Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Эстеразы крови и методы их определения 12
1.1.1. Эстеразы крови и здоровье человека 12
1.1.1.1. Ацетилхолинэстераза 12
1.1.1.2. Бутирилхолинэстераза 17
1.1.1.3. Карбоксилэстераза 20
1.1.2. Методы определения активностей эстераз крови 24
1.1.3.1. Методы определения эстераз 24
1.1.3.2. Методы определения эстераз в смеси 29
1.1.3.3. Мультисенсоры как новый подход к проведению ферментативного анализа 31
1.2. Метод послойного нанесения полиэлектролитов как перспективный подход к созданию биосенсоров 36
1.2.1. Метод послойного нанесения полиэлектролитов 36
1.2.2. Холиноксидаза и биосенсоры на ее основе 3 8
1.2.3. Тирозиназа и биосенсоры на ее основе 40
1.2.4. Тирозиназный и холиноксидазный биосенсоры, созданные в лаборатории Экобиокатализа 41
1.2.5. Полимеры в методе послойного нанесения полиэлектролитов 44
1.3. Строение, синтез и свойства полимерных звезд 51
1.3.1. Строение и синтез полимерных звезд 51
1.3.2. ATRP-полимеризация 52
1.3.3. Синтез и свойства полианионной звезды 53
1.3.4. Синтез и свойства поликатионной звезды 56
1.3.5. Моделирование поведения полимерных звезд в водных растворах 61
1.4. Алкогольоксидаза и биосенсоры на ее основе 61
1.4.1. Структура и свойства алкогольоксидазы 67
1.4.1.1. Особенности структуры алкогольоксидазы 68
1.4.1.2. Свойства алкогольоксидазы 69
1.4.2. Биосенсоры на основе алкогольоксидазы 72
1.4.2.1. Амперометрические сенсоры на основе алкогольоксидазы 73
1.4.2.2. Методы иммобилизации алкогольоксидазы при изготовлении амперометрических сенсоров 78
2. Экспериментальная часть 85
2.1. Материалы 85
2.2. Методы 86
2.2.1. Изготовление тирозиназных биосенсоров 86
2.2.2. Электромодификация графитовых электродов МпОг 87
2.2.3. Изготовление холиноксидазных биосенсоров 88
2.2.4. Приготовление образцов для АСМ 89
2.2.5. Получение АСМ-изображений 89
2.2.6. Обработка топографии поверхностей 90
2.2.7. Спектрофотометрическое определение активностей холинэстераз 90
2.2.8. Титрование активных центров холинэстераз 90
2.2.9. Электрохимический анализ фенола и холина в одпоэлектродной ячейке 93
2.2.10. Циклическая вольтамперометрия 93
2.2.11. Электрохимический анализ фенола и холина в двухэлектродной ячейке 93
2.2.12. Одновременное определение скорости ферментативного гидролиза холиновых и фениловых эфиров под действием холинэстераз 94
2.2.13. Квазиупругое динамическое светорассеяние 94
2.2.14. Определение активности тирозиназы и холиноксидазы в водных растворах 94
2.2.15. ИК-спектроскопия 95
2.2.16. Изготовление алкогольоксидазных биосенсоров ; 95
2.2.17. Определение активности алкогольоксидазных биосенсоров 96
2.2.18. Обработка результатов 96
3. Результаты и обсуждение 98
3.1. Использование электрохимических биосенсоров на основе тирозиназы и холиноксидазы для анализа эстераз в смеси 101
3.1.1. Стабилизация тирозиназных и холиноксидазных электродов, изготовленных по методу послойного нанесения полиэлектролитов 102
3.1.1.1. Стабилизация тирозиназного биосенсора, созданного по методу послойного нанесения полиэлектролитов 103
3.1.1.1. Стабилизация холиноксидазного биосенсора, созданного по методу послойного нанесения полиэлектролитов 109
3.1.2. Оптимизация условий одновременного электрохимического определения фенола и холина 112
3.1.2.1. Оптимизация рабочего потенциала холиноксидазного электрода 113
3.1.2.2. Влияние холиновьгх и фениловых эфиров на электрохимическое определение фенола и холина 114
3.1.3. Определение холинэстераз в смеси с использованием двухэлектродного электрохимического биосенсора 115
3.1.3.1. Определение коэффициентов чувствительности холинэстераз по выбранным субстратам 115
3.1.3.2. Дискриминационный анализ холинэстераз в смеси 122
3.2. Использование полиэлектролитов нелинейной архитектуры для создания электрохимических биосенсоров 126
3.2.1. Использование полиэлектролитов нелинейной архитектуры для улучшения аналитических характеристик тирозиназного и холиноксидазного биосенсоров 126
3.2.1.1. Взаимодействие тирозиназы и холиноксидазы с полиэлектролитами нелинейной архитектуры в водных растворах 126
