Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1 Гены, ассоциированные с риском развития цереброваскулярного атеросклероза 10
1.2 Полиморфизмы генов фолатного цикла (MTHFR, MTRR, MTR) 13
1.3 SNP генов AGT и AGT2R1 23
1.4 Молекулы адгезии (SELP, SELE, ITGB3, ITGA2) в развитии ССЗ 27
1.5 Полиморфизмы генов цитокинов (IL-17А, IL-ІД IL-4, TNF-a) 36
Глава II. Материалы и методы 49
2.1. Культуральные работы 49
2.2 Реактивы, тест-системы и материалы 49
2.3 Экспериментальные методы 52
2.4. Статистическая обработка данных 60
2.5 Контингент обследованных лиц 60
Глава III. Результаты исследований 63
3.1 Роль полиморфизмов генов фолатного цикла в развитии ЦВА 63
3.2 SNP генов AGT и AGT2R1 при ЦВА 70
3.3 Полиморфизмы генов молекул адгезии ITG и SEL при ЦВА 73
3.4 Роль полиморфизмов генов цитокинов в развитии ЦВА у жителей Республики Адыгея .81
3.5 Сывороточные уровни, спонтанная и стимулированная in vitro продукция цитокинов PBMC при ЦВА, с исходом в ИИ 89
3.6 Молярные соотношения провоспалительных цитокинов 93
3.7 Влияние генотипов генов цитокинов на продукцию медиаторов 94
3.8 Сочетанное влияние генотипов промоторных регионов генов цитокинов на продукцию медиаторов 99
3.9 Спонтанная и стимулированная in vitro NK-активность PBMC при ИИ 100
Глава IV. Обсуждение результатов 103
Выводы 118
Список сокращений 120
Список литературы 122
- Полиморфизмы генов фолатного цикла (MTHFR, MTRR, MTR)
- Роль полиморфизмов генов фолатного цикла в развитии ЦВА
- Роль полиморфизмов генов цитокинов в развитии ЦВА у жителей Республики Адыгея
- Влияние генотипов генов цитокинов на продукцию медиаторов
Введение к работе
Актуальность исследования. В структуре цереброваскулярной патологии ишемический инсульт мозга (ИИМ) занимает лидирующие места среди основных причин инвалидизации и смертности населения многих стран. Ежегодно в мире регистрируется около 12 миллионов случаев ИИМ, в России - 450 тыс. По данным ВОЗ, более 30% смертельных исходов сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) связано с ИИМ [Е. А. Котина и др., 2013; V. М. Shklovsky et al., 2016; ].
В мировой практике ССЗ преимущественно связывают с однонуклеотидными заменами или полиморфизмами (SNP - single nucleotide polymorphisms) генов фолатного цикла (MTHFR, MTRR, MTR), ангиотензиногена (AGT), рецептора 1-типа ангиотезина-2 (AGT2R1), селектинов (SELE, SELP), интегринов (ITGA2, ITGB3) др. с противоречивыми выводами о популяционной прогностической значимости при цереброваскулярных нарушениях. Этногенетические различия в распределении и ассоциации SNP генов -предикторов ССЗ определяют необходимость регионарных исследований и поиск наиболее информативных молекулярно-генетических маркеров ИИМ []
Полиморфизмы генов про- и противовоспалительных цитокинов (IL-17A, IL-ip, TNF-a, IL-4), участвующих в системных воспалительных реакциях организма, могут запускать патофизиологические механизмы развития цереброваскулярного атеросклероза с исходом в ИИМ [И.В. Кологривова и др., 2011; А.Г. Кутихин и др., 2012; Z. Xiaolin еа., 2011; Gu L. et al., 2013; Wawrzynek et al, 2014; Н.А. Rezk et al, 2015; L. Gu, et al, 2016].
