Введение к работе
Актуальность проблемы, Предлагаемая диссертационная работа посвящена путям сопряжения электродных и ферментативных реакций. Под термином "сопряжение" автор подразумевает, что электрохимическая реакция протекает в ответ на акт биологического узнавания, в качестве которого в данной работе рассматривается ферментативная реакция. Согласно общепринятой классификации ферментные электроды делятся на три группы. Активный центр фермента может обмениваться электронами напрямую с материалом электрода, как это происходит в ферментных электродах, относимых к третьему поколению. Ферментные электроды второго поколения основаны на использовании для этой цели диффузионно подвижных или иммобилизованных медиаторов. До сего времени не потеряло актуальность совершенствование биосенсоров первого поколения, функционирующих по принципу окисления-восстановления сопряженных субстрата или продукта ферментативной реакции. В предлагаемой работе будут рассматриваться все три типа ферментных электродов.
В настоящее время требования клинической диагностики, охраны окружающей среды и различных областей промышленности обусловливают поиск дешевых, специфичных и экспрессных методов анализа. Электрохимические биосенсоры удовлетворяют этим требованиям как нельзя лучше. Простота регистрирующего устройства и специфичность биологического узнавания, помноженная на высокие скорости катализа, обеспечивают биологическим датчикам приоритет в биоаналитической химии. Недаром уже через несколько лет после открытия первого биосенсора, он был принят к серийному производству компанией Yellow Springs Instruments. Успех другого биосенсора, персонального глюкозного детектора, можно проиллюстрировать следующими цифрами: производство, начавшееся скромной фирмой в 1987 году, всего через семь лет достигло оборота в пол-миллиарда долларов США в год.
Не удивительно, что и в предлагаемой работе основное внимание уделяется электроаналитическим устройствам на основе ферментов. Постановка некоторых задач собственно и возникла из необходимости совершенствования существующих биосенсоров.
С практической точки зрения важно отметить применение ферментных электродов также для разработки топливных элементов и систем биоспецифического электросинтеза. И, если задача создания биотопливных элементов в течение последних десяти лет несколько утратила свою актуальность, сместившись географически в страны Ближнє- и Юго-Восточной Азии, то проблемы биоэлектросинтеза еще предстоит решать, возможно, в недалеком будущем. С точки зрения технологии будущего системы сопряжения электродных и ферментативных реакций могут найти неожиданное применение в качестве устройств ввода-вывода информации в биологических компьютерах.
Как представлялось при формулировке задачи, подобное исследование должно быть
посвящено применению знаний, накопленных современной электрохимией, для целей биоэлектрокатализа. Однако условия функционирования биологических катализаторов диктуют свои требования к свойствам модифицированных электродов. Таким образом, при выполнении данной работы автору приходилось решать собственно электрохимические задачи. В качестве наиболее ярких примеров можно привести пролонгирование редокс активности полианилина в область физиологических рН и исследование новой группы электрохимически активных полимеров, получаемых электрополимеризацией редокс индикаторов азинового ряда.
Целью работы явился поиск новых путей сопряжения ферментативных и электрохимических реакций для разработки ферментных электродов первого, второго и третьего поколений с использованием полимерных полупроводниковых пленок и неорганических поликристаллов. Разработка ферментных электродов планировалась, в основном, из соображений создания новых, более совершенных электроаналитических систем.
Научная новизна. Предлагаемая диссертационная работа охватывает все существующие типы сопряжения электродных и ферментативных реакций. Начинаясь с явления прямого биоэлектрокатализа, исследование затем переходит в области применения проводящих полимеров и неорганических поликристаллов для создания ферментных электродов первого и второго поколений.
В диссертационной работе заложены основы нескольких научных направлений. Явление биоэлектрокатализа гидрогеназами легло в основу многочисленных работ в этой области. Пожалуй, до сих пор оригинальным является сравнение механизмов действия фермента в гомогенном и электрохимическом режимах. Предложенный молекулярный механизм действия гидрогеназ позволил автору сформулировать гипотезу о включении ферментов в прямой биоэлектрокатализ по механизму непосредственного обмена электронами между активным центром фермента и электродом.
