Введение к работе
Актуальность темы, У аэробных оргаїшшон, от простейших до млекопитающих, активные формы кислорода и пероксиды образуются в нормально функционирующих клетках. Для их инактивации и ходе эволюции сформировалась сложная защитная система, включающая ферменты: суиероксиддисмутазу, каталазу, глутатионпсроксидазу и низкомолекулирные антиокснданты. Однако при определенных услониях содержание,.активных форм кислорода и нероксидон в отдельных клетках и тканях может многократно увеличиться и превысить дегоксицирующие возможности защитной системы. В этом случае разминается окислительный стресс, характерной особенностью которого является активация снободнорадикальных процессов, в том числе и иерекисного окисления липидов (ПОЛ). Наиболее распространенными причинами, вызывающими развитие окислительного стресса, являются воздействия на организм неблагоприятных физико-химических факторов внешней среды и, и первую очередь, радиации- Существуют многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие об образовании продуктов ПОЛ при ишемии и особенно при рсперфузии печени, ночек, скелетных мышц, миокарда, головного мозга. О существенном вкладе снободнорадикальных процессов и повреждающее действие негативных факторов внешней среды свидетельствует хороший протекторный эффект, который оказывают и этих условиях различные по своей структуре антиоксиданти: ионол, «-токоферол, производные 1,4-діііидроіііфИДі(ііа. Тем не менее, существующие в настоящее время представления о закономерностях инициирования и регуляции снободнорадикальных процессов, молекулярных механизмах нх повреждающего действия и роли при развитии конкретных патологических процессов достаточно схематичны и спорны. В значительной степени это обусловлено недостатком экспериментальных данных о специфике протекания снободнорадикальных процессов, механизмах их регуляции, путях детоксикацин образующихся продуктов и патогенетических последствиях их накопления в различных тинах клеток при воздействии радикалииициирующих факторен). Данная проблема является своего рода "точкой роста" современной науки, в решении которой объединяются усилия химиков, биологов и медиков.
Важной практической задачей является разработка фармакологических способов воздействия на свободнорадикальные реакции с целью снижения негативного влиянии окружающей среды на
организм. Особенно актуальны эти проблемы для Беларуси с сё высоким уроннем индустрии, где постоянно действующим фактором стало внешнее и внутреннее радиационное облучение. В настоящее время получены -убедительные экспериментальные данные, свидетельствующие, что широко используемые витамины Е и С являются мощными биоантиокнелитслями. Выполнены единичные исследования, указывающие, что флавоноиды, входящие в группу витамина Р, также являются антиоксидантами. Однако к началу выполнения нашей работы (1982-1983) конкретные механизмы антиоксидантного действия флавоноидон в значительной степени оставались нсвыяснеными, что определило актуальность проведения дальнейших исследований и этом направлении.
В Бслгосунивсрсктетс, в НИЛ биоэнергетики при кафедре физиологии человека и животных синтезирована группа новых биологически активных соединений на основе о-бензохинона. Выявлен хороший защитный аффект этих соединений при гиноксических и реперфузионных повреждениях. Мы предположили, что защитное действие производных о-бензохинона в значительной степени обусловлено антиоксидантними-свойствами, однако эта гипотеза нуждалась в детальном экспериментальном доказательстве.
Определение антиоксидантного действия биологически активных соединений и исследование соответствующих молекулярных механизмов требует использования специфичных и достаточно простых методов исследования. Ряд таких методов: ТБК-тест, снсктрофотомстрическос определение диеновых конъюгатов, хроматографический анализ - использовались в исследовательской (фактике на протяжении нескольких десятилетий. Вместе с тем, к началу выполнения наших исследований оставались нерешенными некоторые проблемы, связанные с особенностями использования этих методов для исследований in vitro и особенно in vivo. Отсутствовали зкенериментальные данные о стабильности различных продуктов ПОЛ в биологическом материале в процессе его подготовки к анализу и. при хранении. Существовала потребность разработки новых методов разделения продуктов ПОЛ с- помощью высокоэффективной жидкінгпіой хроматографии. *
Цель и задачи исследования. Основной целью данного исследования явилось выяснение возможных 'механизмов аптиокиелнтслыюго действия природных и синтетических многоатомных фенолов и хининов при инициировании снободнорадикальпых процессов
.о
и различных биологических системах; оценка эффективности их
защитного действия при развитии и клетке окислительного стресса. В
соответствии с этой целью н диссертационной работе решались
слсд)іощис задачи: ' '
!. Определить оптимальные показатели, характеризующие процессы перекисного окисления лнпидон н модельных системах и уелониях in vivo, разработать ноіи.іе и модифицировать существующие экспериментальные методы их определения.