При ИИМ высвобождаются провоспалительные цитокины первой волны IL-1, IL-17A и TNF-, оказывающие прямое и опосредованное повреждающее действие, однако, с неблагоприятным неврологическим прогнозом коррелируют повышенные концентрации TNF-. Продукция противовоспалительных цитокинов, наоборот, способствует благоприятному клиническому течению ИИМ с тенденцией к восстановлению нарушенных функций [Л.Н. Кашаева, 2005; Г.Н.
Жданов и др., 2006; Е.И. Батищева и др., 2008; Т.А. Постникова и др., 2011; J. Oto et al., 2008].
Локальные и системные повышения провоспалительных медиаторов, по мнению ряда авторов, могут служить прогностическим критерием исхода многих заболеваний, однако данные о значимости цитокинов в развитии ИИМ основаны на анализе низких/недектируемых сывороточных уровней [Е.Н. Андрианова и др., 2008; М.Ю. Мартынов и др. 2010; Е. А. Котина и др., 2013; L. Rashed et al., 2017].
Этногенетические исследования по изучению полиморфизмов генов цитокинов G197A (IL-17A, rs2275913), С511Т (IL-1, rs16944), G308A (TNF-, rs1800629) и С587Т (IL-4, rs2243250), ассоциированных с риском развития ИИМ, в мире немногочисленны, во многом противоречивы, а в России и Республике Адыгея практически не изучены.
Актуальность работы обусловлена исследованием роли иммунного воспаления в развитии цереброваскулярного атеросклероза (ЦВА) и поиском прогностически значимых молекулярно-генетических предикторов развития ИИМ для населения Республики Адыгея.
Цель работы: выявить триггерные иммунологические и генетические факторы риска развития цереброваскулярного атеросклероза на примере жителей Республики Адыгея.
Задачи:
1. Типировать полиморфизмы генов фолатного цикла MTHFR (C677Т,
rs1801133, А1298С, rs1801131), MTRR (A66G, rs180139) и MTR (A2756G,
rs1805087), ангиотензиногена AGT (C807T, rs699), рецептора 1-типа ангиотезина-
2 AGT2R1 (А1166С, rs5186) и молекул адгезии SELE (Ser128Arg, rs5361), SELP
(Thr715Pro, rs6131), ITGA2 (С807Т, rs1126643) и ITGB3 (Leu33Pro, rs5918),
ассоциированные с цереброваскулярным атеросклерозом (ишемическим
инсультом мозга) у жителей Республики Адыгея в сравнении с мировыми
популяциями.
2. Исследовать распределение частот SNP генов цитокинов G197A (IL-17A,
rs2275913), С511Т (IL-1, rs16944), G308A (TNF-, rs1800629) и С587Т (IL-4,
rs2243250) в обследуемых группах доноров и больных, установить их ассоциацию с риском развития ишемического инсульта мозга.
3. Определить сывороточные концентрации, уровни спонтанной и
стимулированной продукции медиаторов воспаления первой волны IL-17A, IL-1,
TNF-, IL-4 мононуклеарными клетками периферической крови доноров и
больных ишемическим инсультом мозга.
4. Выявить триггерные SNP промоторных регионов генов цитокинов,
обуславливающие оверэкспрессию IL-17A, IL-1, TNF- у больных ишемическим
инсультом мозга.
5. Сравнить in vitro NK-активность мононуклеарных клеток
периферической крови в норме и при ишемическом инсульте мозга.
Научная новизна работы.
Впервые в мире:
исследованы уровни спонтанной и стимулированной продукции медиаторов воспаления мононуклеарными клетками периферической крови у больных ИИМ;
определены молярные соотношения цитокинов в образцах сывороток, супернатантов интактных и стимулированных РВМС больных ЦВА;
проанализировано сочетанное носительство SNP генов основных провоспалительных цитокинов IL-17A, IL-lfi, TNF-a при ЦВА;
установлены особенности влияния полиморфных вариантов генов цитокинов на продукцию медиаторов острого и хронического воспаления мононуклеарными клетками больных ИИМ;
исследована NK-активность интактных и стимулированных РВМС больных ИИМ в сравнении с донорами.
