Введение к работе
Актуальность проблемы. Завершение XX века знаменуется стремительным развитием аналитической биотехнологии - междисциплинарной науки, базирующейся на идеях и достижениях молекулярной биологии, энзимояогии, химии, физики и микроэлектроники. К числу наиболее ярких и многообещающих результатов такого рода взаимопроникновения и взаимообогащения этих отраслей естествознания относится создание биологических сенсоров.
Биологические сенсоры или биосенсоры представляют собой первичные преобразователи информации, позволяющие исследователю выявлять интересующие его молекулы из бесчисленного хаоса молекулярных смесей. Биосенсоры, начиная с первых публикаций в 1962 г. , привлекают пристальное внимание ученых и практиков уникальными возможностями, открывающимися благодаря их использованию в различных сферах деятельности человека.
Так, в медицине и здравоохранении арсенал клинической биохимии пополняется высокоселективными, оперативными и экономичными методами биосенсорного определения метаболитов. Важность методов в наибольшей степени проявляется в стимулировании развития новых направлений в лечении ряда заболеваний, связанных с нарушениями метаболизма, в первую очередь, сахарного диабета. Различные отрасли промышленности - биохимическая, пищевая, фармакологическая, химическая, а также сельское хозяйство получают уникальный инструментарий для оптимизации условий проведения технологических операций и контроля качества конечных продуктов. В области охраны окружающей среды с помощью биосенсоров осуществим непрерывный, в реальном масштабе времени контроль уровня загрязнений (мониторинг) атмосферы, вод, почвы, промышленных отходов.
Важным вкладом в развитие биосенсоров является открытие советскими учеными явления биоэлектрокатализа - ускорения ферментами электрохимических реакций (Варфоломеев, Березин, 1982).
Среди известных биосенсоров к настоящему времени наис лльшее распространение получили мембранные биосенсоры - биотехнические устройства, в которых биологический компонент (рецептор) образует покрытие физико-химического преобразователя (датчика, детектора) или включен в него. Рецептор обеспечивает "опознавание" молекул интересующего вещества за счет их включения в биохими-
ческие, в первую очередь, биокаталитические процессы. Преобразователь трансформирует индуцируемые процессом "опознавания" изменения свойств рецептора в измеряемый отклик.
Физико-химически мембранные биосенсоры представляют собой открытые гетерогенные диффуэионно-биокаталитические и, как правило, электрохимические системы. Созданию и оптимизации параметров таких многофакторных систем применительно к конкретным условиям эксплуатации необходимо предшествует кинетическое исследование их функционирования, представляющее собой самостоятельное перспективное научное направление.
Цель исследования заключалась в установлении кинетических закономерностей функционирования мембранных биосенсоров, основанных на биокаталитических превращениях определяемого субстрата.
Научная новизна. В диссертационной работе на основе кинетического исследования гетерогенных диффузионно-биокаталитических процессов, протекающих обратимо или необратимо по схеме Михаэли-са-Ментен, установлены соотношения, характеризующие в широком диапазоне концентраций субстрата стационарную кинетику функционирования моноферментных электрохимических и энтальпиметрических биосенсоров, влияние на нее толщины, диффузионных, фазовых и биокаталитических характеристик трехслойного покрытия, а также характеристик преобразователя биосенсоров.
Предложены уравнения стационарной кинетики функционирования амперометрических моноферментных сенсоров, в которых фермент катализирует двухсубстратную реакцию, а детектируемым деполяризатором служит один из продуктов, либо второй субстрат Скосубст-рат). Охарактеризованы параметры глюкозооксидазных сенсоров, детектирующих перекись водорода или кислород. Найдены уравнения кинетики функционирования моноферментных сенсоров, основанных на детектируемой регенерации фермента органическим металлом индикаторного электрода.
Разработан оригинальный метод изготовления мембранных биосенсоров путем иммобилизации ферментов в латексной мембране на поверхности преобразователя. Создан уреазный рН-электрод, описаны экспериментальные зависимости величины его стационарного отклика от концентрации мочевины и трис-HCl буфера. Исследована кинетика функционирования глюкозооксидазного рН-злектрода.
Созданы оригинальные моноферментные сенсоры, основанные на кондуктометрическом и энтальпиметрическом детектировании ферментативной реакции. С использованием разработанных математических моделей установлены кинетические закономерности функционирования биосенсоров в стационарном режиме работы.
