Содержание к диссертации
Введение
1. Общие сведения о глюкоамилазе 6
1.1.Строение и физико-химические свойства глюкоамилаз 7
1.2. Субстратная специфичность глюкоамилаз 18
1.3.Структура активных центров глюкоамилаз 21
1.4.Механизм действия глюкоамилаз 27
2.Стабилизация глюкоамилаз 31
2.1.Факторы, влияющие на термостабильность растворимой глюкоамилазы 31
2.2. Иммобилизация глюкоамилазы и ее влияние на термоста бильность фермента 34
2.3.Влияние субстратов и продуктов ферментативной реак ции на термостабильность иммобилизованной глюкоами лазы 42
2.4 Выводы из литературного обзора и постановка основных за дач работы 44
2 Экспериментальная часть
1 .Материалы 46
2.Методы 47
3 Результаты и их обсуждение
1.Термостабилизация глюкоамилазы 62
1.1.Влияние субстрата и продукта ферментативной реакции на скорость термоинактивации фермента.Кинетический анализ 63
1.2. Иммобилизация глюкоамилазы.Влияние субстрата на термостабильность растворимой и иммобилизованной глюкоамилазы 67
1.3.Влияние глюкозы на термостабильность глюкоамилазы 74
1.4.Температурные зависимости термоинактивации раство римой и иммобилизованной глюкоамилазы 81
1.5.Влияние химической модификации на активность и термостабильность растворимой и иммобилизованной глюкоамилазы 89
1.6. Инактивация глюкоамилазы в ходе реакции 97
1.7.О возможном пределе термостабильности иммобилизо ванной глюкоамилазы 104
Выводы 110
- Субстратная специфичность глюкоамилаз
- Иммобилизация глюкоамилазы и ее влияние на термоста бильность фермента
- Иммобилизация глюкоамилазы.Влияние субстрата на термостабильность растворимой и иммобилизованной глюкоамилазы
- Инактивация глюкоамилазы в ходе реакции
Введение к работе
В последние годы наряду с поиском новых источников кормового и пищевого белка, значительный интерес проявляется к расширению сырьевых источников сахаристых веществ и более рациональным спосабам их использования. Одно из основных направлений этой проблемы - получение глюкозы ферментативным путем из природного сырья (крахмал,целлюлоза). В настоящее время для получения пищевой глюкозы наиболее широко применяется крахмал. Процесс получения глюкозы из крахмала при помощи растворимой глюкоамилазы широко используется в промышленности многих стран. В связи с хорошо известными преимуществами иммобилизованных ферментов по сравнению с растворимыми, большой интерес вызывает применение в крупнотоннажном производстве глюкозы иммобилизованной глюкоамилазы. Это позволило бы значительно упростить процесс гидролиза крахмала, который целесообразно проводить при повышенной температуре (б0°-б5°). Благодаря этому увеличивается скорость ферментативной реакции, происходит пастеризация образующегося раствора глюкозы и уменьшается опасность микробного заражения реактора. Однако, при этом увеличивается скорость тер моинактивации фермента. Таким образом, возникает необходимость поиска путей повышения термостабильности иммобилизованной глюкоамилазы.
Несмотря на большое количество работ по модификации или иммобилизации глюкоамилазы с целью ее стабилизации, термостабильность полученных препаратов остается неудовлетворительной. Время полуинактивации наиболее стабильных препаратов иммобилизованного фермента при 65° не превышает 5-7 дней. Характеризует ли эта величина определенный предел термостабильности глюкоамилазы при данных условиях, до последнего времени оставалось неизвестным. Таким образом, как с теоретической, так и с практической точки зрения представляется важным изучение принципов термостабилизации глюкоамилазы и выявление реальных возможностей повышения устойчивости данного фермента к тепловым воздействиям.