Для жителей Республики Адыгея впервые:
выявлена ассоциация SNP медиаторов иммунной системы, провоспалительных цитокинов «первой волны» IL-17A (G197A), IL-lfi (С511Т), TNF-a (G308A) с риском в развития ИИМ;
исследовано частотное распределение аллелей и генотипов
полиморфизмов генов MTHFR (С677Т, А1298С), MTRR (A66G), MTR (A2756G), AGT (Met235Thr), AGT2R1 (А1166С), SELE (Serl28Arg), SELP (Thr715Pro), ITGA2 (C807T), ITGB3(Leu33Pro), IL-17A (G197A), IL-10 (C511T), IL-4 (C589T) и TNF-a (G308A) в обследованной группе больных ЦВА с исходом в ИИМ;
определены сывороточные концентрации цитокинов больных ишемическим инсультом мозга.
Научно-практическая значимость:
На основании экспериментальных данных показано, что с хроническим и острым ишемическим инсультом мозга ассоциированы полиморфизмы генов основных провосполительных цитокинов IL-17A, IL-lfi, TNF-a; определены высокие уровни спонтанной, стимулированной in vitro ФГА продукции медиаторов (IL-17А, IL-ip и TNF-) РВМС и низкая NK-активность у больных ИИМ по сравнению с донорами. Полученные в рамках диссертационного исследования данные о частотах полиморфизмов генов медиаторов иммунной системы, уровнях спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукции медиаторов и NK-активности у населения Республики Адыгея подтверждают триггерную роль хронического и острого воспаления в развитии ишемического инсульта мозга и могут быть использованы в качестве наиболее ранних предикторов цереброваскулярного атеросклероза.
Положения, выносимые на защиту:
1. Риск развития цереброваскулярного атеросклероза обусловлен
повышенной спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукцией основных
провоспалительных цитокинов (IL-17А, IL-1, TNF-) мононуклеарными
клетками периферической крови.
2. Оверэкспрессия медиаторов воспаления первой волны интактными и
стимулированными in vitro мононуклеарными клетками периферической крови
больных ишемическим инсультом мозга обусловлена SNP промоторных регионов
генов IL-17A (G197A, rs2275913), IL-lp (С511Т, rsl6944) и TNF-a (G308A,
rsl 800629).
-
Выявленная при ишемическом инсульте мозга низкая NK-активность мононуклеарных клеток периферической крови может служить дополнительным патогенетическим фактором риска развития цереброваскулярного атеросклероза.
-
Иммуногенетические механизмы развития ишемического инсульта мозга обусловлены полиморфизмами генов основных провоспалительных цитокинов -медиаторов «первой волны» IL-17A (G197A, rs2275913), IL-ip (С511Т, rsl6944), TNF-a (G308A, rsl800629).
Степень достоверности. Достоверность результатов исследования подтверждается достаточным объемом проведенных исследований (302), применением современных технологий генотипирования, иммуноферментного анализа и использованием методов статистической обработки данных, полностью соответствующих поставленным задачам.
Личный вклад автора. На всех этапах написания работы автором проанализирована научная литература по исследуемой проблеме, выполнены все экспериментальные исследования, проведен анализ и статистическая обработка полученных результатов, подготовлены материалы публикаций по теме диссертации.
Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации доложены на научных конференциях: «Роль и место медицины в обеспечении здоровья людей в современном обществе» (Одесса, 2013г.); «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2014г.); «VI съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) и ассоциированные генетические симпозиумы» (Ростов-на-Дону, 2014г.); «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2015г.), «Дни иммунологии в СПБ 2015» (Санкт-Петербург, 2015г.); «Механизмы функционирования нервной, эндокринной и висцеральной систем в процессе онтогенеза» (Майкоп, 2015 г.); «4-ый Евразийский конгресс кардиологов в Ереване» (Ереван 2016г.); 7-ой международный конгресс «Кардиология на перекрестке наук» (Нижний Новгород 2016г.).
