Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Материалы и методы 46
1.1. Препараты 46
1.2. Лабораторные животные 48
1.3. Штаммы S. pneumoniae 48
1.4. Получение иммунных мышиных сывороток к S. 48 pneumoniae серотипа 14
1.5. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) 48
1.6. Иммунизация мышей 50
1.7. Определение экспрессии Толл-подобных рецепторов 50
1.8. Культивирование дендритных клеток 51
1.9. Анализ фенотипа дендритных клеток 52
1.10. Уровень цитокинов 52
1.11. Бактерицидная активность лейкоцитов 52
1.12. Характеристика поверхностных антигенов мононуклеарных лейкоцитов селезенки мышей 53
1.13. Протективная активность 54
1.14. Превентивная активность сыворотки 54
1.15. Опсонизирующая активность сыворотки 55
1.16. Методы статистической обработки данных 55
ГЛАВА 2. Сравнительное изучение антигенной активности тетра-, гекса- и октасахарида 56
2.1. Ингибирование антител к капсульному полисахариду S.pneumoniae серотипа 14 синтетическими олигосахаридами с разной длиной цепи 56
2.2. Исследование способности специфических антител к бактериальному капсульному полисахариду связывать тетра-, гекса и октасахарид в составе биотинилированных конъюгатов 59
2.3. Отработка условий для разработки экспериментальной ИФА тест-системы на основе конъюгированного гексасахарида 64
.3.1. Выбор оптимальной концентрации гексасахарида, конъюгированного с БСА, для сорбции на планшетах 64
2.3.2. Специфичность конъюгированного гексасахарида, 65
сорбированного на планшете
ГЛАВА 3. Активация врожденного иммунитета синтетическим гексасахаридом, конъюги рованнымсбса 68
3.1. Действие конъюгированного гексасахарида на экспрессию Толл подобных рецепторов 68
3.2. Влияние конъюгированного гексасахарида на фенотип
дендритных клеток и продукцию ими цитокинов 71
3.3. Влияние конъюгированного гексасахарида на уровень цитокинов в сыворотке крови мышей 75
3.4. Бактерицидная активность сыворотки крови мышей, иммунизированных конъюгированным гексасахаридом 77
ГЛАВА 4. Активация адаптивного иммунитета синтетическим гексасахаридом, конъюгиро ваннымсбса 80
4.1. Антительный ответ к капсульному полисахариду при иммунизации конъюгированным гексасахаридом 80
4.2. Протективная активность конъюгированного гексасахарида в отношении S. pneumoniae серотипа 14 85
4.3. Превентивные свойства сыворотки крови мышей, иммунизированных конъюгированным гексасахаридом, сорбированным на гидроксиде алюминия 88
4.4. Опсонизирующая активность сыворотки мышей, иммунизированных конъюгатом гексасахарида 91
4.5. Действие конъюгированного гексасахарида на иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов мышей 92
Заключение 97
Выводы 105
Алгоритм оценки иммунологической активности синтетических олигосахаридов 1 7
Литература
- Получение иммунных мышиных сывороток к S. 48 pneumoniae серотипа
- Отработка условий для разработки экспериментальной ИФА тест-системы на основе конъюгированного гексасахарида
- Влияние конъюгированного гексасахарида на уровень цитокинов в сыворотке крови мышей
- Превентивные свойства сыворотки крови мышей, иммунизированных конъюгированным гексасахаридом, сорбированным на гидроксиде алюминия
Получение иммунных мышиных сывороток к S. 48 pneumoniae серотипа
Иммунитет против S. pneumoniae и других инкапсулированных бактерий, таких как Heamophilus infuenzae типа b и Neisseria meningitidis, определяется преимущественно продукцией антител против капсульного полисахарида. В связи с этим, активным действующим началом всех коммерческих пневмококковых вакцин являются капсульные полисахариды наиболее распространенных серотипов S. pneumoniae, а в экпериментальных вакцинах нового поколения используют целевые синтетические олигосахариды, состоящие из нескольких (от 2 и более моносахаридов), отражающие фрагменты цепи капсульного полисахарида соответствующих серотипов S. pneumoniae.