3.2.1.2. Влияние полимерных звезд на активности тирозиназы и холиноксидазы в водных растворах 127
3.2.1.3. ИК-спектры комплексов тирозиназы и холиноксидазы с, полимерными звездами 128
3.2.1.4. Электроды, полученные на основе комплексов ферментов с полимерными звездами 130 -
3.2.1.5. Электроды различных конструкций на основе холиноксидазы и полиэлектролитов нелинейной архитектуры 132
3.2.1.6. Электроды различных конструкций на основе тирозиназы и полиэлектролитов нелинейной архитектуры 134
3.2.2. Создание алкогольоксидазного биосенсора по методу послойного нанесения полиэлектролитов 142
3.2.2.1. Включение алкогольоксидазы в состав наноструктурнрованных пленок полиэлектролитов 142
3.2.2.2. Оптимизация методики изготовления алкогольоксидазных биосенсоров 145
3.2.2.2.1. Выбор оптимальной концентрации алкогольоксидазы, используемой для создания сенсоров 146
3.2.2.2.2. Оптимизация состава биосенсоров по типу поликатиона 148
3.2.2.3. Оптимизация условий количественного определения этилового спирта 149
3.2.2.3.1. Оптимизация рН рабочего буфера 149
3.2.2.3.2. Влияние ионной силы рабочего буфера на активность сенсоров 151
3.2.2.4. Исследование операционной стабильности алкогольоксидазного биосенсора 151
3.2.2.5. Определение кинетических характеристик алкогольоксидазы, иммобилизованной по методу послойного нанесения полиэлектролитов 154
3.2.2.6. Определение аналитических характеристик алкогольоксидазного сенсора, созданного по методу послойного нанесения полиэлектролитов 156
Заключение 158
Выводы 159
Литература 161
- Тирозиназный и холиноксидазный биосенсоры, созданные в лаборатории Экобиокатализа
- Методы иммобилизации алкогольоксидазы при изготовлении амперометрических сенсоров
- Стабилизация холиноксидазного биосенсора, созданного по методу послойного нанесения полиэлектролитов
- Включение алкогольоксидазы в состав наноструктурнрованных пленок полиэлектролитов
Введение к работе
Эстеразы являются одними из ключевых ферментов крови человека, уровень их активности является исключительно важным показателем в токсикологии, фармакологии и нейробиологии. Изменение активности этих ферментов в крови приводит к развитию целого ряда функциональных нарушений организма, в том числе вызванных контактом с фосфорорганическими соединениями и карбаматами, широко использующимися в сельском хозяйстве в качестве пестицидов и инсектицидов. Для клинических исследований и ранней диагностики таких нарушений необходимо знать соотношение уровней активности этих ферментов в крови. Таким образом, акгуальной задачей является создание высокочувствительных и стабильных биоаналитических устройств, позволяющих быстро и надежно определять активности эстераз в крови человека.
Поскольку каждая из эстераз локализована преимущественно в одном компоненте крови, обычно при проведении анализа исходный препарат цельной крови подвергают фракционированию, что делает общую схему анализа довольно сложной и требует значительного времени. При этом анализ большого количества образцов представляет собой длительную и трудоемкую процедуру. Упрощение схемы определения активностей эстераз, а также существенное увеличение скорости проведения анализа может быть достигнуто, во-первых, за счет анализа активностей эстераз в препаратах цельной крови,, что исключает фракционирование, а во-вторых, за счет использования методик, позволяющих одновременно определять уровни активностей этих ферментов в образце.
На сегодняшний день в литературе имеется единственный пример разработанного1 метода одновременного определения активностей эстераз в образце цельной крови, основанного на многоступенчатой схеме флуориметрического измерения скорости гидролиза различных субстратов (ацетил-, бутирил- и пропионилтиохолинов) под действием холинэстераз [1]. Данный метод характеризуется высокой чувствительностью и высокой скоростью проведения анализа, однако тип субстратов, используемых в данном методе, ограничивается только тиохолинсодержащими соединениями, что накладывает ограничения на количество определяемых таким методом ферментов.