Как показано в наших исследованиях, глюкоамилаза представ ляет довольно необычный пример для изучения кинетики ферментативных реакций. При связывании со специфическими субстратами, термостабильность глюкоамилазы резко возрастает по сравнению с термостабильностью свободного фермента. Кинетические закономерности подобных реакций в литературе практически не изучались, хотя они представляют большой интерес как для развития формальной кинетики ферментативного действия, так и для описания термоинактивации реальных систем с участием глюкоамилазы. Для описания подобных систем в настоящей диссертационной работе впервые проведено формально-кинетическое рассмотрение скорости термоинактивации фермента в зависимости от концентрации субстрата, а также полных кинетических кривых процесса с учетом термоинактивации фермента в ходе реакции. Экспериментально подтверждена справедливость разработанных кинетических подходов.
Субстратная специфичность глюкоамилаз
Один из основных вопросов энзимологии - вопрос о взаимосвязи между строением , свойствами и специфической каталитической функцией активных центров ферментов.Изучение специфичности действия глюкоамилаз связана .. с определенными затруднениями, вызванными сложностью структуры и неоднородностью состава высокомолекулярных субстратов. По этой причине, субстратная специфичность глюкоамилаз достаточно подробно изучена только по отношению к линейным олигосахаридам, с низкой степенью полимеризации. При обсуждении данного вопроса необходимо выделить две главные проблемы: 1. Специфичность глюкоамилаз по отношению к типу и конфигурации расщепляемой глюкозидной связи, а также к размерам отщепляемого углеводного остатка. 2. Специфичность глюкоамилаз по отношению к степени полимеризации субстрата. Абсолютной специфичностью глюкоамилазы обладают лишь по отношению к конфигурации расщепляемой связи и размерам отщепленного углеводного остатка. Они гидролизуют (1,4) глюкозидную связь, образованную двумя глюкозными остатками, причем отщепление происходит с невосстанавливающего конца молекулы субстрата с образованием -D -глюкозы /1,48,52,84-86/. Строгая стереоспецифичность децствия глюкоамилаз доказана не только на основе анализа продуктов, но и на основе данных, полученных при изучении реакции трансгликозилирования и синтеза гликозидных связей. Показано, что длительная инкубация этих ферментов с A-D -глюкозой приводит к образованию мальтозы, изо-мальтозы и некоторых трисахаридов, в которых глюкопиранозные звенья соединены Ы-(1,4)- иоС-(1,6)-глюкозидными связями. Субстратная специфичность глюкоамилаз зависит от источника выделения и меняется при переходе от одной множественной формы фермента к другой. В работе /66/ показана возможность гидролиза глюкоамилазой линейных декстранов, в которых содержится более 95%о(-(.1у6) глюкозидных связей. Необходимо отметить, что скорости гидролиза ы.-( 1,4)- и о -( 1,6)- глюкозидных связей существенно различаются. Сравнение скоростей ферментативного гидролиза (v0) мальтозы (о(-(1,4)-) и изомальтозы ( -(1,6) связь) показывает, что отношение ъмальт#/у ИЗОМальт.в некоторых случаях составляет более двух десятичных порядков. Например, это соотношение для глюкоамилазы из Rh.niveus равно 200 /59/, для фермента из Endomyces sp. -100 /60/. В работах /9/ и /61/ показано, что глюкоамилаза из Asp.niger катализирует гидролиз мальтозы в 30-40 раз быстрее изомальтозы.