Среди наиболее часто встречающихся при пневмококковой инфекции штаммов пневмококка заслуживает внимания капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 14. Штаммы этого серотипа широко распространены в различных географических регионах и их наиболее часто выделяют у детей [24, 80, 82]. Есть данные, указывающие на то, что в составе коммерческих пневмококковых вакцин капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 14 обладает слабой иммуногенностью [18, 54, 101, 178]. Показано, что у детей до достижения ими 5-летнего возраста образования высоких титров антител к серотипам 14, 6А, 19F и 23А после вакцинации не происходит, тогда как к другим серотипам пневмококка выработка антител может начинаться значительно раньше (после достижения детьми одного года) [18, 92].
Капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 14 включен в состав всех коммерческих пневмококковых вакцин.
Полисахаридная 23-валентная пневмококковая вакцина - Пневмо-23 (фирма "Sanofi-Pasteur", Франция). Коммерческая вакцина на основе 23 капсульных полисахаридов наиболее распростаненных серотипов S. pneumoniae [147, 149]. Одна доза вакцины (0,5 мл) без адъюванта содержит капсульные полисахариды S. pneumoniae серотипов (1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7F, 8, 9N, 10А, ПА, 12F, 14, 15D, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F, 33F - по 25 мкг каждого). Вакцина обеспечивает защиту до 73% привитых и снижает риск инвазивных инфекций у 83% взрослых [45, 74, 143]. Установлено, что вакцина является безопасной и иммуногенной для каждого серотипа, входящего в ее состав. Существуют разногласия в эффективности вакцины при её применении в группах риска [25, 93, 145]. Сообщалось о неэффективном иммунном ответе после вакцинации пожилых людей. Однако мета-анализ клинической эффективности вакцинации полисахаридным препаратом показал отсутствие достоверных различий в уровне антител у взрослых и лиц старшего возраста [74]. Тем не менее, с возрастом авидность антител снижается, что коррелирует с увеличением восприимчивости к пневмококковой инфекции [150]. Доказана слабая иммуногенность полисахаридных вакцин при иммунизации детей [21, 118, 141] и, следовательно, вакцинация ими в детском возрасте неприемлема.
Капсульный полисахарид является Т-незвисимым антигеном и не способен вызывать IgG-ответ и формирование иммунологической памяти у детей до достижения ими 5-летнего возраста вследствие незрелости иммунной системы. Более того, при оценке клинического эффекта 14-валентной полисахаридной пневмококковой вакцины на заболеваемость инфекциями верхних дыхательных путей в двойном слепом исследовании при участии 405 детей в возрасте от 6 месяцев до 5 лет установлено, что у детей до 2-х лет после вакцинации заболеваемость острым тонзиллитом была существенно выше, чем в контрольной группе [46]. Это свидетельствует об иммуносупрессивном действии полисахаридных вакцин у детей.
Для преодоления этого недостатка полисахаридных вакцин и индукции Т-зависимого иммунного ответа с образованием высокоаффинных антипневмококковых IgG-антител, обычно используют метод конъюгации полисахаридов с белком-носителем, в качестве которого чаще всего используют рекомбинантный дифтерийный анатоксин CRM197 (cross-reactive material - CRM197) или столбнячный анатоксин, а в экспериментальных исследованиях широкий перечень белков: бычий сывороточный альбумин, овальбумин, динитрофенилированный гемоцианин лимфы улитки (keyhole limpet hemocyanin- KLH) и некоторые другие белки.
