Введение к работе
Актуальность темы. Инфекции, вызываемые Haemophilus influenzae, являются причиной заболеваемости и смертности в экономически развитых и развивающихся странах, прежде всего, среди детей раннего возраста [Л.М.Куртасова с соавт., 2010]. Установлена роль H.influenzae в этиологии гнойного менингита, гнойного эпиглоттита, сепсиса, хронического бронхита, пневмонии, среднего отита, синусита, конъюнктивита и др. Фактические данные, накопленные в последние годы, свидетельствуют о том, что эти заболевания имеют широкое распространение на территории России и являются актуальной проблемой здравоохранения [В.К.Таточенко, 2010].
Заболевания, вызываемые наиболее вирулентным капсульным штаммом H.influenzae типа b (Hib), имеют тяжелое течение с нередким развитием осложнений и высокую летальность. Вместе с тем, нельзя недооценивать медико-социальную значимость инфекций, вызываемых бескапсульными или нетипируемыми (NTHi) штаммами гемофильной палочки.
Если вопрос защиты от инфекций, вызванных капсульными штаммами H.influenzae, в настоящее время решается применением конъюгированных вакцин на основе капсульного полисахарида H.influenzae типа b (КПС Hib) и белков-носителей, то вакцины против инфекций, вызванных бескапсульными штаммами, до сих пор нет. В качестве основы для вакцинных препаратов, направленных на профилактику заболеваний, вызванных бескапсульными штаммами H.influenzae, за рубежом изучается роль белков наружной мембраны и липоолигосахаридов (ЛОС) [A.R.Foxwell, M.K. Jennelle et al, 1998; W.E.Adhami, et al 1999]. Следует отметить, что ЛОС бескапсульных штаммов H.influenzae имеют уникальную структуру. Обнаружено более 10-ти субтипов NTHi, различающихся по электрофоретической подвижности ЛОС [О.Е.Орлова, 2006; X.X. Gu et al., 1995].
Список сокращений – с.24
В нашей стране субтипирование циркулирующих бескапсульных штаммов не проводилось. Вместе с тем, решение этого вопроса может способствовать определению наиболее распространенных в популяции субтипов возбудителей с дальнейшим получением из них детоксицированных ЛОС, обеспечивающих перекрестную защиту от NTHi. Не изучена также возможность создания вакцинного препарата на основе двух Т-независимых антигенов (КПС и ЛОС) H.influenzae для одновременной защиты от капсульных и бескапсульных штаммов.
Цель. Получение углеводсодержащих антигенов H.influenzae и характеристика их иммунобиологических свойств.
Задачи исследования:
1. Провести выбор бескапсульных штаммов H.influenzae, наиболее распространенных в популяции больных бронхолегочными заболеваниями (БЛЗ).
2. Получить препараты капсульного полисахарида Hib, гидроксил-аминовые препараты капсульного и бескапсульного штаммов H.influenzae, ЛОС NTHi и охарактеризовать их по химическим, физико-химическим и иммунохимическим свойствам.
3. Изучить влияние гидроксиламингидрохлорида, безводного гидразина, гидроксида натрия на жирнокислотный состав липида А липоолигосахарида бескапсульного штамма и его токсичность.
4. На основании результатов изучения иммунобиологических свойств антигенных препаратов H.influenzae определить наиболее перспективный препарат для разработки вакцины, направленной на профилактику заболеваний, вызываемых капсульными и бескапсульными штаммами H.influenzae.
Научная новизна. Впервые при использовании SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) проведен скрининг ЛОС, выделенных из 62 бескапсульных штаммов H.influenzae, циркулирующих на территории России (Москва) среди больных с бронхолегочными заболеваниями. По электрофоретической подвижности ЛОС выявлено 10 основных субтипов, имеющих один электрофоретический компонент, и 13 дополнительных, включающих 2-3 основных компонента в различных сочетаниях. Наиболее распространены среди больных – VI (17,7±4,8%), VIII (12,9±4,3) и X (12,9±4,3) субтипы.
Впервые при использовании твердофазного ИФА на основе ЛОС 67 штаммов NTHi определена частота повышенного уровня ЛОС-специфических IgG-антител к H.influenzae у больных бронхолегочными заболеваниями и здоровых доноров. Наиболее часто повышенный уровень антител наблюдали к 11 штаммам (16,7-54,8%), которые также имели признаки или принадлежали к трем основным субтипам (VI, VIII, X).