Независимой областью явилось изучение электрополимеризации красителей азинового ряда, являющихся медиаторами биоэлектрохимических реакций. Исследование структуры новой группы полимеров и оптимизация условий их электросинтеза вылились в самостоятельное научное направление. Полученные полимеры сохраняли свойства исходных мономеров, являясь формой иммобилизации медиаторов на электродах, и в то же время проявляли новые нетрадиционные свойства. В частности, полимерные азины оказались эффективными электрокатализаторами регенерации кофакторов, что обусловило возможность создания дегидрогеназных электродов на их основе.
Принципиальным для фундаментальной и прикладной электрохимии проводящих полимеров явился синтез самодопированного полианилина, электрохимически активного в нейтральных и щелочных водных растворах. На примере самодопированного полимера удалось проследить свойства полианилина при высоких значениях рН. При переходе из
Было предложено создание потенциометрических биосенсоров на основе юлианилина. Кроме технологических преимуществ использования проводящего полимера з качестве чувствительного элемента, полученные биосенсоры обладали гораздо более зысокой чувствительностью по сравнению с известными системами.
В предлагаемой работе содержится приоритет использования неорганических
юликристаллов Берлинской Лазури для целей биосенсоров. Удалось синтезировать
шектрокатализатор селективного восстановления пероксида водорода, нечувствительный
: кислороду в широкой области потенциалов. Это позволило решить извечную проблему
імперометрических биосенсоров - мешающего влияния восстановителей. 4
Наконец, к несомненным успешным результатам, достигнутым в данной работе, іледует отнести и оптимизацию иммобилизации ферментов на поверхности модифици-юванных электродов. Предложенный способ формирования ферментсодержащих лембран позволил существенно увеличить стабильность биологических катализаторов.
Практическая ценность состоит прежде всего в создании новых типов ферментных ілектродов, пригодных для разнообразных приложений.
Ферментные электроды первого поколения на основе Берлинской Лазури азработаны для применения в электроаналитических системах. Замена платины на лектрод, модифицированный неорганическим поликристаллом, не только понижает тоимость биосенсора. За счет высокой сорбционной активности катализаторы на основе юталлов платиновой группы способны отравляться большим числом низкомолекулярных оединений, включая тиолы, сульфиды и др., что не свойственно злектрокатализаторам а основе Берлинской Лазури. За счет полислойной структуры последних на модифициро-анных электродах удается добиться наивысших плотностей токов восстановления перок-ида водорода в сравнении с известными электрокаталитическими системами. На приме-е глюкозного биосенсора на основе Берлинской Лазури продемонстрированы высокие увствительность и селективность датчиков, удовлетворяющие требованиям неинвазив-ой диагностики.
Синтез на основе Берлинской Лазури электрокатализатора восстановления перок-ида водорода, нечувствительного к кислороду, позволяет существенно снизить потен-иал индикаторного электрода, что делает отклик датчика независящим от присутствия осстановителей типа аскорбата и парацетамола и таким образом позволяет решить аиболее важную проблему амперометрических биосенсоров на основе оксидаз. При-івнение разработанного электрода в качестве детектора в проточно-инжекционной /істеме повышает экспрессность анализа. Кроме продемонстрированных анализа глю-
4 козы и этанола, подобный биосенсор можно изготовить для анализа любого вещества при наличии соответствующей оксидазы. Из практически важных веществ, анализ которых может быть произведен таким образом, следует отметить холестерин, глицерин, аминокислоты, галактозу. Областями применения биосенсоров на основе Берлинской Лазури является клиническая диагностика и некоторые области пищевой промышленности.
Важным практическим результатом является разработка потенциометрических биосенсоров на основе полианилина. Применение последнего в качестве рН трансдью-сера позволяет повысить чувствительность биосенсоров. Глюкозный ферментный электрод на основе полианилина обладал в три - четыре раза более высоким откликом по сравнению с глкжозочувствительным полевым транзистором. Предел обнаружения фосфорор-ганических веществ биосенсором на основе полианилина составил 10-7 м, что ниже, чем для известных потенциометрических систем (10/5 * 10_6 М). Потенциометрические биосенсоры на основе полианилина могут применяться в клинической диагностике для анализа той же глюкозы, а также связанного холестерина, триацилглицеридов и пр. Представляется возможность использования потенциометрических биосенсоров на основе полианилина для охраны окружающей среды.