Конъюгатные вакцины. Конъюгатные вакцины, представляют собой набор очищенных капсульных полисахаридов актуальных штаммов пневмококка, конъюгированных с белком-носителем. Разработаны различные конъюгированные вакцины, содержащие в своем составе от 7 до 14 полисахаридов S. pneumoniae. Наиболее перспективной является вакцина Превенар-13 (фирма "Pfizer", США), зарегистрированная в России и состоящая из капсульных полисахаридов 13 серотипов S. pneumoniae [143]. Одна доза вакцины (0,5 мл) содержит капсульные полисахариды S. pneumoniae серотипов (1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 23F - по 2,2 мкг каждого полисахарида, за исключением 6В - 4 мкг, сорбированных на фосфате алюминия - 0,125 мг). Ещё одна вакцина - 10-валентная Синфлорикс (фирма "GlaxoSmithKline", Великобритания). Одна доза препарата (0,5 мл) содержит капсульные полисахариды S. pneumoniae серотипов (1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F, 23F). Часть капсульных полисахаридов вакцины конъюгировано с D протеином {{.influenzae типа Ь, часть с дифтерийным анатоксином, часть со столбнячным анатоксином. В качестве адъюванта использован алюминия фосфат - 0,5 мг [144]. Эти вакцины иммуногенны у детей, а у взрослых интесивность иммунного ответа сопоставима с действием 23-валентной полисахаридной вакцины.
Проведена оценка клинической эффективности и безопасности и других конъюгатных вакцин [36, 38, 58, 146]. В качестве белка-носителя использовали либо рекомбинанатный дифтерийный анатоксин CRM197, либо белок наружной мембраны менингококка группы В, либо столбнячный анатоксин. Некоторые из этих конъюгатных вакцин оказались эффективными в отношении профилактики пневмонии, вызванной S. pneumoniae, и были лицензированы [102], в меньшей степени, они были успешными при профилактике среднего отита [168]. К недостаткам конъюгатных вакцин относится наличие в их составе проблемных серотипов пневмококка, например, 6В [163] Сложность проведения конъюгации капсульного полисахарида серотипа 6В с белком-носителем может оказать влияние на его иммунологические свойства [164]. Это подтвержается тем, что в составе вакцины Превенар-13 его количество в 2 раза больше, чем капсульных полисахаридов других серотипов. Стоимость конъюгатных вакцин высокая и они не пригодны для осуществления массовых программ вакцинации, проводимых в мире.
Наиболее важная проблема - это количество серотипов, входящих в вакцину, которая должна защищать от 80-90% штаммов, выделяемых у пациентов при заболеваниях пневмококковой этиологии [70]. Кроме того, можно ожидать появления антибиотикорезистентных серотипов (например, 19А) [130], циркуляцию серотипов пневмококка, не входящих в вакцины или появления новых серотипов (например, 6С и 6D) [47, 133, 134]. Необходимо проводить дополнительные исследования по оценке безопасности и эффективности конъюгатных вакцин, при включении в их состав новых серотипов. Не следует забывать, что на иммуногенность вакцины может оказать влияние конкуренция антигенов, супрессивное действие белка-носителя [52], нежелательная перекрестная реактивность с антигенами хозяина [60]. Недостаточная степень очистки капсульных полисахаридов также может негативно отразиться на свойствах вакцин, в том числе, их безопасности.
Отработка условий для разработки экспериментальной ИФА тест-системы на основе конъюгированного гексасахарида
Лучшие результаты были получены для конъюгата тетрасахаридного повторяющегося звена и его аналога с дополнительным остатком галактозы на восстанавливающемся конце, а сыворотки, не содержащие антител, специфичных к полисахариду типа 14, не усиливали фагоцитарную активность.
Резюмируя данные этого большого сравнительного исследования, в котором использовали препараты 3-х трисахаридов, 4-х тетрасахаридов, 5-й -пентасахаридов, 2-х гексасахаридов, 1-ого гептасахарида, 1-ого октасахарида и 1-ого додекасахарида можно сделать заключение о том, что иммуногенность олигосахаридов зависит от их молекулярной структуры. Структура менее тетрасахарида, то есть трисахарид - не является иммуногенной. Среди стуктурно различных тетра-, пента- и гекса-олигосахаридов выявлены олигосахариды, способные и неспособные образовывать IgG-антитела к капсульному полисахариду, хотя они обладали способностью синтезировать IgG-антитела к олигосахаридам. Более структурно сложные олигосахариды, начиная с гептасахарида, образовывали такой же уровень IgG-антител к капсульному полисахариду, как тетра-, пента- и гексасахариды определенной структуры. То есть, химическая структура олигосахарида является важным условием его иммуногенности [136].