Следует заметить, что скорость гидролиза -(1,6)-глюкозидных связей в точках ветвления полимерных субстратов (амилопектин, гликоген) может отличатся от скорости их гидролиза в дисахаридах. В работе /62/ показано, что глюкоамилазы из Asp.bataae вообще не гидролизуют изомальтозу. Сообщение о том, что глюкоамилаза из Penicillium oxalycium /37/ не гидролизует изомальтозу вряд ли можно считать достоверным, так как условия эксперимента были явно не подходящие, чтобы обнаружить столь большую разницу в скоростях гидролиза, (слишком малое время инкубации фермента с субстратом). В ряде случаев показано, что глюкоамилазы способны гидро-лизовать оС-(1,3) связи в нигерозе /59-62/ и -(1,2) связи в коибиозе /31,60,63/. Общей закономерностью действия глюкоамилаз различного происхождения на линейные олигоглюкозиды является увеличение начальной скорости их гидролиза /5,9,28,45,50,69,74-77/ и уменьшение константы Михаэлиса /45,62,75,77/ с увеличением степени полимеризации углеводной молекулы. Из этого следует, что гидрой лиз линейных субстратов должен замедлятся во времени в зависимости от глубины превращения субстрата /69/. Вопрос о специфичности глюкоамилаз по отношению к степени полимеризации разветвленных субстратов до настоящего времени является мало изученньм. В литературе имеются лишь косвенные данные, указывающие на то, что ферменты различного происхождения (или их множественные формы) различаются по способности расщеплять разветвленные молекулы субстрата. Например, глюкоамилазы из Asp.niger , Asp.cinnamoneus и коммерческого препарата "Diazyme " были разделены на две изоформы, способные гидролизовать гликоген на 10% и 50% соответственно, в то время как скорость гидролиза ими линейных декстринов была одинаковой. Вполне вероятно, что в этом случае проявляется специфичность изоферментов по отношению ко(-(1,б) глюкозидной связи /67/. Вопрос о максимальной глубине гидролиза таких природных субстратов,как амилоза, амилопектин, гликоген, по-видимому, связан не только с разной специфичностью глюкоамилаз по отношению к o -(J[G,6) глюкозидной связи и степени ветвления этих субстратов,но и с наличием определенных "дефектов" в полимерных цепях. Ими могут оказаться разрушение или модификация отдельных глюкопиранозных звеньев. Например, максимальная глубина ферментативного гидролиза окисленной и фосфорилированной амилозы меньше чем нативной /67,97/. В работах /68,98/ показано, что максимальная глубина гидролиза окисленной и метилированной амилозы глюкоамилазой из Asp. niger зависит от степени ее модификации. Кроме того, имеются сообщения о том, что не которые формы глюкоамилаз отличаются между собой по способности гидролизовать "сырой" крахмал /65,99,100/.
В настоящее время можно считать полностью доказанным факт существования у глюкоамилаз одного каталитического центра, на котором происходит гидролиз какоС-(1,4), так ис -(1,6) глюкозидных связей. Доказательствам этому служат данные, полученные при изучении кинетики ферментативного гидролиза мальтозы, мальтотриозы, изомальтозы и панозы глюкоамилазами различного происхождения. Исследования показали, что для каждого из этих субстратов характерна взаимная конкуренция за активный центр глюкоамилазы из Rh.delemar /64,70/. Значения констант Михаэлиса для их ферментативного гидролиза совпадают с соответствующими значениями констант конкурентного ингибирова-ния (К. ).Термоинактивация глюкоамилазы из Asp.niger приводит к одинаковому уменьшению ее ферментативной активности по отношению к мальтозе и изомальтозе /57/. Кроме того, рН-зави-симость активности этого фермента по отношению к мальтозе совпадает с аналогичной зависимостью гидролиза изомальтозы. Аналог1 гичные данные получены и для глюкоамилазы из Rh.delemar /64,71 На основании рН-зависимостей начальных скоростей ферментативного гидролиза мальтозы, изомальтозы и понозы расчитаны значения рК ионогенных групп активного центра этого фермента. Оказалось, что в гидролизе перечисленных субстратов участвуют одни и теже ионогенные группы, характеризующиеся величинами рК равными 2,9 и 5,9. По мнению авторов, эти значения рК можно соответственно отнести к карбоксильной группе и кар-боксилат-аниону. Данные, свидетельствующие о наличии двух карбоксильных групп в активном центре глюкоамилазы из Asp. niger, были получены и в работе /80/ при помощи химической модификации -С00Н групп метиловым эфиром глицина в присутствии п-этил - И-(3-диметиламинопропил-)-карбодиимида. Модификация 36 из 38 карбоксильных остатков, входящих в состав молекулы фермента, происходила быстро, с одновременной потерей 30% активности. Полная модификация карбоксильных групп глюкоамилазы, происходила при длительной инкубации и приводила к полной потере ферментативной активности. Присутствие же в реакции мальтозы позволяло модифицировать только 36 карбоксильных групп с соответствующей потерей активности. Данные об участии карбоксильных групп в каталитическом гидролизе глюкозидных связей,осуществляемом глюкоамилазой из Asp. niger приведены и в работах /72, 100/.
