Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из способов выяснения
особенностей строения и функционирования белков явялется изучение закономерностей их термоинактивации. Данные по стабильности меморанно-связашых белков и, в частности рецепторов гормонов и нейромедиаторов практически отсутствуют в литературе.
Изучение закономерностей спонтанной инактивации
специфического связывания селективных лигандов с мембранными опиоидными рецепторами представляет существенный теоретический интерес с точки зрения установления механизма этого процесса и наряду с этим - особенностей регуляции связывающей активности этих рецепторов в мембране. Кроме того, нахождение способов стабилизации мембранно-связанных рецепторов in vitro открывает новые возможности для практического использования таких систем в биотехнологии.
Все это делает актуальным проведение комплексного исследования процесса инактивации связывания лигандов с опиоидными рецепторами с применением широкого спектра физико-химических методов, позволяющих установить закономерности потери связывающей активности опиоидными рецепторами.
Цель работы: Целью настоящего исследования явилось
установление физико-химических закономерностей инактивации
системы ц- и б-опиоидных рецепторов мембран головного мозга крыс при 37С, а также поиск условий их стабилизации.
Научная новизна: Впервые проведено комплексное изучение спонтанной инактивации мембранно-связанного белка - опиоидного рецептора. Определены кинетические параметры этого процесса. Установлено, что инактивация в основном обусловлена уменьшением концентрации высокоаффинных центров связывания опиоидных лигандов. Изучены рН- и температурная зависимости. Показано, что потеря связывающей активности опиоидним рецептором вызвана изменениями, происходящими в липидном бислое мембраны. Обнаружено стабилизирующее действие ненасыщенных липидшх соединений, а также ингибиторов фосфолипаз, липид-растворимого антиоксиданта и аргона на связывание опиоидных лигандов различной селективности с
мембранными препаратами. Предложен механизм их действия. Показана роль ненасыщенных липидных компонентов в модуляции активности мембранных опиоидных рецепторов. Обнаружена взаимосвязь перекисного окисления липидов (ПОЛ) и инактивации связывания опиоидных лигандов с мембранным препаратом. Показано наличие корреляции между константами скорости инактивации опиоидных рецепторов и константами скорости уменьшения вязкости липидного Оислоя в присутствии различных реагентов. Выявлены отличия в скоростях инактивации и закономерностях стабилизации связывания лигандов с рецепторами свежевыделеншх и лиофилизованных мембран головного мозга крыс. Впервые предложен механизм инактивации мембранно-связанных рецепторов - рецепторов опиоидов.
Практическая ценность работа: Предложенный в работе механизм инактивации мембранно-связанных опиоидных рецепторов определяет пути поиска закономерностей инактивации других рецепторних систем. Кроме того, найденые стабилизаторы, а также установленные закономерности липид-зависимости связывания опиоидных лигандов могут найти применение в биотехнологии при создании на основе мембранно-связанных рецепторов стабильных биосенсоров для количественного и качественного определения опиатов и опиоидных пептидов в растворах и физиологических жидкостях.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Международном Симпозиуме "Фосфолипиды и передача сигнала" (ВейсОаден, ФРГ, 1991г.) и на Всесоюзном Симпозиуме "Биохимия рецепторних систем" (Таллинн, 1990г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части и 4-х глав, в которых представлены результаты исследования и их обсуждение, выводов и списка литературы (172 наименования). Работа изложена на страницах, включает 13 таблиц и 27 рисунков.