Эти эксперименты подтвердили, что тетрасахарид, являющийся повторяющимся звеном капсульного полисахарида S. pneumoniae серотипа 14, является необходимым структурным мотивом для выработки антител, специфичных к бактериальному капсульному полисахариду этого серотипа пневмококка в составе пента-, гекса- и других олигосахаридов большей длины. Данный фрагмент является также достаточным для выработки антител, обладающих опсонофагоцитарной активностью в отношении к S. pneumoniae серотипа 14. В случае, если антитела к конъюгату тетрасахарида будут обладать также и протективными свойствами в экспериментах на животных, такой конъюгат можно будет рассматривать в качестве перспективного кандидата на роль вакцины. Ни в одном из исследований не проводили изучения протективной активности конъюгатов олигосахаридов S. pneumoniae серотипа 14 на животных при заражении вирулентным штаммом этого серотипа.
На основе полученных данных было выдвинуто предположение, что тетрасахарид, являющийся единичным повторяющимся звеном, уже содержит ключевой эпитоп. Этот эпитоп также входит в структурно более длинные олигосахариды, такие как гексасахарид и другие.
Заслуживает внимание также и тот факт, что к носителю и спейсеру происходит образование антител. Какая их роль и значимость? Не повышают ли они аллергенную активность конъюгата?
При исследовании эффекта второй иммунизации сначала мышам вводили синтетический тетрасахарид S. pneumoniae серотипа 14, конъюгированный с CRM197, вторую иммунизацию проводили этим же гликоконъюгатом или неконъюгированным бактериальным капсульным полисахаридом. В первый день после повторного введения конъюгированного тетрасахарида в сыворотке крови мышей повышался уровень IL-5, а на 7 сутки появлялись специфические IgG-антитела в высоком титре. После иммунизации конъюгированным бактериальным капсульным полисахаридом не отмечали повышения уровня IL-5 и антител к капсульному полисахариду. В опытах in vitro стимуляция спленоцитов конъюгатом на основе синтетическго тетрасахарида приводила к продукции IL-4 и IL-5, но не под действием конъюгированного бактериального капсульного полисахарида. Однако при стимуляции спленоцитов двукратно иммунизированных мышей инактивированными нагреванием микробными клетками S. pneumoniae серотипа 14, уровень IFNy и IL-17 был выше при иммунизации бактериальным капсульным полисахаридом, чем у мышей, повторно иммунизированных конъюгированным синтетическим тетрасахаридом, и у неиммунизованных мышей. Авторы делают заключение, что после второй иммунизации конъюгированным тетрасахаридом происходит активация клеток памяти и формируется выраженный иммунитет к S. pneumoniae серотипа 14, тогда как повторная иммунизация конъюгированным бактериальным полисахаридом не приводит к образованию опсонизирующих антител, хотя и участвует в определенных регуляторных иммунологических механизмах [152].