Иммобилизация глюкоамилазы и ее влияние на термоста бильность фермента
Бесспорными преимуществами иммобилизованных ферментов по сравнению с растворимыми является простота их отделения от реакционной смеси и возможность многократного или непрерывного ., ; использования. Одним из основных критериев при выборе препарата иммобилизованного фермента, в том числе и глюкоамилазы, является его стабильность по отношению к денатурирующим факторам и, в частности, к тепловому воздействию. До настоящего времени вопрос о стабилизации ферментов путем их иммобилизации не имеет однозначного решения. В одних случаях термостабильность ферментов после иммобилизации увеличивается, в других, напротив, - уменьшается, а в третих - остается практически неизменной /106,108,112/. По этой причине выбор носителя, метода иммобилизации или же попытки получить иммобилизованный фермент с заранее заданными параметрами чаще всего носят эмпирический характер. Повышенный интерес исследователей к иммобилизации глюкоамилазы вызван возможностью _ее применения в крупномасштабном производстве глюкозы. Основное препятствие, стоящее на пути внедрения иммобилизованной глюкоамилазы в промышленность, - недостаточная ее термостабильность при ность, - недостаточная ее термостабильность при повышенных температурах. В настоящем разделе будут рассмотрены литературные данные, касающиеся влияния иммобилизации глюкоамилазы на сделана попытка- ее термостабильность и оценить возможные пределы стабилизации. Поставленный вопрос на наш взгляд имеет принципиальное значение для определения дальнейшего направления работ по стабилизации этого фермента, а также для более четкого представления о перспективах его применения в иммобилизованной или растворимой форме. Изучение данной проблемы неразрывно связано с выяснением целого ряда вопросов о влиянии отдельных факторов на термостабильность иммобилизованной глюкоамилазы. Во-первых - это влияние носителя и способа связывания с ним (сорбция, включение в гель, химическое связывание). Во-вторых -влияние на термостабильность конкретных функциональных групп и фрагментов молекулы фермента, участвующих в образовании связи фермент-носитель. И в-третьих - более частный вопрос - о влиянии длины молекулы "сшивающего" агента, образующего связь между поверхностью носителя и глобулоифермента. В течение последних десяти лет опубликовано около ста работ, посвещенных методам иммобилизации глюкоамилазы и ее использованию в реакторах различных типов с целью получения глюкозы или глюкозных сиропов. К сожалению, в большинстве случаев они имеют чисто прикладной характер и не способствуют решению основной проблемы - выяснению принципов термостабилизации фермента путем его иммобилизации.
Основное внимание исследователей , иммобилизующих глюкоамилазу, направлено на активность препарата и его стабильность в операционных условиях. В связи с тем, что большинство работ выполнено при разных условиях (температура, тип реактора, концентрация субстрата), трудно сопоставить экспериментальные данные. Например, в работе /ИЗ/ показано, что стабильность иммобилизованной на диальдегидцел-люлозе глюкоамилазы различна при использовании ее в реакторах периодического и непрерывного действия. Полученные экстраполяцией данные по термостабильности глюкоамилазы, иммобилизованной на пористом стекле, показали, что при 45 и 50 время полуинактивации равно 508 и 106 суткам /105/. Следует отметить, что термостабильность иммобилизованного препарата исследовалась в присутствии 30%-ного раствора декстрина, который стабилизирует глюкоамилазу /94,114,115/. Кроме того, не изучалась стабильность растворимого фермента в этих же условиях. Таким образом, роль иммобилизации в изменении стабильности глюкоамилазы в этом случае остается о неясной. Ошибку при оценке термостабильности иммобилизованной глюкоамилазы в присутствии субстрата может вызвать использование в реакторе избытка фермента. В этом случае, наблюдаемая скорость инактивации ( по уменьшению степени конверсии) будет ниже истинной. В никоторых случаях, причиной "кажущегося" эффекта стабилизации глюкоамилазы при иммобилизации может послужить сравнение констант скоростей или времен полуинактивации растворимого фермента в отсутствие субстрата и иммобилизованного фермента в операционных условиях (в присутствии субстрата) Кроме того, оценку стабилизации глюкоамилазы путем ее иммобилизации затрудняет и тот факт, что для связывания фермента с матрицей использовались разные, ныне известные, способы иммобилизации (адсорбция, включение в полимерную сетку носителя, микрокапсулирование, ковалентная пришивка к носителю), с применением широкого спектра органических и неорганических носителей. При иммобилизации глюкоамилазы широкое применение получила сорбция фермента на ионообменниках.