Выделены и охарактеризованы по химическим, физико-химическим и иммунохимическим свойствам три группы бактериальных антигенов: КПС 1095 Hib; ГАП 1095 Hib и 58 NTHi; ЛОС штаммов 45, 54, 58, 65 NTHi и 1095 Hib. По результатам иммунохимических исследований наиболее выраженной перекрестной активностью обладал ЛОС штамма 45 NTHi (X субтип).
Впервые проведено сравнительное изучение детоксицирующих свойств безводного гидразина (БГ), солянокислого гидроксиламина (ГА) и гидроксида натрия. На примере ЛОС 45 NTHi показано, что при использованных концентрациях БГ и ГА приводят к удалению основной массы жирных кислот из липида А, что, в свою очередь, ведет к уменьшению токсичности препарата в опытах на животных в 31,5-25 раз (LD50ЛОСИСХ=0,063 мкг; LD50 дЛОСБГ=1,99 мкг; LD50 дЛОСГА=1,58 мкг).
Изучение иммунобиологических свойств КПС, ГАП, ЛОС, дЛОС и смесей КПС с ЛОС 45 NTHi и КПС с дЛОСГА показало, что смесь КПС Hib (10 мкг) и дЛОСГА 45 NTHi (0,1-10мкг) является наиболее перспективным углеводсодержащим препаратом в качестве основы для разработки новой вакцины против гемофильной инфекции, обусловленной как капсульными, так и бескапсульными штаммами. При испытанных дозах и схемах введения смесь указанных препаратов обладает низкой токсичностью, высокой перекрестной протективной активностью при заражении иммунизированных мышей капсульным и бескапсульными штаммами H.influenzae и вызывает активацию эффекторов системы врожденного и адаптивного иммунитета, приводя к повышению фагоцитарной способности лейкоцитов мышей, продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, увеличению числа Т-клеток, экспрессирующих молекулы CD4, активационные молекулы CD25 и MHCII, повышению продукции специфических IgG-антител к ЛОС.
Практическая значимость. Установлено, что циркулирующие на территории России (Москва) NTHi штаммы по структуре ЛОС относятся к десяти основным субтипам, среди которых VI, VIII и X субтипы наиболее распространены у больных бронхолегочными заболеваниями. Предложенный способ субтипирования может быть использован для проведения эпидемиологического мониторинга штаммов в разных географических регионах России.
Высокая степень очистки и специфическая активность КПС 1095 Hib позволяет рекомендовать его использование в качестве референс-препарата, а также для создания современных диагностических и профилактических препаратов. В рамках выполнения федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 гг.» КПС 1095 Hib использовали для создания количественной иммуноферментной тест-системы для оценки поствакцинального иммунитета.
Солянокислый гидроксиламин может быть использован в качестве детоксицирующего агента для ЛОС NTHi штаммов.
Смесь капсульного полисахарида Hib и детоксицированного ЛОС NTHi может быть использована в качестве основы для разработки вакцины с серотиповой (Hib) и видовой (NTHi) перекрестной протективной активностью.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Бескапсульные штаммы H.influenzae, циркулирующие в популяции больных бронхолегочными заболеваниями людей, по электрофоретической подвижности ЛОС относятся к 10 основным субтипам, наиболее распространенными из которых являются VI, VIII и X.
2. Среди выделенных углеводсодержащих препаратов – КПС 1095 Hib, ГАП 1095 Hib и 58NTHi, ЛОС 45, 54, 58, 65 NTHi и 1095 Hib – высокой перекрестной серологической активностью обладают ГАП и ЛОС 45 NTHi.
3. Действие 1% водного раствора гидроксиламингидрохлорида приводит к удалению из липида А ЛОС NTHi 3-гидроксикаприновой, миристиновой, олеиновой и стеариновой кислот и снижению токсичности полученного дЛОС в 25 раз.
4. Низкая токсичность, высокая степень внутривидовой перекрестной защиты смеси КПС Hib и дЛОС NTHi, способность этой смеси активировать эффекторы врожденного иммунитета, а также инициировать процесс формирования адаптивного иммунитета является основанием для разработки новой вакцины, направленной на профилактику заболеваний, вызванных капсульными и бескапсульными штаммами H.influenzae.
Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены и обсуждены: на Всероссийской научной конференции "Объединенный Иммунологический Форум", Санкт-Петербург, 2008; на конференции молодых ученых НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, 2009. Апробация работы состоялась на конференции отдела иммунологии НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН 18 ноября 2010 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 149 страницах компьютерного текста, иллюстрированы 18 рисунками и 20 таблицами, состоят из введения, четырех глав обзора литературы, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 109 источников, в том числе, 41 на русском языке.
