Введение к работе
Актуальность исследования. Наиболее ярким проявлением иммунорегуляции беременности является формирование толерантности к аллоантигенам плода. Нарушение этого процесса приводит к различным осложнениям беременности вплоть до ее потери. Одним из самых тяжелых осложнений является преэклампсия (ПЭ), занимающая третье место в структуре причин материнской смертности и являющаяся одной из основных причин заболеваемости и смертности новорожденных (Сухих Г.Т., Мурашко Л.В., 2010). Несмотря на интенсивные исследования, проводимые в области изучения этиологии и патогенеза ПЭ, к настоящему времени не существует единой теории, а также отсутствуют адекватные методы прогноза и диагностики ПЭ.
Ключевым патогенетическим звеном в развитии ПЭ принято считать плацентарную ишемию, которая способствует формированию условий для реализации системного воспалительного ответа (СВО) и эндотелиальной дисфункции (Redman C., 2004; Espinoza J., 2006). Как известно, развитие СВО и эндотелиальной дисфункции сопровождается изменением функционального состояния клеток врожденного и адаптивного иммунитета (Catarino C., 2012), а также эндотелиоцитов, что отражается в экспрессии активационных молекул и продукции гуморальных факторов, спектр которых (за исключением системы цитокинов) остается малоизученным при ПЭ.
Провоспалительные воздействия на эндотелиальные клетки с
неизбежностью должны затронуть молекулярную архитектуру гликокаликса, что
проявляется в синтезе гипогликозилированных углеводных структур и
изменении представленности функциональных углеводных остатков
гликокаликса, шеддинге его компонентов, и появлению их в крови (Scott D.W., 2013). Вследствие этого возникают структурные изменения гликокаликса, что ведет к формированию DAMP , 2013; Heil M., 2014; Gaudet A.D., 2014) (Danger Associated Molecular Patterns), то есть неоантигенов, к которым могут появиться аутоантитела, что сдвигает гомеостатический баланс в пуле естественных антител, существующий в норме (Lutz H.U., 2009). Значительная часть естественных антител человека направлена к гликанам поверхности клетки, при патологиях репертуар этих антител меняется, что справедливо и по отношению к антителам, мишенями которых являются гликаны гликокаликса (Бовин Н.В., 2013).
Несмотря на многочисленные исследования последних лет, в литературе отсутствуют однозначные данные об участии антифосфолипидных антител
(АФА) и антиэндотелиальных антител (АЭАТ) в патогенезе ПЭ; профиль анти-гликановых (анти-углеводных) антител при физиологической и осложненной беременности остается неизученным; несмотря на идентификацию общих антигенов, взаимосвязь между АФА, АЭАТ и антигликановыми антителами (АГАТ) остается не выясненной; существующие на сегодняшний день данные о растворимых формах молекул клеточной адгезии (МКА) и возможностях их использования для диагностики и прогноза ПЭ весьма противоречивы.
Гуморальные факторы иммунитета являются перспективными
биомаркерами для малоинвазивной диагностики и прогноза развития патологии беременности. Кроме этого, их уровень в крови может быть параметром, косвенно отражающим активацию/супрессию иммунного ответа, что также является значимым для изучения механизмов развития болезни. Актуальной задачей представляется также идентификация патогенетически значимых аутоантител, специфичность которых позволит иметь представление о детерминантах развития заболевания.
Цель исследования: определить особенности спектра аутоантител и растворимых форм молекул клеточной адгезии при преэклампсии и их роль в развитии заболевания.
Задачи исследования
-
Адаптировать методику выявления АЭАТ в сыворотке периферической крови к антигенам эндотелиальных клеток линии EA.hy 926 с помощью проточной цитометрии. Определить активность связывания АЭАТ с эндотелиальными клетками у пациенток с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией.
-
Провести мониторинг содержания растворимых форм молекул клеточной адгезии (sICAM-1, sVCAM-1, sL-селектина и sE-селектина) в течение физиологической беременности и беременности, осложненной преэклампсией на разных сроках гестации.
-
Охарактеризовать углеводный фенотип структур плаценты у пациенток с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией разной степени тяжести.
-
Выявить антитела к фосфолипидам мембран и фосфолипидсвязывающим белкам (кардиолипину, фосфатидилсерину, аннексину V, протромбину и кофакторному белку 2-гликопротеину І) у пациенток III триместра беременности в норме и при преэклампсии.