В настоящей работе разрабатывается подход к определению активностей эстераз в смеси, основанный на использовании электрохимического мультисенсора. Данный метод позволит проводить одновременный анализ эстераз с использованием смеси субстратов, что позволит дополнительно упростить схему анализа, снизить его стоимость, сократить время его проведения, а также увеличить его информативность вследствие возможности регистрации динамики развития электрохимического отклика. Необходимо отметить, что на сегодняшний день существует широкий спектр мультисенсорных устройств с
оптической и электрохимической регистрацией аналитического отклика, позволяющих быстро и надежно решать задачи, связанные со скринингом ферментов, их потенциальных ингибиторов, а также в ряде случаев количественно определять содержание субстратов и ингибиторов в пробе [2-6]. При этом в литературе нет ни одного примера количественного анализа ферментов с использованием мультисенсоров.
Возможность применения такого подхода для анализа эстераз в смеси в данной работе исследуется на примере определения активностей ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы с использованием холин- и фенол-содержащих субстратов и двухэлектродного сенсора, состоящего из холинового и фенольного амперометрических датчиков, ранее разработанных в нашей лаборатории с использованием метода послойного нанесения полиэлектролитов [7]. Перспективность использования данного двухэлектродного сенсора заключается в возможности дальнейшего увеличения количества сенсорных элементов, что позволит одновременно определять активности нескольких эстераз крови. Так, одной из задач данной работы является разработка алкогольоксидазного биосенсора по методу послойного нанесения полиэлектролитов, использование которого вместе с тирозиназным и холиноксидазным сенсорами дает-возможность одновременно определять активности ацетилхолинэстеразы, бутирилхолинэстеразы и карбоксилэстеразы. Следует также отметить, что метод , послойного нанесения полиэлектролитов, представляющий собой простую и эффективную технику создания многослойных ультратонких органических пленок на твердой поверхности, допускает миниатюризацию аналитических систем, что в свою 6 очередь делает возможным создание в будущем микроэлектромеханических мультисенсоров с малыми, менее 1 мкм, размерами чувствительных элементов.
Поскольку потенциальное использование электрохимического мультисенсора связано с анализом образцов цельной крови, что подразумевает сильное разбавление исследуемых проб, то очень важным аспектом этой работы являются аналитические характеристики биосенсоров, созданных по методу послойного нанесения полиэлектролитов, а именно их стабильность и чувствительность. Совсем недавно были синтезированы уникальные полимеры — полиэлектролиты нелинейной архитектуры, к которым относят полимерные звезды, молекулярные, сферические и цилиндрические щетки [8, 9]. До настоящего времени существовали определенные трудности получения полиэлектролитов нелинейной архитектуры. Полимеры такого типа с узким молекулярно-массовым распределением удалось пока синтезировать только небольшому числу научных групп в мире. Уже сейчас достаточно очевидно, что данные полимерные объекты отличаются от линейных аналогов в первую очередь большей объемной плотностью
заряда и более жесткой топологической структурой. И именно благодаря этим свойствам полиэлектролиты нелинейной архитектуры обладают значительным потенциалом при создании биосенсоров по методу послойного нанесения полиэлектролитов.
Таким образом, целью данной работы является исследование возможности применения электрохимических сенсорных систем для одновременного определения активностей эстераз в смеси, а также исследование возможности улучшения аналитических характеристик биосенсоров на основе тирозиназы, холиноксидазы и алкогольоксидазы за счет использования полиэлектролитов нелинейной архитектуры.
Тирозиназный и холиноксидазный биосенсоры, созданные в лаборатории Экобиокатализа
Ацетилхолинэстераза (АХЭ, ЕС 3.1.1.7) обнаружена в эритроцитах, плазме, фибриллярных нервах, а также в ряде других тканей, таких как симпатические и парасимпатические ганглии, парасимпатические окончания органов, моторные окончания двигательных нейронов, потовые железы, эмбриональные ткани. Активность АХЭ в крови человека составляет в среднем 4-5 Е/мл, при этом 92% активности фермента сосредоточено в эритроцитах и 8% - в плазме. За единицу активности холинэстераз принимают количество фермента, осуществляющего гидролиз 1 мкм субстрата за 1 мин при 25 С и рН 7,5.
Первичную структуру фермента образует последовательность из 537 аминокислотных остатков. Мономер АХЭ представляет собой эллипсоидную молекулу размером 45x60x65 А, имеет молекулярную массу порядка 60 кДа. Третичная структура АХЭ состоит из 12 соединенных между собой полипептидных участков в конформации 0-складчатых листов, окруженных 14 полипептидными участками в конформации а-спиралей (рис. 1-1).
