Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важных и актуальных проблем фармакологии является создание лекарственных препаратов с повышенной адсорбцией на мембранах и проникновением внутрь клеток. Отвечающая этим требованиям системы доставки белковых и пептидных лекарственных средств обычно получают путем гидрофобизации, которая основана на взаимодействии белков и полипептидов с компонентами мембраны (фосфолипидами, жирными кислотами и т.д.) или их производными.
Данная работа посвящена разработке методов ковалентной и нековалентной гидрофобизации водорастворимых белков на примере основного панкреатического ингибитора протеиназ (BPTI) и трипсина, которые нашли широкое применение в качестве лекарственных средств.
Трипсин входит в состав лекарственных форм, улучшающих процессы пищеварения, а также для лечения бронхо-легочных и гнойно-воспалительных заболеваний, что связано с его некролитическим действием. Применение BPTI основано на его способности подавлять активность таких протеиназ как трипсин, химотрипсин, калликреин, плазмин, эластаза, что обуславливает его использование в качестве лекарственного средства при различных патологических состояниях, связанных с дисбалансом системы протеолиза.
Существенным недостатком нативного трипсина является его нестабильность по отношению к изменениям рН среды, температурным факторам, денатурирующим агентам, автолизу. Кроме того, in vivo трипсин связывается с ингибиторами крови и тканей. Это, в свою очередь, отражается на времени действия фермента и требует повторения лечебных процедур. Биодостугшость BPTI низка, в связи с тем, что ингибитор быстро выводится из организма. Для достижения необходимой концентрации требуется многократное введение высоких доз, что не всегда оправдано с медицинской и экономической точки зрения.
В связи с этим актуальным является систематическое изучение физико-химических свойств липидизированных препаратов BPTI и трипсина, их биологической активности и взаимодействия с клетками, что позволит выявить общие закономерности процессов гидрофобизации водорастворимых белков и сделать обоснованные предложения о путях повышения эффективности лекарственного воздействия данных белков.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилась разработка и оптимизация методов ковалентной и нековалентной гидрофобизации водорастворимых белков. Известно, что наиболее перспективные методы гидрофобизации — это ацилирование производными карбоновых кислот, конъюгация и комплексообразование с фосфолипидами. В зависимости от использования того или иного способа гидрофобизации можно получить препараты белков с различными характеристиками, от которых будет зависеть конечная лекарственная форма, а также способ и доза введения. Белки, содержащие радикал жирной кислоты, способны связываться с сывороточным альбумином и дольше циркулировать в кровотоке, таким образом данные препараты являются перспективными для внутривенного или внутримышечного введения. Благодаря своим мукоадгезивным свойствам, т.е. сродством к эпителиальным клеткам слизистых оболочек, ацилированные препараты белков могут быть использованы интраназально. Что касается фосфолипидов, то они являются биодеградируемой матрицей, способной к постепенному высвобождению лекарственного средства и могут быть предложены для перорального введения.
Однако при ковалентной гидрофобизации белков необходимо учитывать многочисленные факторы, влияющие на биологическую активность белка. Более того, получение модифицированных препаратов, содержащих небольшое (1-3) количество гидрофобных радикалов, представляет собой довольно сложную задачу. С другой стороны, нековалентная гидрофобизация белков позволяет, если не полностью избежать, то существенно уменьшить необратимые негативные изменения физико-химических характеристик модифицированных белков.
В связи с этим поставлены следующие основные задачи: 1) Разработка метода ацилирования BPTI производными жирных кислот, позволяющего осуществлять регуляцию числа вводимых остатков жирных кислот, и отделения полученных препаратов от нативного белка и других веществ. Исследование физико-химических свойств модифицированных препаратов BPTI и их взаимодействия с мембраной.
2) Синтез водорастворимых конъюгатов ВРТІ на основе мультиламеллярных
везикул фосфатидилэтаноламина с высоким сохранением активности белка и
выходом.