Одной из первых попыток получить и использовать нерастворимую глюкоамилазу из Asp.niger была ее иммобилизация на ДЭАЭ-целлюлозе /116,117/. Термостабильность полученных препаратов была ниже чем у нативного фермента. Отмечено, что инактивация сорбированной глюкоамилазы не является кажущейся и не связана с десорбцией фермента /117/. Одним из препятствий эффективной сорбции глюкоамилазы на ионообменниках является то, что ее изоэлектрическая точка и оптимум каталитической активности во многих случаях очень близки и находятся в зоне рН 3,5 - 5,5 (см. стр.9 и табл.1). Это означает, что прочная сорбция белка возможна только в тех облостях рН, где каталитическая активность фермента низкая. Поэтому была предпринята попытка модифицировать глюкоамилазу водорастворимыми сополимерами этилена и ангидрида малеиновой кислоты ОМА), стирола и ангидрида малеиновой кислоты (СМА), и ангидридом янтарной кислоты /118/. Несмотря на то, что фермент модифицирован при помощи ЭМА, в интервале температур 60 -70 был почти в два раза стабильнее нативного, его сорбция на ДЭАЭ-целлюлозе приводила к обратному эффекту,, и в результате иммобилизованная глюкоамилазы по термостабильности не отличалась от нативного фермента. Применяя в качестве сорбента глюкоамилазы из Asp.niger неорганические носители на основе алюмосиликатов или окиси алюминия, модифицированной красителем, была получена незначительная стабилизация фермента, уровень которой по данным работы /115/ установить невозможно. Однако, сравнение времен полуинактивации растворимого фермента /118/ и фермента, сорбированного на неорганических носителях /115/, полученных теми же авторами, показывает, что максимальный эффект стабилизации глюкоамилазы не превышает двух-трех раз.Неоисклю-чено, что в этом случае одновременно с термоинактивацией происходит частичная десорбция фермента с поверхности носителя . Об этом свидетельствует характер зависимости инактивации фермента во времени - в началный период активность сорбированного фермента резко падает, а далее процесс инактивации замедляется. Не исключена возможность существования в препаратах иммобилизованной глюкоамилазы двух форм фермента, отличающийся по термо стабильности. Аналогичное явление наблюдалось при изучении тер мостабильности глюкоамилазы, адсорбированной на синтетическом ионообменнике Amberlite IRA - 93 /119/. При температурах 50 и 60 за 18 часов инкубации активность фермента падала на 60% и 80% соответственно, а в течение последующих суток инкубации потеря ферментативной активности была незначительной.
Иммобилизация глюкоамилазы.Влияние субстрата на термостабильность растворимой и иммобилизованной глюкоамилазы
Постановка экспериментов, описанных в настоящем разделе, определялась следующими задачами: а) выяснить, в какой мере иммобилизация глюкоамилазы на неорганическом носителе стабилизирует ее по сравнению с раство римым ферментом, б) выяснить, какой из двух препаратов глюкоамилазы - раст воримый или иммобилизованный - стабилизируется субстратом в большей степени, и сопоставить масштабы стабилизации раствори мой глюкоамилазы субстратом с масштабами стабилизации фермен та за счет иммобилизации, в) определить, какой из двух субстратов глюкоамилазы - мальтоза (степень полимеризации 2) или мальтодекстрины (сред- нечисленная степень полимеризации 7) - стабилизирует фермент в большей степени, и выявить зависимость максимального эффекта термостабилизации от степени полимеризации субстрата. В связи с тем, что неорганические носители обладают рядом преимуществ по сравнению с органическими, для иммобилизации глюкоамилазы применяли пористое стекло с диаметром пор 1150 А и силохром С-400 Zr . Как показали наши исследования, во всех случаях, не зависимо от концентрации добавленного суб$рата или продукта (маль-тодекстрины, мальтоза, глюкоза) или температуры опыта, кинетика термоинактивации растворимой и иммобилизованной глюкоамилазы подчиняеться первому порядку. На рис.1 приведены зависимости эффективных констант скорости термоинактивации растворимой и иммобилизованной глюкоамилазы от концентрации субстрата в реакционной системе. Как видно, в обоих случаях наблюдается значительная стабилизация фермента субстратом. Так как в условиях эксперимента (75) скорость денатурации рас творимой и иммобилизованной глюкоамилазы в отсутствии субстрата весьма высока (время полуинактивации около 0,5 и 2 мин соответственно), константы скорости инактивации ( k ,схема I) не могли быть определены с достаточной точностью. Помимо этого, константы предельное значение скорости инактивации глюкоамилазы в присутствии высоких (выше 20%) конценрраций субстрата также не могла быть априори использована в расчетах как величина х к (схемаї), так как реакционная система при этих концентрациях достаточно вязкая и может отклонятся по свойствам от идеального раствора, приводя к вторичным изменениям величины предельной константы скорости инактивации.