Исследования структуры этого фермента выявили наличие нескольких основных функциональных доменов в белке: каталитический центр, располагающийся в гидрофобном кармане, а также периферический анионный центр, который отвечает за
В каталитическом центре АХЭ выделяют «эфирную» и «анионную» области. «Эфирная» область каталитического центра содержит каталитическую триаду (Ser200, His440, Glu327), роль которой сводится к непосредственному участию в гидролизе ацетилхолина в активном центре белка. Каталитическая триада АХЭ типична для сериновых протеаз, с той лишь оговоркой, что роль более распространенного в случае сериновых протеаз Asp выполняет Ghi. Set и His принимают участие в катализе в качестве нуклеофильной атакующей группы и кислотно-основного элемента, соответственно. Роль «анионной» области заключается в правильном ориентировании заряженных частей субстрата, входящего в активный центр.
Гидрофобный карман, в котором располагается каталитический центр фермента, на 40% состоит из ароматических аминокислотных остатков и имеет глубину порядка 20 А. Роль этого домена заключается в дополнительной фиксации субстрата путем взаимодействия с его гидрофобной областью. Периферический анионный центр находится на расстоянии 2 нм от каталитического центра. Главными аминокислотными остатками этого центра являются Тгр286, Туг72, Туг124, Glu285, Asp74 и Туг341. Этот центр способен связывать большое число различных лигандов, тем самым изменяя конформацию активного центра и регулируя субстратную специфичность фермента. Такая гибкость активного центра и остальных частей белковой молекулы АХЭ обуславливает оптимальную каталитическую активность при различных внешних условиях [10]. Четвертичная структура АХЭ представлена в организме человека двумя различными формами: «А» и «G». «G» форма - это глобулярная форма белка, встречается в виде мономера, димера и тетрамера, в которых мономеры соединены посредством дисульфидных связей (рис. 1-2) [11]. Часть полипептидной последовательности коллагеноподобного хвоста, связывающаяся с тетрамерами, содержит большое количество пролина (N-конец цепи). Все молекулярные формы АХЭ кодируются одним геном и содержат одинаковые по строению и каталитической активности активные центры [12]. 6) Физиологическая функция АХЭ Физиологическая функция АХЭ заключается гидролизе ацетилхолина. Ацетилхолин является сигнальной молекулой, которая выделяется в синапс и передает возбуждение от пресинаптического нейрона к мотонейрону, подающему сигналы к сокращению поперечно-полосатой мышцы. При связывании ацетилхолина с синаптическими рецепторами происходит деполяризация мембраны, и нервный импульс распространяется вдоль всего аксона вплоть до нервных окончаний. В мембране последних есть потенциал-зависимые Са +-каналы, которые открываются, когда их достигнет волна деполяризации, позволяя внеклеточному Са проникнуть в клетку. Это приводит к слиянию везикул с ацетилхолином, с клеточной мембраной и их дальнейшему высвобождению. Терминация процесса передачи нервного импульса осуществляется через гидролиз ацетилхолина до холина и уксусной кислоты под действием АХЭ [13]. Недавно было выяснено, что АХЭ принимает участие в процессе апоптоза -программируемом саморазрушении клетки. Было зафиксировано выделение фермента в цитоплазме клетки на ранней стадии апоптоза. Далее белок передвигается к ядру. Через некоторое время после этого ядро разрушается, что дает повод предположить, что АХЭ участвует в разрушении ядерной оболочки в процессе апоптоза [14]. АХЭ специфична к эфирам уксусной кислоты. Физиологическим субстратом для нее является ацетилхолин (Км = 95 цМ). Реакция гидролиза ацетилхолина в присутсівии АХЭ приведена на АХЭ способна гидролизовать также и другие алкилацетаты: ацетилтиохолин, диметиламиноэтилацетат, метиламиноэтилацетат и аминоэтилацетат [15]. г) Механизм катализа АХЭ В результате многочисленных исследований был предложен механизм гидролиза субстрата в активном центре АХЭ, включающий в себя стадии ацилирования и деацилирования фермента (рис. 1-5).