В некоторых работах [153, 155] проведена оценка влияния адъювантов на иммуногенность конъюгатов. В качестве адъювантов использовали синтетический аналог бактериального липида А - монофосфорилил-липид А (MPL) и растительный - сапонин - Quil-A. При введении олигосахаридных конъюгатов с адъювантами, доза конъюгата была уменьшена (0,5 мкг углевода на мышь) [103]. На 35 день мышей иммунизировали дозой 2,5 мкг конъюгата на мышь без адъюванта. При определении титра IgG-антител к капсульному полисахариду выявлено его повышение всего в 1,6-2 раза, в группе мышей, которые образовывали антитела при иммунизации без адъюванта. Например, как без адъюванта, так и в присутствии адъюванта, титр антител (в Log 10) к тетрасахариду 1 [Gal-Glc-(Gal-)GlcNAc] повышался с 2,10 до 2,55; к пентасахариду 2 [Gal-Glc-(Gal-)GlcNAc-Gal] в большей степени - с 2,92 до 3,67; к слабоиммуногенному гексасахариду 7 [Gal-GlcNA-Gal-Glc-(Gal-)GlcNAc] - с 1,03 до 1,61; к конъюгированному с CRM197 бактериальному капсульному полисахариду - с 2,01 до 2,85. Слабоиммуногенный тетрасахарид 6 [(Glc-(Gal)-GlcNAc-Gal], обычно вызывающий выработку антител в низких титрах, в присутствии адъюванта способствовал увеличению титра IgG-антител к капсульному полисахариду в 2 раза (р 0,05). Другие конъюгаты, которые ранее не индуцировали образования IgG-антител к капсульному полисахариду, так и смогли вызвать их образования, даже при совместном введении с адъювантом.
Влияние конъюгированного гексасахарида на уровень цитокинов в сыворотке крови мышей
Индивидуальные титры IgG 1-антител к капсульному полисахариду на 14 сутки (день 28) после второй иммунизации сорбированным конъюгатом в той же иммунизирующей дозе, представлены на рис. 9Б. Установлено, что IgG 1-ответ к капсульному полисахариду имел дозозависимый характер.
Доза 10 мкг по углеводу вызывала более интенсивное антителообразование по сравнению с разовой дозой 2,5 мкг на мышь. Гликоконъюгат без адъюванта не индуцировал образования антител.
На фоне низкого уровня IgG-антител к капсульному полисахариду на 92 день проведена бустерная иммунизация сорбированным гликоконъюгатом при использовании той же дозы (Рис.9А). Через 24 часа (день 93) IgG-антитела оставались на исходном уровне, но на 4 сутки (день 96) титр IgG-антител увеличивался (р=0,012195) и продолжал нарастать к 7 дню (день 99) (р=0,01148). Быстрое образование IgG-антител свидетельствует о формировании иммунологической памяти к капсульному полисахариду. Активация иммунологической памяти приводила к длительному антительному ответу в течение 97 дней после бустерного введения сорбированного конъюгата (день 189), причем титр IgG-антител к капсульному полисахариду оставался выше, чем до ревакцинации (р=0,031494).
Таким образом, сорбированный конъюгат при двукратной иммунизации способствовал продукции IgG-антител к капсульному полисахариду S. pneumoniae серотипа 14, уровень которых снижался через 47 дней после второй иммунизации, но оставался высоким не менее 97 дней после ревакцинации.
Исследование субизотипов IgG-антител к капсульному полисахариду после иммунизации различными пневмококковыми препаратами выявило определенные различия в преобладании того или иного субизотипа (табл. 6).
После двукратной иммунизации мышей сорбированным гликоконъюгатом через 14 суток после второго введения препарата на фоне высокого уровня IgG антител к капсульному полисахариду (1:6400-1:12800) в сыворотке крови животных преобладала продукция IgGl (1:11200) (субизотип 2-ого типа), в меньшей степени - IgG2a и IgG3 (1:700 для каждого субизотипа соответственно) (субизотипы 1-ого типа). Важно, что происходило повышение уровня IgGl, основными свойствами которого является высокая аффинность, связывание с Fc-рецептором фагоцитов, участие в опсонизации и нейтрализации возбудителя инфекции.
Полисахаридная пневмококковая вакцина (Пневмо-23), не сорбированная на солях алюминия, не приводила к продукции IgG-антител к S.pneumoniae серотипа 14 и, соответственно, преобладанию какого-либо из субизотипов.
Конъюгированная пневмококковая вакцина (Превенар-13), сорбированная на фосфате алюминия, вызывала образование высокого уровня IgG-антител (1:6400), среди которых преобладал субизотип IgGl (1:6400) и IgG3 (1:1600), в меньшей степени вырабатывались IgG2a и IgG2b (1:800).