Публикации. По данным научного исследования опубликовано 12 печатных работ, из которых 8 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией (ВАК) РФ; 4 публикации – в сборниках материалов всероссийских конференций.
Внедрение результатов исследования. Материалы диссертации внедрены в учебный процесс ФГБОУ ВО АГУ (Адыгейский государственный университет) и факультета лечебного дела ФГБОУ ВО МГТУ (Майкопский государственный технологический университет) в рамках медицинских и биологических дисциплин: иммунология и медицинская генетика для подготовки врачей общей практики, педиатров, стоматологов и биологов.
Объем и структура диссертации. Диссертация представлена на 151 странице компьютерного текста, иллюстрирована 17 рисунками, содержит 65 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и библиографического указателя используемой литературы, включающего 228 зарубежных и 64 отечественных источников.
Полиморфизмы генов фолатного цикла (MTHFR, MTRR, MTR)
Ключевым ферментом фолатного цикла является метилентетрагидрофолат редуктаза (MTHFR), который переводит фолиевую кислоту в ее активную форму 5-метилтетрагидрофолат. Фермент MTHFR относится к группе флавопротеинов и состоит из двух одинаковых субъединиц с молекулярной массой около 70 кДа [M.A. Abd-Elmawla et al., 2016; A. Song et al., 2016; P. Ventura et al., 2016].
Метилентетрагидрофолат редуктаза играет ключевую роль в метаболизме фолиевой кислоты начиная с восстановления 5,10-метилентетрагидрофолата в 5-метилтетрагидрофолат, затем образования метионина из гомоцистеина и далее -S-аденозилметионина, играющего ключевую роль в процессе метилирования белков, фосфолипидов, РНК и ДНК. Дефицит MTHFR, вызванный SNP полиморфизмами, способствует развитию мутагенных процессов в молекулах ДНК [T.B. Верткин, 2007; A. Karban et al., 2016; K. Sun et al., 2016; F.F. Roussotte et al., 2016; T.A.A. El-Aziz et al., 2017; Y.T. Chang et al., 2017].
Длина всего кодирующего региона составляет около 1980 нуклеотидных пар. Практическое значение имеют только два полиморфизма: Ala222Val (rs1801133) в 4 экзоне и А1298С (rs1801131) в 7 экзоне (табл. 1,2).
Миссенс-мутация Ala222Val связанна с замещением валина на аланин (Ala/Val) в каталитическом домене белка-фермента. У гомозигот по полиморфному 222Val аллелю активность фермента in vitro снижена на 70%, а у гетерозигот – на 35%. Индивидуумы, являющиеся компаунд-гетерозиготами по аллелям 222Val и 1298С (генотип Ala222Val /1298АС), согласно некоторым исследованиям, характеризуются снижением активности фермента на 40–50% [M. Curr et al., 2016].
Другим вариантом полиморфизма гена MTHFR является замена нуклеотида аденина (A) на цитозин (С) в позиции 1298. Это приводит к изменению структуры фермента, в котором глутаминовая кислота в 429 позиции полипептидной цепи заменяется на аланин.
Данная замена приводит к снижению активности фермента, более выраженному у носителей гомозиготного С1298С генотипа. Биохимические характеристики измененного фермента не отличаются от свойств фермента дикого типа. [H. Ghaznavi et al., 2015].
Влияние SNP гена MTHFR на прогноз и течение цереброваскулярного атеросклероза в мировых БД (HuGE Navigator) показано для некоторых популяций (табл.3).
Полиморфизмы C677T гена MTHFR влияют на снижение активности ферментов, приводят к избыточному накоплению гомоцистеина в крови и, как следствие, повышению риска атеросклеротического поражения сосудов [Р.Ф. Гайфуллина и др., 2012].
Согласно результатам мировых исследований (Physicians Health Study, British United Provident Study, Tromso Study и British Regional Heart Study) высокий уровень гомоцистеина в крови в несколько раз увеличивает риск развития атеросклероза и ишемической болезни сердца. Частота выявления гипергомоцистеинемии составляет около 5% в общей популяции и достигает 13-47% среди людей с ССЗ [Т.В. Верткин, 2007].