Наконец, по данным /93/, на скорость термоинактивации глюкоамилазы может влиять величина диэлектрической проницаемости раствора, что также трудно учитывать при высоких концентрациях субстрата. Исходя из этого, для расчета кинетических параметров термоинактивации раство- термоинактивации растворимой (-о-,--) и иммобилизованной на пористом стекле (--) глюкоамилазы, (0,1 М ацетатный буфер, рН 4,5, 75) римой и иммобилизованной глюкоамилазы нами была применена итеративная линеаризация экспериментальных данных (см.стр.65). Пример такой обработки данных для случая термоинактивации иммобилизованной глюкоамилазы в присутствии мальтодекстринов приведен;: на рис.2. Было найдено, что зависимость в координатах уравнения (7) становится линейной при значении кин равном 0,3+0,02 мин . Величины константы диссоциации фермент-субстратного комплекса (К ) и коэффициента стабилизации фермента субстратом (сх ), определены из углового коэффициента полученной прямой и отрезков, отсекаемых на координатных осях, равны 1,3 г/л и 0,06+0,005 соответственно. Очевидно, что мальтодекс-трины, связываясь с иммобилизованное іна неорганическом носителе глюкоамилазой, приводит к увеличению термостабильности фермента приблизительно в 20 раз. Расчитанное предельное значение эффективной константы скорости инактивации иммобилизованной глюкоамилазы в присутствии насыщающей концентрации мальтодекстринов равно 0,018+0,ООЗмин" , в то время как экспериментальная величина кин(эф()) ПРИ концентрации декстринов 300 г/л (что более чем в 20 раз превышает величину константы диссоциации фермент-субстратного комплекса) равна 0,014+0,001 мин . Из этого следует.существенный вывод о том, что концентрация субстрата, превышающая 200 г/л, является насыщающей. Следовательно в этих условиях кин(эфф) равна сх кин. Используя в качестве йш значение, расчитанное при помощи уравнения (7), 0,3 мин , а в качестве кин(Э(ьф) экспериментальное значение 0,014 мин" получим, что с составляет 0,047.