Антигены клеточной стенки (референс-препарат) не вызывали повышения IgG и его субизотипов.
Полученные данные свидетельствуют о том, что синтетический гексасахарид, конъюгированный с БСА, сорбированный на гидроксиде алюминия, является иммуногенным для мышей и по уровню образования IgGl-антител сопоставим с конъюгированной пневмококковой вакциной, сорбированной на фосфате алюмния. Преимущественное образование IgGl-антител при иммунизации обоими препаратами, вероятнее всего, связано с действием солей алюминия. Таблица 6. Субизотипы IgG-антител к капсульному полисахариду S.pneumoniae серотипа 14 в сыворотке крови мышей при иммунизации различными препаратами
Сыворотка крови мышей, полученная при иммунизации препаратами Титр антител к капсульному полисахариду"1 в ИФА IgG субизотипы IgG IgGl IgG2a IgG2b IgG3 Конъюгированный гексасахарид, сорбированный на гидроксиде алюминия (разовая доза по углеводу 10 мкг) 6400-12800 11200± 1600 700± 100 350± 50 700± 100 Полисахаридная пневмококковая вакцина Пневмо-23 (разовая доза 5 мкг по капсульному полисахариду S.pneumoniae серотипа 14) 400 200 200 200 200 Конъюгированная пневмококковая вакцина Превенар-13, сорбированная на фосфате алюминия (разовая доза 1,1 мкг по полисахариду S.pneumoniae серотипа 14) 6400 6400 800 800 1600 Антигены клеточной стенки S.pneumoniae серотипа 14 (разовая доза 50 мкг) 200 200 200 200 200 Контроль (не иммунизированные 200 200 200 200 200 Примечание. Сыворотка крови мышей СВА, самки. - использовали антивидовые антитела к субизотипам IgG; в качестве сорбента для ИФА использовали капсульный полисахарид S.pneumoniae серотипа 14 в концентрации 1 мкг в расчете на лунку. Все препараты вводили внутрибрюшинно с интервалом 14 суток. Данные представлены как среднее значение±стандартная ошибка. - различия достоверны по сравнению с контролем, р 0,05. Тест Манна-Уитни для независимых выборок.
Принимая во внимание тот факт, что капсульный полисахарид пневмококка рассматривают как основной протективныи антиген и антитела к нему являются основными эффекторами в защите от пневмококковой инфекции [138], в следующей части работы мы исследовали протективную активность конъюгированного гексасахарида в опытах активной защиты мышей. 4.2. Протективная активность конъюгированного гексасахарида в отношении S. pneumoniae серотипа 14
Для исследования протективной активности гликоконъюгата, сорбированного и не сорбированного на гидроксиде алюмния, мышей 2-кратно иммунизировали дозой 10 мкг по углеводу каждым из исследуемых гликоконъюгатов (табл. 7).
В качестве референс-препарата использовали коммерческую пневмококковую вакцину Пневмо-23, иммунизацию которой проводили 2-кратно в разовой дозе 5 мкг из расчета на капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 14. Через 2 недели после второй иммунизации мышей заражали тремя двукратно убывающими дозами культуры S. pneumoniae серотипа 14 (от 500х106 до 125х106 микробных клеток). В качестве контроля использовали неиммунизированных мышей, которых заражали теми же дозами культуры. Расчитывали LD50 и индекс эффективности (ИЭ).
Исследование протективной активности показало, что при заражении мышей штаммом S. pneumoniae серотипа 14 конъюгированный гексасахарид, сорбированный на гидроксиде алюминия, обеспечивал выживаемость 100% мышей при 10% в контроле. Индекс эффективности составил 1,9. Несорбированный гликоконъюгат оказался неиммуногенным. Титр IgG-антител к капсульному полисахариду коррелировал с защитой от заражения. Коммерческая полисахаридная пневмококковая вакцина оказалась неэффективной.