-
Установить наличие антиоксидантного дейстиия у о-бензохпнонов и модельных системах перекисного окисления липидон и in vivo. Исследовать окпслнтсльно-носстаноиитсльные реакции, обуславливающие антиоксидантній; действие о-бешохинонов.
-
Сравнить эффективность антиоксидантного действия о-бензохнпонов, выявил, особенности и возможные их преимущества но сравнению с друї ими антиоксидантами.
-
Исследовать механизмы и особен носій антиоксидантного действия фланоиоидон при инициировании перекисного окисления лшшдов и различных биологических системах на примере киерцетина и рутина.
-
Изучить роль сиободнорадикальных реакций и повреждении галогеналкаиами системы микросомального окисления эндонлазматического ретикулума- печени и .особенности защитного действии о-бензохшюнон.
-
Оценить эффективность и исследонать механизмы защитного действия синтетических многоатомных фенолов и хинонои при разни тип окислительного стресса и интактных клетках
Научная новизна. Выявлена группа принципиально новых ингибиторов сиободнорадикальных реакций хинбнной структуры - о-бензомиювон. Показано, что зги соединения способны включаться но «ну три клеточные окислите л ыю-носстановительные процессы, н результате которых постоянно регсііерир)ются носстансшленныс формы о-бензохиноиов, обладающие мощным антиоксидантним действием. На оенонании полученных экспериментальных данных определены количественные параметры, характеризующие эффективность антиоксидантного дейстиия о-бензохинонои, и выявлены соединения, значительно более аффективные, чем широко используемый антиоксидант - ионол. Установлено, что о-бензохинопы обладают хорошим протекторным аффектом при моделировании окислительного повреждении в интактных клетках. Среди о-бензохинонои выявлены
Л-
соединения, избирательно иіігибнруюіцнс различные типы снободнораднкальных реакций.
Впервые экспериментально подтверждено, что антиоксидантнім: действие рутина и кнерцетина, нолифенолов, входящих и группу витамина 1\ in vitro обусловлено их хелатирующнми и антираднкальнымн свойствами. Найдено, что эти соединения способны оказывать антираднкальное действие как на стадии инициирования (процесс генерации активных форм кислорода), так и на стадии продолжения цени, нзаимодеіістнун с алкилперекисными радикалами. Определеін>і константи скорости реакции рутина и кнерцетина с анион-радикалом кислорода. Показано, что кверцетин яиляечся значительно более аффективным антирадикальным агентом, чем ругни. Впервые обнаружено, что киерцетпн способен генерировать анион-радикал кислорода при окислении, и эта реакция может быть использована для определения фермента супероксидднемугазы.
Впервые получены прямые экспериментальные доказательства того, что гидропероксиды нолиненасыщенных жирных кислот, входящих и состав экзогенных фосфолипидов и фосфолпнидов внутриклеточных мембран, способны фермситатшшо восстанавливаться и нечеии в соответствующие оксисосдинения без предварительного гидролиза с помощью фосфолипазы Аг.
Разработан оригинальный подход, позволивший получить экспериментальные данные, свидетельствующие, что in vivo инактивация системы мнкросомалыюго окисления печени крыс, происходящая и первые часы после отравления тстрахлорметаном. нмзвана не процессами перекисного окисления линпдов, а обусловлена, по-видимому, галоалкилированисм соответствующих ферментон. Обнаружено также, что наблюдающееся в более поздние сроки (через 48 ч) снижение содержания в печени ключевых ферментон антиокислительной защиты - супероксидднемугазы н каталазы - также не зависит от ПОЛ.
Теоретическая и практическая значимость работы. В результате выполнепых исследований выявлена группа новых, высокоэффективных антиоксидантов, перспективных для последующих работ но разработке новых' фармакологических препаратов. Имеющиеся среди них соединения, избирательно ингкбирующне различные типы свободнораднкальных реакции, могут быть использованы и качестве фармакологического инструмента при исследовании механизмов окислительного повреждения клеші.
»
Полученные іі работе пошле данные о механизмах про- и антиоксидантного действия рутина и киерцетнна следует учитывать и экспериментальных и клинических исследованиях по использованию природных полнфенолов, входящих и группу витамина Р, и качестве профилактических и терапевтических с|>едстн.