-
Выявить антитела к гликанам и охарактеризовать их углеводную специфичность у пациенток III триместра при физиологической беременности и осложненной развитием преэклампсии.
-
Исследовать взаимосвязь между изученными показателями гуморального звена иммунитета.
Научная новизна исследования
Проведено изучение маркеров эндотелиальной активации (АЭАТ и растворимых форм МКА) на разных сроках беременности в норме и при ПЭ, а также проанализированы взаимосвязи между изученными факторами. Установлены как общие для изучаемых групп пациенток связи, отражающие необходимый уровень активации клеток, так и характерные только для нормы или только для патологии корреляционные связи, что свидетельствует о разном состоянии гуморальных систем, связанных с воспалительным ответом и активацией эндотелия при ПЭ. В представленном дизайне исследование не имеет аналогов.
В ходе работы установлено, что паттерн гликозилирования структур плаценты различен при ПЭ тяжелой и умеренной степени, что может быть причиной срыва механизмов формирования толерантности к плоду.
Проведено исследование широкого спектра антигликановых антител (АГАТ) при физиологической беременности и ПЭ и охарактеризована их углеводная специфичность, что позволяет сделать заключение об углеводных детерминантах, определяющих формирование антител при ПЭ. Представленная работа является первым комплексным исследованием аутоантител (АФА, АЭАТ, АГАТ) специфичных к широкому спектру антигенов.
Практическая значимость
Метод проточной цитометрии адаптирован для выявления антител к эндотелиальным клеткам в норме и при ПЭ, подобраны условия для проведения анализа. Адаптированный метод может быть использован для выявления АЭАТ при различных патологических состояниях, сопровождающихся эндотелиальной активацией, и открывает возможности для изучения клинической и диагностической значимости АЭАТ.
С помощью микрочипового метода выявлен спектр аутоантител к гликанам, что открывает перспективы для использования данного метода в научных и клинических исследованиях. Полученные результаты могут стать основой для выявления диагностической сигнатуры антител и разработки микрочиповых тест-систем для диагностики ПЭ, а также оценки степени ее тяжести.
Положения, выносимые на защиту
-
При преэклампсии в периферической крови матери обнаруживается комплекс гуморальных факторов, связанных с реализацией чрезмерного воспалительного ответа (растворимые формы МКА) и свидетельствующий об аутоиммунном ответе против эндотелия (АЭАТ). Высокая активность связывания АЭАТ(IgM) c антигенами эндотелиальных клеток наблюдается при физиологической беременности и преэклампсии, что демонстрирует функциональную гетерогенность антител. Активность связывания АЭАТ(IgG) при преэклампсии повышена в третьем триместре, что указывает на их роль в патогенезе заболевания. Изменения содержания растворимых форм МКА взаимосвязаны между собой как в норме, так и при патологии и зависят от активности связывания аутоантител в определенные периоды беременности.
-
Физиологическое развитие плаценты сопровождается формированием детерминированного углеводного кода – нормального паттерна гликозилирования структур плаценты, для которого характерно определенное количество функциональных углеводных остатков, служащих лигандами для ингибиторных рецепторов клеток иммунной системы. Паттерн гликозилирования структур плаценты при преэклампсии, напротив, характезизуется сниженным количеством терминальных остатков сиаловых кислот (лигандов для ингибиторных рецепторов) и повышенным количеством терминальных остатков маннозы, которые служат лигандами для эндогенных лектинов С-типа. Выраженность изменений гликозилирования структур плаценты зависит от степени тяжести преэклампсии: наиболее выраженные изменения выявлены при тяжелом течении заболевания.
3. Беременность, осложненная преэклампсией, характеризуется
интенсивным гуморальным ответом на углеводные антигены и антигены
эндотелиальных клеток, превосходящим наблюдаемый при физиологической
беременности. Повышенный уровень антител к гликанам – рецепторам
эндогенных лектинов и гликанам гликокаликса может явиться фактором,
свидетельствующим о нарушении иммунорегуляции гестационного периода.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были представлены на 11 и 15 Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя» (Москва, 2010, 2014 г.г.); V и VII международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2011, 2013 г.г.); XII международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии,
аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2013): 27th European Congress of Pathology (Лондон, 2014); VII Всероссийской научной конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» (Ростов-на-Дону, 2015); VIII региональном научном форуме «Мать и Дитя» (Сочи, 2015).
Диссертационная работа обсуждена на заседании межотделенческой апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (25.06.2015, протокол № 5).
Объем и структура диссертации