Polonikov O.V. et al (2014), доказали, что у представителей украинского населения есть связь между частотой полиморфизма С (677) - Т гена MTHFR и риском развития ишемического атеротромботического инсульта. Распределение частот "нормальных" гомозигот (С677С), гетерозигот (С677Т) и "мутантных гомозигот (Т677Т) составляет соответственно 52,4:35,9:11,8% (в контроле -46,0:48,4:5,6%, р=0,044). У Гб77Г-гомозигот риск развития ишемического атеротромботического инсульта значительно выше чем у носителей С677 аллели (С677Т + C677C) (OR=2,3; СІ = 0.911-5.449, Р = 0,049) [O.V. Polonikov et al, 2014].
Cao H et al (2014), установили, что гомозиготный (T677T) генотип гена MTHFR может быть наиболее значимым наследственным фактором риска развития аневризмы брюшной аорты (АБА) у населения Северо-Восточного Китая: у пациентов с АБА по сравнению с донорами частота гомозиготного (Т677Т) генотипа гена MTHFR значительно повышена(19,4% против 11,9%, р=0,002). [Н. Cao et al, 2014].
С677Т полиморфизм гена MTHFR, связанный с повышенным уровнем гомоцистеина в крови, может рассматриваться как генетический фактор риска при ишемическом инсульта не только у взрослых, но и у детей. Обобщенный анализ показал, что Т677Т генотип гена MTHFR является более распространенным у больных, перенесших инсульт, чем в контрольной группе (р=0,0402, OR=l,57, 95% С1= 1,02-2,41) [В. Sarecka-Hujar et al., 2012].
Связь С677Т полиморфизмов гена MTHFR с риском развития ССЗ исследована в мета-анализе Bozok Qetinta V. et al (2014). Несмотря на высокую степень значимости (р=0,002), у носителей С677Т полиморфизма риск развития ССЗ составляет всего 1,33 (OR=1,33; 95% CI 1,11-1,59). В мета-анализе приведены данные, подтверждающие, что С677Т SNP гена MTHFR является предиктором развития венозных тромбозов, периферических артериальных тромбозов, острых инфарктов миокарда и др. ССЗ у турецкого населения [V. Bozok etinta et al, 2014].
667T полиморфизм гена MTHFR связан с повышенным риском развития цереброваскулярного атеросклероза и исходом в ишемический инсульт (OR=1,28; 95% CI=1,17-1,40; р 0,00001), что подтверждено мета-анализом Li P. et al (2014), включающим девятнадцать независимых исследований для населения Китая с участием 2223 больных ИИ и 2936 доноров [P.Li et al., 2014].
Аналогичные результаты получены в мета-анализе Yadav S. Et al, 2013, установивших, что из всех известных генетических полиморфизмов, с ишемическим инсультом у жителей Южной Азииассоциирована677T аллель в гомозиготном состоянии (Т677T генотип гена MTHFR), связанного с повышенным уровнем гомоцистеина в плазме (X=5,18 мкмоль/л; 95% CI=2.03-8.34: р=0,001).
Т.о. результаты многочисленных исследований подтверждают, что С677T полиморфизм гена MTHFR является молекулярно-генетическим предиктором развития ИИ (ЦВА) у населения Южной Азии. [S. Yadav et al., 2013].
С геморрагическим инсультом, по данным Kang S. et al (2013) ассоциирована 667T аллель гена MTHFR (OR=1,695; 95%CI=1.409-2.038; p 0,05), которая является важным фактором риска развития ЦВА у жителей Китая. Эти утверждения основаны на анализе результатов 15 независимых исследований, включающих 2034 больных ГИ и 4485 доноров. [S. Kang et al., 2013].