Полученные и процессе выполнения работы результаты, сшідетельстнуїоіцне о способности цитонлаэматнческнх белков печени восстанавливать гидроперокепды фосфолинидов без их предварительного гидролиза, послужили экспериментальным и теоретическим обоснованием для последующих работ но выделению, очистке н изучению иммунологических свойств нового фермента -мономерпон глутатноииероксидазы.
Полученные при исследовании окислительного повреждения н различных клетках данные позволили подложить оригинальную модель функционирования антиокислительных защитных систем клетки при ра линии снободнораднкальных реакций.
Разработанные орііпшальньїс методики определения и биологическом материале диеноных коныогатов (А.С. 1185242 СССР, МКИ 01 № 33/48); сунерокенддисмутазы (А.С. 1521773 СССР, МКИ 01 № 33/573); ТБК-активных продуктов и анаэробных условиях (Вонр.мед.химии', 1УЬ'7, №3, С.115-118) использовались но многих научных и клинических учреждениях, среди которых: Белгосушівсрсиїсг, Минский государственный медицинский институт, НИИ.особо чистых биопрепаратов, НИИ высокомолекулярных соединений, Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии, НИИ скорой помощи им. Склифосоиского, Свердловский медицинский институт.
Материалы диссертации были использованы и учебной работе кафедры физиологии человека и животных Бслгосуннверснтстн,
<)уп(>н)1ыс положения, выносимые на аишшпу.
I. Производные о-бензохинона являются группой новых, эффективных синтетических ингибиторов свободнорадикальных процессов. Антиокепдаитное действие обусловлено способностью восстановленных форм этих соединений эффективно перехватывать свободные радикалы. В биологических системах существуют механизмы, обеспечивающие постоянную регенерацию носегамонлениых форм о-бепзохинонов.
-
Антиоксидантної' действие руїнна и кнерцетина in vitro обусловлено их хела тирующими и антнраднкальными свойствами. Антирадикалыюс действие этих флавопоидов возможно как на стадии нницмпронапия, так и на стадии продолжения перскиспого окисления линидон.
-
В печени осущестиля^етси эффективная дезактивация радикальных метаболитов ксенобиотиков посредством механизма, включающего реакцию радикалов с иолинснасыщенными ациламп фосфолниидов и последующее ферментативное восстановление образующихся гидронероксидом фосфолшшдон без их предварительного гидролиза.
4. Цитопротекторкос действие о-бензохпнонон при инициировании окислительного повреждении изолированных клеток обусловленно ингибированием свободнорадикальных реакций. Реализация этого механизма in vivo обеспечивает защитный эффект о-бензохинонон при ишемии-реперфузии органон и тканей.
Апробации работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на заседании Минского отделения Белорусского физиологического общества (1986 г.); на VI (1983 г., Гродно) и на VII (1987 г., Витебск) съездах БФО им.И.П.Павлова; на V республиканском съезде фармацевтов, фармакологов и токсикологов (1989 г., Минск); на Всесоюзных семинарах "Кислородные радикалы в химии, биологии и мсдицшіс"(1984 г., 1986 г., 1990 г., 1992 г., Минск; 1987 г., 1988г., 1989 Рига; 1991 г., Ленинград); на V Всесоюзном съезде фармакологов (1982 г., Ереван); на VI Всесоюзной конференции по окислению органических соединений в жидкой фазе "Окисление - 86"(1986 г., Львов); на Всесоюзном совещании "Транспорт кислорода н антиоксидантний системы" (1989 г., Гродно); на Международном симпозиуме "Активные формы кислорода в биологических системах (1986 г., Варна, Болгария); на II и III Международных симпозиумах "Хелатирукяцис агенты в фармакологии, токсикологии и терапии" (1987 г., 1990 г. Пльзень, ЧССР); на XII Международном симпозиуме по структуре и функции эритроидных клеток (1989 г. Берлин); на 58 и 64 ежегодных конференциях Японского биохимического общества (1985 и 1991 гг., Токио. Японии); на V Международном конгрессе "Активный кислород, лшшдные пероксиды и антиоксиданти" (1991 г., Киото, Япония).
Публикации. Основные научные результаты, включенные и диссертацию, отражены и 56 вышедших из печати научных работах и четырёх авторских свидетельствах на изобретения.
(>Гп>см и структура шесерпшшш. Диссертация изложена на 275 страницах машинописного текста, содержит 52 таблицы и ЗК рисунков и состоит из введения, обзора литературы, глаш>1 "Материалы и методы исследовании", пяти глав собственных исследований, заключении, выводов и указатели литературы, нкліочаюіцего 427 источников. Диссертации написана на русском языке.