На первой стадии гидролиза происходит нуклеофильная атака кислорода Ser200 по карбонильному атому углерода субстрата. Одновременно с этим происходит протонирование His440, который выступает в роли основания. Стабилизация протонированного His440 осуществляется Glu327. Glu327 и His440 в данном процессе образуют так называемую систему переноса заряда, активирующую Ser. Таким образом, в результате всех этих взаимодействий происходит образование первого тетраэдрического интермедиата, который быстро распадается с образованием ацилфермента и высвобождением холина. Далее ацилфермент подвергается нуклеофильной атаке молекулой воды, в результате чего образуется второй тетраэдрический интермедиат.
Методы иммобилизации алкогольоксидазы при изготовлении амперометрических сенсоров
В работе [34] показано, что БХЭ связывает низкие дозы фосфорорганических и карбаматных пестицидов и таким способом защищает человека от токсического действия этих ингибиторов эстераз. Подтверждением этому является пониженная активность БХЭ без клинических признаков отравления у людей, работающих с пестицидами. В статье [35] была показана корреляция между связыванием фосфорорганических соединений с БХЭ и снижением их острой токсичности для мышей. Определение активности БХЭ в цельной крови обычно используют в качестве чувствительного биомаркера воздействия фосфорорганических соединений. В то же время установлено, что генетические варианты БХЭ реагируют с антихолинэстеразными веществами более медленно, в результате чего больше токсина остается для реакции с АХЭ в нервных синапсах, что позволяет предположить меньшую защищенность и, соответственно, большую чувствительность людей с атипичной БХЭ к антихолинэстеразным препаратам. В экспериментах на обезьянах и грызунах показано, что у животных с молчащей БХЭ резко возрастает риск антихолинэстеразного отравления при любом контакте с ингибиторами холинэстераз [34].
Определение активности БХЭ имеет огромную значимость в медицинской практике при применении анестезии. Для анестезии часто используют сукцинилхолин в качестве миорелаксанта, который ингибирует рецепторы АХЭ, тем самым, вызывая расслабление скелетных мышц и, как следствие, кратковременную, длящуюся 2-3 минуты, остановку дыхания. В организме человека действие сукцинилхолина непродолжительно, так как он быстро гидролизуется под действием БХЭ. Низкий уровень акгивности БХЭ, который может быть обусловлен как ее ингибированием антихолинэстеразными . веществами, так и наличием генетических вариантов этого фермента у человека (атипичная БХЭ, молчащая БХЭ и К-холинэстераза), приводит к аномальной реакции на применение таких миорелаксантов - длительность их действия возрастает, что может привести к асфиксии [36].
Следует отметить, что определение активностей обеих холинэстераз, АХЭ и БХЭ, является необходимым условием правильного подбора антидота для людей, подвергшихся воздействию боевых отравляющих веществ, действие которых основано на ингибировании этих ферментов в крови человека. К таким веществам относятся зарин, зоман, VX и др. Правильное и своевременное установление уровня активностей холинэстераз ведет к выбору оптимального антидота и его количества, что предотвращает развитие тяжелых последствий отравления [1].
Карбоксилэстеразы (КЭ, ЕС 3.1.1.1.) млекопитающих представляют собой большую группу ферментов, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме и цитозоле клеток многих тканей [37, 38]. Максимальная карбоксилэстеразная активность была найдена в микросомах печени. Достаточно высокая активность характерна для плазмы. Также КЭ содержатся в тонком и толстом кишечнике, желудке, мозге, моноцитах и макрофагах. КЭ плазмы синтезируются в печени и секретируются в кровоток. Среди эстераз различают три типа: 1. А-эстеразы, или арилэстеразы, которые специфичны в основном по отношению к эфирам фенолов, не ингибируются диэтил-п-нитрофенилфосфатом (Е-600), гидролизуют его. 2. В-эстеразы, или алиэстеразы, гидролизующие эфиры алифатических спиртов и ингибируемые Е-600. 3. С-эстеразы, которые не ингибируются Е-600 и не гидролизуют его. Наиболее изучены В-эстеразы или КЭ. Они широко распространены в тканях животных и растений, главным образом в микросомах. а) Структура КЭ КЭ имеют множество форм. КЭ из печени быка (Mr = 164 кДа) состоит из 6 субъединиц, из печени свиньи (Мг = 168 кДа) - из 4 субъединиц. Последний фермент диссоциирует на каталитически активные димеры. В-эстеразы содержат в активном центре остаток серина. или близкая к ней характерна и для активного центра сериновых протеаз. На рис. 1-7 представлена 3-субъединичная структура КЭ человека, выделенная из микросом печени. б) Субстратная специфичность КЭ Специфичность КЭ к субстратам очень широкая. Причем нет резких отличий в специфичности между эстеразами А и В. Данная группа ферментов катализирует гидролиз липофильных эфир-, тиоэфир- и амидсодержащих субстратов. Скорость гидролиза эфиров зависит от длины ацильной цепи (максимальна при Сіг) и длины алкильного остатка (максимальна при Q). Субстраты обычно активируют КЭ. Широкая субстратная специфичность КЭ определяет возможность клетки метаболизировать целый спектр разнообразных эфирных соединений. КЭ участвует в процессах детоксикации и метаболической активации различных медицинских препаратов, природных токсикантов и канцерогенов. в) Физиологическая функция КЭ Существенное число экзогенных веществ являются субстратами КЭ. В их число входят кокаин, капсаицин, пальмитоил-соА, галоперидол, имидаприл, салицилаты, стероиды и др. [17,19,21, 31, 39]. На карбоксилэстеразную активность оказывают влияние как прямое воздействие некоторых соединений, таких как антихолинэстеразные агенты (бис-и--, нитрофенилфосфат), так и уровень ферментативной регуляции. Активность микросомальных КЭ, как и других ксенобиотикметаболизирующих ферментов, может индуцироваться введением таких препаратов как фенобарбитал, арокрол;, полициклические ароматические гидрокарбонаты, аминопирин и др. [17, 32].