3) Нековалентная гидрофобизация водорастворимых белков - трипсина и ВРТІ
путем комплексообразования с мультиламелляриыми везикулами (МЛВ) липидов
из бобов сои. Характеристика свойств липидов (размер, структура) и свойств
белков (активность, стабильность) в полученных препаратах. Выбор оптимальных
условий образования комплексов МЛВ с указанными белками для получения
препаратов с наилучшими вышеперечисленными характеристиками.
Научная новизна. 1) Разработан метод ацилирования водорастворимых белков производными жирных кислот в системе органических растворителей, позволяющий препаративно получать препараты с регулируемым количеством вводимых жирнокислотных радикалов. На примере ВРТІ, модифицированного N-гидроксисукіпшимидньіми эфирами олеиновой и стеариновой кислот в смеси органических растворителей диметилсульфоксид-диметилформамид-диоксан-пиридин, получены препараты ингибитора, содержащие от 1 до 3 ацилированных аминогрупп. Показано, что модификация ВРТІ по одной аминогруппе с предварительной обратимой защитой активного центра практически не влияет на антитриптическую активность гидрофобизованных препаратов. С увеличением числа ацилированных аминогрупп до трех антитриптическая активность ингибитора уменьшается до 28 % от первоначальной. Увеличение гидрофобности модифицированного ингибитора относительно нативного продемонстрировано спектральным методом и распределением в системе вода-тритон Х-114. Найдено, что абсорбция гидрофобизованного ингибитора монослоем Сасо-2 клеток на один или два порядка в зависимости от препарата выше по сравнению с нативньгм.
2) Впервые изучено влияние модификации ВРТІ производными жирных кислот на специфичность белкового ингибитора. Показано, что введение цис-ненасышенных олеоильньгх радикалов в молекулу ингибитора значительно увеличивает эффективность ингибирования эластазы лейкоцитов человека (H.LE), в то время как введение насыщенных стеароильньгх радикалов приводит к полной потере антиэластазной активности при сохранении антитриптической активности.
Таким образом, перспективность использования в качестве лекарственного препарата олеоильных производных BPTI связана не только с увеличением их адсорбции на мембранах клеток, но и с увеличением сродства к такому медиатору воспалительных процессов как HLE.
3) Усовершенствован метод модификации водорастворимых белков фосфатидилэтаноламином с помощью водорастворимого карбодиимида. На примере BPTI, варьируя значение рН, соотношение реагентов и используя обратимую защиту активного центра молекулы белка циграконовым ангидридом, были получены препараты с высоким выходом и сохранением ингибирующей активности.
4) Впервые разработан метод нековалентной гидрофобизации
водорастворимых белков, основанный па явлении агрегации МЛВ и последующего их осаждения под действием белков, что позволяет получать белок-липидные комплексы, не содержащие примесей исходных не связавшихся компонентов. Для комплексов МЛВ лилидов из сои с трипсином и BPTI был определен состав, размер, структура, активность. Найдено, что в условиях, близких к физиологическим, изученные белки частично или полностью восстанавливали свою биологическую активность. Более того, было продемонстрировано, что включение трипсина в фосфолипидные агрегаты предотвращает его автолиз.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Proceed. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. (Boston, USA, 1999), Symp. on Lipid and Surfactant Dispersed Systems (Moscow, 1999), 6-я Международная конференция "Наукоемкие химические технологии" (Москва, 1999), Proceed. Int'l Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. (Las Vegas, USA, 1998), International Conference "Biocatalysis-98" (Puschino, 1998), International Symposium on Natural Origin Substances in Drug Formulation (Bejing, China, 1998), II Съезд биохимического общества РАН (Москва, 1997), IV симпозиум "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1997), IV Конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 1997), Юбилейная научная конференция МАТХТ, посвященная Преображенскому Н.А., (Москва, 1996).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; обзора литературы, посвященного основным методам ковалентной и нековалентной