Для определения минимальной эффективной дозы конъюгированного гексасахарида, сорбированного на гидроксиде алюминия, животных иммунизировали по той же схеме, используя дозы от 10 до 0,6 мкг по углеводу в двукратно убывающих разведениях в расчете на мышь (табл 8).
Превентивные свойства сыворотки крови мышей, иммунизированных конъюгированным гексасахаридом, сорбированным на гидроксиде алюминия
На основании дальнейших исследований установлено, что конъюгированный гексасахарид способен усиливать бактерицидную активность сыворотки крови иммунизированных мышей в отношении гетерологичного возбудителя, в частности Staphylococcus aureus, причем в значительно большей степени, в том случае, если конъюгированный гексасахарид вводили двукратно в присутствии адъюванта, в качестве которого использовали гидроксид алюминия. То есть, уже на этом этапе исследования стало очевидно, что для усиления иммунологической активности гликоконъюгата требуется присутствие адъюванта.
Действие конъюгированного гексасахарида in vitro на созревание дендритных клеток, генерированных из костного мозга мышей, показало, что он вызывает появление в среде культивирования зрелых дендритных клеток с фенотипом (CD11с+, CD80+ и МНС класса II), а также приводит к продукции в среду культивирования цитокинов IL-ip, IL-6, TNFa. В присутствии адъюванта уровень поверхностных молекул и цитокинов существенно повышался, хотя, за исключением IL-ip, был ниже положительного контроля (TNFa - в качестве индуктора созревания дендритных клеток).
При исследовании продукции цитокинов in vivo установлено, что внутрибрюшинное введение мышам конъюгированного гексасахарида стимулировало в течение 24 часов появление в сыворотке крови мышей ТЫ, Th2 и ТЫ7 цитокинов: IL-lp, IL-5, IL-10, IL-17, TNFa, GM-CSF, IFNy. Особенно сильное действие конъюгированный гексасахарид оказывал на выработку TNFa и IL-10, уровень которых был высоким в течение всего периода наблюдения. При этом не отмечали повышения IL-6, участвующего в антителообразовании. В присутствии адъюванта синтез цитокинов усиливался и в сыворотке крови появлялся IL-6. При этом не происходило выработки IL-2 (начинает вырабатываться с третьих суток после иммунизации) и IL-4 по сравнению с несорбированным гликоконъюгатом. Отсутствие продукции IL-4 может свидетельствовать в пользу менее выраженного сенсибилизирующего действия сорбированного гликоконъюгата. Наиболее сильное действие сорбированный гликоконъюгат оказывал на продукцию IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, TNFa, GM-CSF. Выработка IFNy резко возрастала через 24 часа наблюдения.
Полученные данные свидетествуют о том, что конъюгированный гексасахарид активирует основные эффекторы врожденного иммунитета, причем в существенно большей степени в присутствии гидроксида алюминия.
Исследование влияния гликоконъюгата на активацию адаптивного иммунного ответа проведено на мышах. В ходе исследования установлено, что эффективной является только двукратная иммунизация животных конъюгированным гексасахаридом в разовой дозе 10 мкг/ мышь по углеводу в присутствии адъюванта, меньшие дозы способствовали меньшей выработке антител и оказались менее эффективными в защите от заражения. Повторная иммунизация препаратом без адъюванта, как это практикуют другие авторы [155], приводила к образованию более низкого уровня антител и меньшей защите от заражения S. pneumoniae серотипа 14.
При исследовании динамики выработки антител после иммунизации сорбированным гликоконъюгатом установлено, что после двукратной иммунизации IgG-антитела к капсульному полисахариду начинали вырабатываться к 7 суткам после повторного введения, то есть однократная иммунизация оказалась неэффективной. Далее их титр нарастал к 14 суткам (1:6400-1:12800), затем к 47 суткам титр антител снижался до (1:600). После проведения третьей (бустерной иммунизации) происходило быстрое (на 4 сутки) образование IgG-антител к капсульному полисахариду, которые оставались на высоком уровне в течение 92 дней, то есть в 2 раза дольше, чем после двукратной иммунизации. Полученные данные свидетельствуют о том, что после повторной иммунизации сорбированным гликоконъюгатом происходит формирование иммунологической памяти. Анамнестические антитела к капсульному полисахариду сохраняются в сыворотке крови в течение длительного периода времени (92 дня - срок наблюдения).