Стабилизация холиноксидазного биосенсора, созданного по методу послойного нанесения полиэлектролитов
Существует большое разнообразие изоферментов КЭ с широко различающейся активностью в отношении используемых для анализа субстратов и ингибиторов КЭ. Для определения активности КЭ в качестве субстратов могут быть использованы различные эфиры карбоновых кислот. Некоторые эфиры карбоновьгх кислот, гидролизуемых КЭ, являются также субстратами параоксоназ и холинэстераз. Для дискриминации карбоксилэсгеразной активности при анализе образцов тканей животных используют метод дифференциального анализа с применением специфических ингибиторов параоксоназ (ЭДТА) и холинэстераз (физостигмин) [55]. Эфиры масляной кислоты гидролизуются КЭ значительно лучше, чем эфиры уксусной кислоты, в то время как для параоксоназ наблюдается обратная закономерность. Стандартными субстратами, часто используемыми для определения КЭ, являются метилбутират, этилбутират, п-нитрофенилацетат, фенилбутират, а-нафтилацетат, малатион, ацетанилид, триацетин (глицерилтриацетат) [56]. К наиболее известным селективным ингибиторам КЭ относятся - бис-п-нитрофенилфосфат (BNPP), три-о-крезилфосфат (ТОСР) и его активный метаболит о-крезил салигенинциклофосфат (CBDP), а также ЗДБ-трибутилфосфоротритоат (DEF).
Простейший алифатический эфир масляной кислоты, метилбутират, а также этилбутират, обычно используются для титриметрического анализа, проводимого в режиме рН-статирования [55, 57]. К недостаткам данного метода следует отнести довольно большой объем инкубационной пробы. Для увеличения чувствительности этого метода был предложен радиохимический метод определения КЭ с использованием в качестве субстрата меченого метил [1-14С]бутирата[58].