Предложены уравнения предстационарной кинетики функционирования электрохимических моноферментных сенсоров, покрытие которых включает слой иммобилизованного фермента и наружную мембрану. Для относительно малых и насыщающих концентраций субстрата найдены уравнения предстационарного распределения субстрата и продукта в покрытии, а также уравнения для величины предстационарного отклика биосенсоров. Дана оценка времени развития отклика потенциометрических биосенсоров при варьировании значений диффузионного модуля и отношения толщин наружной мембраны и слоя фермента.
Найдены уравнения стационарной кинетики функционирования электрохимических мембранных сенсоров, осуществляющих последовательные полиферментные превращения субстрата и детектирующих конечный продукт. Величина отклика сенсоров с равномерно распределенными ферментами в покрытии характеризуется кинетической неразличимостью биокатализаторов. При послойном распределении ферментов большей эффективностью обладают те из них, слои которых экранированы от раствора субстрата. Оценена величина границ диапазона концентраций субстрата, удобных для биосенсорного определения.
Проведен анализ кинетики функционирования амперометрических биферментных сенсоров 6 типов. Установлена структурная общность выражений для величины стационарного отклика сенсоров, осуществляющих последовательные или параллельные превращения субстрата. Величина отклика, обусловленного образованием деполяризатора при циклических превращениях субстрата, возрастает с увеличением диффузионных модулей и больше при равномерном распределении ферментов, чем при послойном. Детектирование деполяризатора при его образовании из определяемого субстрата более эффективно, чем при образовании из интермедиата.
При высокой каталитической активности скорость генерации отклика биосенсоров, осуществляющих последовательные или параллельные превращения субстрата, близка к скорости диффузии депо-
ляриэатора в покрытии, а накопление продукта циклических превращений субстрата происходит в 3,5 раза медленнее. При малых степенях конверсии развитие отклика биосенсоров существенно замедляется. Экспериментально исследована предстационарная кинетика биосенсоров, осуществляющих последовательные и циклические превращения D-глюкозы и, соответственно, никотинамидадениндинуклео-тида.
Предложены уравнения стационарной кинетики функционирования полиферментных сенсоров с детектируемой электрохимической регенерацией фермента. Для биферментных сенсоров с достаточно малой толщиной биокаталитического слоя найдены диагностические линейные анаморфозы кинетических кривых.
Научная и практическая значимость. Работа выполнена в рамках Программы ГКНТ СССР по инженерной энзимологии (раздел 5.5 "Разработка нового поколения биоаналитических методов и устройств для целей медицины, сельского хозяйства, контроля технологических процессов и качества окружающей среды"). Результаты работы могут быть использованы для
- предсказания и оптимизации эксплуатационных параметров
С"дизайна") мембранных биосенсоров: чувствительности, величины
диапазона концентраций субстрата (ингибитора), удобных для био
сенсорного определения, времени развития отклика, селективности;
установления природы лимитирующих стадий в процессе формирования отклика биосенсоров;
оценки эффективности электрохимической регенерации ферментов в биосенсорах;
исследований гетерогенной кинетики биокаталитических систем, расчета эксплуатационных параметров биохимических реакторов (ферментеров);
разработки и изготовления биоаналитических систем на основе оригинальных кондуктометрических и эктальпиметрических биосенсоров;
получения фермент-содержащих пленок и покрытий биосенсоров оригинальным методом иммобилизации в латексной мембране.
Практические разработки защищены 3 авторскими свидетельствами на изобретения.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на Всесоюзной конференции по трансплантации органов и
тканей, Тбилиси, 1979 г., Международном симпозиуме по проблемам контроля искусственных органов, Варшава, 1980 г. , V Всесоюзном симпозиуме по получению и применению биокатализаторов в .народном хозяйстве и медицине, г. Кобулети, 1985 г. , на научных семинарах в НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ СССР, на Хими-мическом факультете МГУ им. М. В.Ломоносова.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано ?9 печатных работ, в том числе одна книга, и получено 3 авторских свидетельства.
Объем и структура работы. Диссертационная работа представляє'; собой рукопись, изложенную на 333 страницах машинописного текста, включает 7 таблиц, 61 рисунок , а также список цитированной литературы из 297 наименований. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и заключения.