалы, изложенные в диссертации, представлены и обсуждены на:
Международных научных конференциях: «Природно-очаговые инфекции» (Улан-Батор, 2003); «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2004); «Современная ситуация по наиболее часто встречающимся инфекционным болезням» (Улан-Батор, 2006);
Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 2003);
VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств — участников Содружества Независимых Государств: проблемы безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005);
Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007);
Второй научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями» (Санкт-Петербург, 2006);
Всероссийских научных конференциях: «Медицинская микробиология — XXI век» (Саратов, 2004); «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004);
Российском медицинском форуме — 2006 «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006);
Межрегиональной конференции, посвященной 100-летию академика АМН СССР СП. Карпова (Томск, 2003);
Научно-практических конференциях «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007); «Нанотехнологии и наноматериалы для биологии и медицины» (Новосибирск, 2007);
Конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2008», (Санкт-Петербург, 2008);
Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Человек: здоровье и экология» (Иркутск, 2008);
Научных конференциях Иркутского противочумного института (Иркутск, 2002-2008).
Диссертация оформлена на основе материалов двух плановых тем НИР с № ГР 01.20.0013859 и № ГР 01.20.0013858 (2000-2008 гг.).
Публикации: По теме диссертации опубликованы 24 научные работы, в том числе 5 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 3 — в иностранных журналах, одна монография «Структура и иммуномодули-рующее действие арабиногалактана лиственницы сибирской и его метал-л опроизво дных».
Личный вклад соискателя. Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 158 страницах машинописного текста, иллюстрирована 42 таб-
13 лицами и 25 рисунками. Список литературных источников содержит 232
наименований, в том числе 137 — зарубежных.