Один из наиболее широко используемых в настоящее время методов анализа активности КЭ основан на реакции ферментативного гидролиза п-нитрофенилацетата с образованием продукта желтого цвета (п-нитрофенола), накопление которого измеряют спектрометрически при длине волны 405 nm [59]. Для предотвращения гидролиза п- нитрофенилацетата под действием А-эстераз, особенно в плазме, используют ЭДТА. Аналогичным образом активность КЭ может быть измерена с использованием в качестве f субстрата р-нитрофенилбутирата [58]. Также в качестве субстратов используют сложные эфиры карбоновых кислот и сс-нафтола (а-нафтилацетат и а-нафтилбутират). Выделяющийся в результате их гидролиза а-нафтол детектируется при 235 nm [60]. . Существует два подхода к дискриминационному анализу эстеразной смеси (здесь и далее под «дискриминационным анализом» подразумевается анализ, позволяющий вычленять вклады каждого компонента в смеси). Первый подход предполагает использование специфических ингибиторов эстераз и измерение остаточной эстеразной активности. Второй подход основан на различной субстратной специфичности эстераз. Определяя коэффициенты чувствительности эстераз к различным субстратам и измеряя скорость гидролиза субстратов в присутствии различных ферментов, можно вычислить содержание каждой эстеразы в пробе. Реализация обоих подходов возможна с использованием как оптических, так и электрохимических методов определения эстеразной активности. Пример использования первого подхода приведен в работе [61]. Общая холинэстеразная активность в сыворотке крови собак была измерена по методу Эллмана с использованием ацетилтиохолина в качестве субстрата. Далее было проведено селективное ингибпрование БХЭ с помощью тетрамоноизопропилпирофосфотетрамида (изо-ОМРА) и измерение остаточной эстеразной активности в пробе, которая соответствовала активности АХЭ. Разность общей и остаточной активности равнялась активности БХЭ. Для селективного ингибирования АХЭ обычно используется 1,5-бис-(4-аллилдиметиламмонийфенил)пентан-3,1 дибромид (BW284c51). Недостатками этого подхода являются неполное ингибирование эстераз, недостаточная селективность ингибирования, а также значительная продолжительность анализа, которая может привести к частичной потере первоначальной ферментативной активности. Второй подход к определению эстераз в крови был осуществлен в работе [1]. В качестве субстратов авторами было предложено использовать ацетил-, бутирил- и пропионилтиохолины. Гидролиз этих субстратов приводил к выделению тиохолина, содержание которого регистрировалось флуориметрическим методом. Для каждого субстрата устанавливались коэффициенты чувствительности АХЭ и БХЭ, за которые принимались наклоны зависимостей скоростей ферментативного гидролиза субстратов от содержания фермента в пробе. Различные концентрации отдельных холинэстераз в,« образце создавались за счет последовательных разбавлений цельной крови и селективного ингибирования одной из холинэстераз. Далее проводилось измерение скорости гидролиза субстратов в присутствии смеси f холинэстераз в тестируемом образце крови. Измеряемые в ходе анализа скорости гидролиза каждого из трех субстратов Ri, R2 и R3 связаны с искомыми концентрациями ферментов следующими уравнениями: где xi, X2, X3 - коэффициенты чувствительности АХЭ по ацетил-, бутирил- и пропилтиохолину, соответственно, уь у2, уз - коэффициенты чувствительности БХЭ по ацетил-, бутирил- и пропилтиохолину, соответственно, Ri, R2, R3 — скорости гидролиза ацетил-, бутирил- и пропилтиохолина, соответственно. Решение системы линейных уравнений 1-1 дает значения концентраций холинэстераз в пробе.
Данный метод показывает очень высокую точность (99%), не требует значительных временных затрат как на пробоподготовку, так и на проведение измерения, и легко автоматизируется, что делает его перспективным для практического использования в медицинских целях. Однако применение этого метода предполагает использование дорогостоящего оборудования, что существенно влияет на стоимость проведения анализа. Существенным недостатком данного подхода является также то, что количество определяемых этим методом эстераз ограничено типом использующихся субстратов. Отсюда очевидна потребность в разработке более доступных с одной стороны и более универсальных с другой стороны методов одновременного определения активностей эстераз в цельной крови. Решение этой проблемы возможно с помощью применения мультисенсорных устройств.
Включение алкогольоксидазы в состав наноструктурнрованных пленок полиэлектролитов
Бурное развитие геномики и протеомики, многочисленные исследования в области создания лекарственных препаратов и многие другие биотехнологические исследования послужили мощным импульсом для разработки новых методов, позволяющих быстро и надежно производить скрининг и селекцию ферментов, их субстратов и ингибиторов. Разработанные в последнее время методы иммобилизации белков на твердых поверхностях с субмикронным и микронным пространственным разрешением позволяют говорить о возможности создания мультисенсорных устройств для одновременного определения десятков и даже сотен различных ферментов. К преимуществам мультисенсоров можно также отнести: - возможность автоматизации и миниатюризации проведения анализа; - высокую скорость проведения анализа; - высокую чувствительность и воспроизводимость, низкие пределы обнаружений; - высокую производительность методик; - малые количества используемых реагентов (от нескольких нанолитров); - низкую себестоимость. Применение мультисенсоров позволяет успешно решать такие биотехнологические задачи, как идентификация ферментов, определение субстратной специфичности ферментов, определение их кинетических параметров, изучение селективности ингибирования и многие другие.