Удовлетворительное совпадение величин сх , полученных разными способами,указывает, во-первых, на адекватность выбранной нами схемы инактивации фермента (схема I) реальному Характерно, что мальтоза, как и мальтодекстрины со средней степенью полимеризации 7, в одинаковой степени стабилизируют фермент относительно г тепловьк воздействий; Приведенные в таблице I величины констант К действительно соответствуют S константам диссоциации фермент-субстратного комплекса (схемаї) На это указывает факт, что величина константы Михаэлиса, определенная из независимого эксперимента по начальным скоростям гидролиза мальтодекстринов растворимой глюкоамилазой равна 1,3+0,1 г/л (при 65) и близка по значению величинам К , опре деленным принципиально другими методами (рис.2) и равными 1,6+ 0,1 г/л и 1,3+0,1 г/л для растворимого и иммобилизованного фер мента (при 75). Тот факт, что концентрация субстрата, превыдающая 200 г/л (при75) является насыщающей, имеет немаловажное значение.Если для препарата иммобилизованной глюкоамилазы с достаточной точностью можно определить константы скорости инактивации как в присутствии насыщающей концентрации декстринов (сх.1 н), так и в отсутствии субстрата ( к ИНК то степень стабилизации субстратом можно определить непосредственно из экспериментальных данных. Показано, что глюкоамилаза, связанная при помощи глу-тарового альдегида с силохромом C-400Zr , активированным - jf-аминопропилтриэтоксисиланом, стабилизируется декстринами примерно в 20 раз, ( k=0,I5 мин , с 1 н=7.10 мин ). Сле дует отметить, что этот нами полученный препарат по термостабильности близок к лучшим образцам иммобилизованной глюкоамилазы, описанным в литературе /130/. Время его полуинактивации в присутствии 30%-ного раствора мальтодекстринов при 65 равно 4,5 суткам. Исходя из результатов, приведенных в настоящем разделе можно заключить следующее: а) Основную роль в стабилизации глюкоамилазы по отношению к тепловому воздействию играет субстрат. Как мальтодекстрины, так и мальтоза увеличивают термостабильность растворимого фермента в 40 раз, в то время как иммобилизация приводит о всего к 6-7-кратному увеличению его термостабильности.
Инактивация глюкоамилазы в ходе реакции
В связи с использованием глюкоамилазы, а также других ферментов на практике, возникает потребность заранее знать необходимое количество фермента, нужного для достижения определенной степени конверсии субстрата за определенное время. Особенно остро эта проблема встает в случае применения растворимой глюкоамилазы в реакторах периодического действия, в условиях, когда на ряду с гидролизом субстрата происходит термоинактивация фермента. Использование избытка фермента приводит к неизбежной потере части ферментативной активности. Определе/ ние же оптимальных условий ферментативной реакции часто требует продолжительного эксперимента. Теоретический подход, позволяющей решит эту проблему, был предложен в работе /137/. В его основе лежит предположение, что образование фермент-субстратного комплекса полностью предохраняет фермент от инактивации, а свободный фермент теряет активность со скоростью, описываемой константой первого порядка. Кинетическую схему такого процесса можно записать в следующем виде: В разделе 1.2. было показано, что фермент-субстратный комплекс растворимой глюкоамилазы при 75 инактивируется в 40 раз медленнее свободного фермента. Кроме того, эффект стабилизации субстратом увеличивается при понижении температуры. В разделе 1.3. также было показано, что термоинактивация комплекса фермент-продукт происходит со скоростью, близкой к скорости инактивации фермент-субстратного комплекса ( схя /3 ). Таким образом, при математической обработке кинетической схемы (14) величины х к и кин можно не учитывать, так как сх кин Л&кин кин. Следовательно, "минимальная" схема термоинактивации глюкоамилазы в присутствии субстрата должна соответствовать схеме (13). определяли таким образом, чтобы избежать возможной термоинактивации глюкоамилазы в ходе эксперимента. По этой причине интервалы времени, через которые отбирались пробы при определении начальных скоростей гидролиза мальтозы не превышали 2-х мин. Полученные данные показали, что в присутствии 2,78. 10 - 5,5.10 М мальтозы в течение 5-Ю мин термоинактивация пдакшамидазы практически не происходит. Величина константы термоинактивации первого порядка к для глюкоамилазы тоже определена из независимого эксперимента при 65 равна 4,51+ 0,3.10-2 мин"1. На рисунке 10 приведена теоретическая кривая гидролиза мальтозы растворимым ферментом в указанных условиях.