Создание дегидрогеназных электродов открывает большие возможности для электроаналитических целей, поскольку ферменты этой группы насчитывают более 500 наименований и катализируют превращение самых разнообразных веществ. Электрополимеризация представляет собой способ иммобилизации на электроде медиаторов, используемых в биоэлектрокаталитических реакциях. Полученные модифицированные электроды являются более эффективными электрокатализаторами и проявляют в десятки раз более высокую операционную стабильность. Применение полимерных азинов позволяет создавать биосенсоры как на окисляющие, так и на восстанавливающие субстраты дегидрогеназ, поскольку электрохимическая регенерация кофактора NAD+/NADH может быть проведена в любом направлении. Наряду с кофактор-зависимыми, разработаны короткоживущие безреагентные биосенсоры на основе дегидрогеназ.
Дегидрогеназные электроды наряду с безреагентным водородным ферментным электродом могут применяться и для целей создания биотопливных элементов.
Практическую ценность имеет способ иммобилизации ферментов в водонераство-римые полиэлектролиты из водно-спиртовых смесей с высоким содержанием органического растворителя. Ферментсодержащие мембраны Nation обладают высокой стабильностью и хорошей адгезией к поверхности модифицированных электродов. Кроме того, такие мембраны являются биосовместимыми.
Наконец, разработанные модифицированные электроды на основе самодопиро-ванного полианилина, полимерных азинов, Берлинской Лазури и пленок, требующих анодного и катодного инициирования, могут найти применение наряду с биотехнологи-
5 ческой и в других областях электрохимии.
Методы исследования. В работе использованы электрохимические и кинетические методы в режимах, обеспечивающих максимальную информативность. При кинетических исследованиях концентрация субстрата или продукта ферментативной реакции контролировалась спектрофотометрически либо полярографически. Кинетический анализ проводился с использованием как начальных скоростей реакций, так и полной кинетической фивой. Для упрощения кинетического анализа была предложена обобщенная форма записи уравнения скорости неразветвленных каталитических реакций в стационарном режиме. Электрохимические исследования основывались на методах стационарных поляризационных кривых и циклической вольтамперометрии. Использовался также метод элект-эохимического импеданса. Электрополимеризация и электроосаждение проводились в тотенциодинамическом и потенциостатическом режимах. Для изучения электрохими-іеской кинетики потребовалось применение метода вращающегося дискового электрода. эазработанные химические и биологические сенсоры исследовались в режимах шперометрии при постоянном потенциале индикаторного электрода и потенциометрии. тля анализа структуры полимерных азинов применялись методы спектроэлектрохимии и шфракрасной спектроскопии. С целью повышения экспрессности анализа была собрана іроточно-инжекционная установка с электрохимической ячейкой типа wall-jet, обеспе-іивающей выгодный гидродинамический режим индикаторного электрода.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на российских и международных конференциях: Международном Симпозиуме по молекулярной биологии идрогеназ (Сегед, 1985), III Всесоюзной конференции "Химические сенсоры" (Ленинград, 989), Международном Симпозиуме по биоаналитическим методам (Прага, 1990), Ісесоюзном Конгрессе "Сенсоры и Преобразователи информации" (Ялта, 1991), Международной конференции "Биотехнология в Великобритании" (Лидс, 1991), Российско-ерманских совещаниях по биосенсорам (Москва, 1992, Мюнстер, 1993), VII Всесоюзном импозиуме по инженерной энзимологии (Москва, 1992), Международной научной школе о биосенсорным материалам (Пущино, 1994), семинаре по электрохимии проводящих олимеров Института электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН (Москва, 1995), Іеждународном совещании по электрохимии электроактивных полимерных покрытий, /VEEPF'95 (Москва, 1995), IX Международной конференции "Евросенсоры и рансдьюсеры'95" (Стокгольм, 1995), III Международном совещании "Биосенсорные истемы для промышленного применения" (Лунд, 1995), Международной конференции 5иокатализ-95" (Суздаль, 1995), V Международном симпозиуме "Кинетика в чалитической химии" (Москва, 1995), на совещании электрохимических обществ ортугалии и Испании (Апгарве, 1995), на I Международном симпозиуме по биосенсорам гран тихоокеанского региона (Воллонгонг, 1995), на Международном совещании по
многофункциональным полимерам и тонким полимерным системам (Воллонгонг, 1996), на VI Международной конференции по электроанализу "ESEAC96" (Дарем, 1996).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 41 печатная работа, получено авторское свидетельство.
Структура и объем работы. Диссертационная работа представляет собой рукопись из 12 глав, введения и заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы (347 наименований). Объем диссертации составляет 383 страницы, в том числе 76 рисунков и 8 таблиц.