Определение субстратной специфичности ферментов является важной задачей в биохимии и биотехнологии. Одновременное измерение активности ферментов при взаимодействии с разными субстратами позволяет получить набор данных, характерных для индивидуального фермента, который в литературе часто называется «отпечатками пальцев» ферментов (enzyme fingerprints). Такие «отпечатки пальцев» дают необходимую информацию при изучении механизма взаимодействия фермента и субстрата, при установлении физиологических субстратов и изучении биологической функции фермента, а также для дизайна потенциального селективного ингибитора. Для получения данных о субстратной специфичности ферментов широко используются мультисенсоры, которые позволяют за короткое время провести сотни индивидуальных реакций и установить субстратный профиль фермента.
Большое число работ посвящено изучению субстратного профиля киназ с использованием мультисенсоров. Так, в работе [2] изучалось действие 119 из 122 предполагаемых киназ дрожжей на 17 различных белков. Белки были иммобилизованы на поверхности чипа, который представлял собой силиконовый микропланшет на стеклянной подложке. В чипе были сделаны 140 микролунок диаметром 1,4 мм, высотой 300 дм. Поверхность лунок была предварительно обработана сшивающим реагентом на силиконовой основе для последующей иммобилизации субстратов. Для каждого из 17 субстратов был изготовлен отдельный чип. После иммобилизации субстрата в каждую микролунку был добавлен раствор киназы и Ру-АТР таким образом, что каждой киназе соответствовала своя лунка. После инкубации и последующей промывки 33Р был определен радиометрически. Основную сложность данного метода составляет получение чистых препаратов белков, поэтому в более поздних работах по изучению субстратной специфичности киназ [62] были использованы иммобилизованные пептиды. Для того, чтобы исключить сложности, связанные с радиометрической детекцией продуктов ферментативной реакции, в работе [63] было предложено использовать меченные ; флуоресцентной меткой антитела против фосфорилированных аминокислот. Такой метод отличался простотой применения, высокой чувствительностью и селективностью.
С помощью микрочипов был изучен субстратный профиль протеаз. Так, Эллманом и сотрудниками был разработан метод скрининга протеаз на чипе с иммобилизованными пептидилкумариновыми производными [3]. Гидролиз субстратов под действием протеаз приводил к высвобождению кумарина и увеличению флуоресцентного сигнала. С помощью данного метода авторы работы не только установили субстратный профиль изучаемых протеаз, но и вычислили кинетические параметры ферментов. В работе [4] был предложен альтернативный метод скрининга протеаз на микрочипе. На стеклянную пластину были нанесены капли раствора глицерина, содержащие молекулы субстратов для создания индивидуальных «реакционных центров». Объем этих капель не превышал 2 нл, диаметр составлял 180 им, расстояние между каплями составляло 500 цм. На одну стеклянную пластину наносилось более 6000 капель. Раствор фермента наносился на поверхность микрочипа простым аэрозольным распылением. Детекция осуществлялась флуориметрически. Такой подход позволял избежать сложностей, связанных с предварительной модификацией поверхности микрочипа и последующей иммобилизацией реагентов. Позднее этот чип, получивший название DiscoveryDot, был использован для скрининга киназ, сериновых и цистеиновых протеаз, а также для вьиисления их кинетических параметров и изучения процессов ингибирования этих ферментов.
Как уже было отмечено ранее, применение мультисенсоров является удобным методом идентификации ферментов. Помимо индивидуальных субстратных профилей или «отпечатков пальцев» ферментов, в литературе описано несколько других подходов для идентификации ферментов на микрочипе. Один из низ основан на специфическом связывании фермента и ингибитора и последующей детекции образовавшихся комплексов. Такой микрочип можно использовать также для скрининга потенциальных ингибиторов. Так, в работе [64] был сконструирован чип, на поверхности которого были иммобилизованы ферменты различных классов. Для идентификации ферментов были использованы их потенциальные ингибиторы, меченные флуоресцентной метко и: производные фторфосфатов - для сериновых гидролаз, винилсульфопроизводныс - для - цистеиновых протеаз и акриламидные производные - для фосфатаз. Образовавшиеся комплексы фермент-ингибитор детектировались флуориметрически. Данный метод является высокочувствительным и селективным и пригоден для идентификации индивидуальных ферментов или их классов, а также для скрининга ингибиторов.
Интересный способ идентификации ферментов на микрочипе приводится в работе;. [5]. Суть предлагаемого метода заключается во взаимодействии ферментов и специфичных к ним антител. На стеклянной подложке были иммобилизованы антитела, специфичные к определенному классу ферментов. Далее на поверхность наносились меченные флуоресцентной меткой ферменты, после чего комплексы фермент-антитело детектировались флуориметрически. Так были идентифицированы некоторые сериновые протеазы, а также металлопротеиназы.