Точки на кривой соответствуют экспериментальньм данным. Хорошое совпадение теории и эксперимента показывает, что кинетическая схема (13) достаточно точно описывает процесс термоинактивации глюкоамилазы в ходе реакции, а уравнение (28) применимо для математического моделирования кинетических кривых этого процесса. 1.7. 0 возможном пределе термостабильности иммобилизованной глюкоамилазы Анализ литературных данных и результатов настоящей работы позволяет предположить, что термостабильность иммобилизованной глюкоамилазы имеет определенный предел. Во-первых, в нстоящее время не известно ни одного случая повышения термостабильности глюкоамилазы хотя бы в десять раз за счет ее иммобилизации ( в интервале температур 50-70) (см.лит.обзор,разд2.2.). В присутствии субстрата, кажущаяся термостабильность иммобилизованного фермента обусловлена главным образом термостабильностью фермент-субстратного комплекса. Во-вторых, увеличение количества химических связей фермент-носитель в случае иммобилизированной глюкоамилазы приводит к дестабилизации фермента (см.разд.1.5.). Вывод о пределе термостабильности глюкоамилазы представляется весьма важным как с теоретической, так и с практической точек зрения, поскольку позволяет выявить реальные возможности повышения устойчивости глюкоамилазы к тепловым воздействиям. В таблице 3 приведены данные по термостабильности глюкоамилазы, иммобилизованной с применением различных сшивающих агентов на различных носителях Как видно, константы скорости термоинактивации препаратов являются близкими и в любом случае не выявляют принципиально значимых эффектов в стабилизации иммобилизованного фермента. Попытка повысить термостабильность глюкоамилазы путем иммобилизации в присутствии субстрата (иммобилизация фермент-субстратного комплекса) тоже не привела к повышению ее термоста бильности (табл.3). Термостабильность иммобилизованной глюкоамилазы пытались повысить путем ее химической модификации. В cv, связи с тем, что в кислой среде основание Шиффа, образующееся во время иммобилизации между е -аминогруппами белка и глутаро-вым альдегидом может гидролизоватся, было проведено восстановление -и=сн- связи боргидридом натрия. Как видно из табл.3, и в этом случае константа скорости инактивации препарата практически не изменилась.
Повышение гидрофобности глобулы глюкоамилазы (модификация акролеином) или изменение структуры поверхности глобулы за счет замены положительно заряженных функциональных групп на отрицательно заряженные (модификация янтарньм ангидридом) привело к увеличению скорости термоинактивации в 6 и 3 раза соответственно. На следующем этапе эксперимента использовали наложение на молекулу фермента внутримолекулярных химических "сшивок",что часто приводит к значительной стабилизации фермента /112/. Внутримолекулярную"вшивку" проводили через аминогруппы фермента с помощью глутарового альдегида или диметиладипимидата. Для образования "сшивок" через карбоксильные группы, они предварительно активировались водорастворимым карбодиимидом с последующей обработкой диаминами, содержащими различное количество метиленовых групп (тетра-, гекса- и додекаметилендиамин). Следует отметить, что после модификации глутаровым альдегидом и додекаметилендиамином скорость термоинактивации иммобилизованной глюкоамилазы практически совпадала со скоростью инактивации исходного фермента. В остальных случаях, модификация приводила к двухкратному увеличению скорости термоинактивации препаратов. Из литературных данных /38,41/ известно, что термостабильность глюкоамилазы сильно зависит от длины углеводного остатка (в основном состоящего из глюкозы, маннозы и галактозы), входящего в состав молекулы фермента. В связи с этим, была предпринята попытка стабилизовать иммобилизованную глюкоамилазу путем "пришивки" к ее молекуле дополнительного количества углеводов. Для этой цели применяли глюкозамин и окисленные перио- ,( датом натрия декстрины. В первом случае глюкозамин присоединяли либо к исходному препарату иммобилизованной глюкоамилазы, либо к ранее описанному препарату сукцинилглюкоамилазы при помощи водорастворимого карбодиимида. Во втором случае модификация иммобилизованного фермента происходила за счет аминогрупп белка и альдегидных групп, образующихся во время окисления декстринов периодатом натрия. Однако, в результате применения такого пути модификации также не удалось добится повышения термостабильности иммобилизованной глюкоамилазы. Таким образом, следует заключить, что на данном этапе исследований проведенных нами или вообще описанных в литературе, термостабилизация известных препаратов иммобилизованной глюкоамилазы в присутствии субстрата ограничена определенным пределом, зависящим в первую очередь от термостабильности фермент-субстратного комплекса, а не от способа иммобилизации или химической модификации фермента-(включая вид носителя и способ пришивки глюкоамилазы к нему). Насколько нам известно, это единственный пример в практике иммобилизации ферментов, где выявлен определенный предел термостабилизации препарата, не зависимый от характера иммобилизации.