В сыворотке крови животных преобладал субизотип IgGl (1:12800), в меньшей степени определяли антитела к IgG2a и IgG3 (1:700), тогда как IgG2b не выявлен. Некоторые авторы считают, что доминирование того или иного субизотипа IgG определяется действием адъюванта. Так гидроксид алюминия способствует преимущественной выработке IgGl, использование других адъювантов приводит к выработке других субизотипов IgG. IgGl относится к субизотипу 2 типа и вырабатывается под действием IL-4 и IL-5, но не IFNy, который отвечает за синтез IgG2a, IgG2b и IgG3. В нашем исследовании, действительно, доминировал IL-5 при иммунизации животных. IFNy появлялся в сыворотке крови животных через 4 часа после введения сорбированного гликоконъюгата и продолжал нарастать к 24 часам наблюдения. Учитывая субизотиповой состав IgG и характеристику цитокинов, можно говорить о том, что развитие иммунного ответа под действием сорбированного гликоконъюгата происходило по Thl/Th2 типу.
До настоящего времени протективную активность конъюгированного гексасахарида и других олигосахаридов, относящихся к S. pneumoniae серотипа 14 в опытах активной защиты мышей не изучали. Мы показали, что наиболее эффективной, как по интенсивности антителообразования, так и в защите от заражения, оказалась разовая доза сорбированного гликоконъгата, составляющая 10 мкг/мышь по углеводу. Защита от заражения коррелировала с титром IgG антител к капсульному полисахариду. Коммерческая полисахаридная вакцина при той же схеме иммунизации оказалась неэффективной, выжило только 20% мышей, тогда как конъюгированная пневмококковая вакцина (Превенар-13), сорбированная на фосфате алюминия в дозе 0,44 мкг (в расчете на капсульный полисахарид S. pneumoniae серотипа 14) после двукратной иммунизации защищала 100% мышей.
Нами также установлено, что сыворотка крови двукратно иммунизированных мышей сорбированным конъюгированным гексасахаридом в разовой дозе 10 мкг по углеводу обладала превентивными свойствами и после однократного введения за 2 часа до заражения S. pneumoniae серотипа 14 защищала 6 из 8 мышей, тогда как в контрольной группе, не получавшей сыворотку, все мыши погибли. Нативная сыворотка защищала от заражения 3 из 8 мышей. IgG антитела к капсульному полисахариду, присутствующие в сыворотке крови мышей, иммунизированных сорбированным конъюгатом гексасахарида, усиливали фагоцитоз нейтрофилами и моноцитами крови, убитых нагреванием бактерий S. pneumoniae серотипа 14.
На фоне значительной продукции антител к капсульному полисахариду S.pneumoniae серотипа 14, конъюгированный гексасахарид, сорбированный на гидроксиде алюминия, увеличивал ИРИ (иммунорегуляторный индекс, соотношение CD4/CD8) вследствие снижения CD8+ Т-клеток, стимулировал преимущественно антителопродуцирующие В-клетки, увеличивал количество натуральных киллеров (NK) и экспрессию МНС класса П.
Обобщая полученные данные можно сделать заключение, что конъюгированный гексасахарид обладает способностью активировать врожденный иммунитет, но в недостаточной степени для последующего формирования адаптивного иммунитета. Для достижения выработки IgG-антител к капсульному полисахариду и защите от заражения S. pneumoniae серотипа 14 необходимо использовать адъювант. Высокая иммуногенная и протективная активность конъюгированного гексасахарида, сорбированного на гидроксиде алюминия позволяет рассматривать его как кандидат для включения в вакцину против S. pneumoniae серотипа 14, а также использовать для конструирования диагностических тест-систем.