В России распределение C677T полиморфизмов гена MTHFR изучено при ИИ, артериальной гипертензией и венозными тромбоэмболическими осложнениями (ВТЭО) для жителей Москвы, Екатеринбурга, Барнаула и Новосибирска [О. А. Львова и др.; 2013, А. С. Петриков и др., 2013; И. И. Чукаева и др.; 2014].
В Республике Адыгея проведены исследования по ассоциации полиморфных вариантов C677T гена MTHFR с ССЗ, развившимися на фоне атеросклеротических поражений сосудов разных бассейнов [А.Р. Тугуз, Д.В. Муженя, 2012]. Однако роль C677T полиморфизмов гена MTHFR в патогенезе цереброваскулярного атеросклероза в этнических группах РА не изучена.
Второй по значимости полиморфизм гена MTHFR связан с заменой аденина (A) на цитозин (С) в 1298 позиции гена MTHFR и приводит к изменению структуры фермента, в котором глутаминовая кислота в 429 позиции полипептидной цепи замещается на аланин с последующим снижением активности фермента, более выраженным у носителей гомозиготного С1298С генотипа [H. Ghaznavi et al., 2015].
Роль А1298С аллельных вариантов гена MTHFR в развитии цереброваскулярного атеросклероза у жителей географических удаленных регионов мира Азии и Европы проанализирована в масштабных международных исследованиях с весьма противоречивыми выводами о прогностической значимости этих SNP при ИИ, ГИ и других цереброваскулярных нарушений.
Так, по данным Kang S. et al (2013), основанным на анализе тринадцати проспективных исследований, включающих 2133 больных с ишемическим инсультом и 2572 доноров, ассоциация между A1298C полиморфизмом гена MTHFR и риском ишемического инсульта наблюдалась в доминантной (OR=1,227; 95% CI=1,062-1,416) и кодоминантной (OR=1,138; 95% CI=1.007-1.286) модели наследования.[S. Kang et al., 2013].
Arsene D. et al (2011) и Fekih-Mrissa N. et al (2013),на небольших выборках больных с ИИ (127 и 84) и доноров (60 и 100), проживающих в Румынии не подтвердили связь A1298C полиморфизмов гена MTHFR (p 0,05) с риском развития ишемического инсульта [D. Arsene et al., 2011; N. Fekih-Mrissa et al., 2013].
В более поздних мета-анализах (Zhang M. et al., 2014) ассоциация A1298C полиморфизмов гена MTHFR с ИИ (OR=1,77; 95% CI=1,07-2,94; p 0,05) подтверждена для кавказцев (европейцев) и жителей Китая (2261 больных и 2653 доноров). При анализе групп в зависимости от национальности, найдены статистически значимые различия у азиатского населения (OR=2,58; 95% CI=1,34 4,96; p 0,05). Однако в выборке кавказской популяции ассоциация не выявлена (OR=1,65; 95% CI=0,81-3,33; p 0,05).
Роль полиморфизмов генов фолатного цикла в развитии ЦВА
В современных геномных базах данных (БД) и поисковых системах «HuGE Navigator», «PubMed», «NCBI», «ALFRED», «GeneCards» собраны сведения о генах и их аллельных вариантах, вовлеченных в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), в частности - цереброваскулярного атеросклероза. К генам-маркерам, ассоциированным с ССЗ относят гены фолатного цикла (MTHFR, MTRR, MTR). Исследование роли C677T, A1298C, A66G, A2756G полиморфизмов генов фолатного цикла в атерогенезе обусловлено влиянием SNP генов MTHFR, MTRR, MTR на активность ферментов, регулирующих уровни гомоцистеина в крови и, как следствие, риск атеросклеротического поражения сосудов [И.И. Ахметов, 2010; А.А. Ризванов и др., 2012; http://alfred.med.yale.edu; http://www.genecards.org].
В России распределение C677T, A1298C, A66G и A2756G полиморфизмов данных генов изучено для жителей Москвы, Екатеринбурга, Барнаула и Новосибирска у здоровых доноров и больных с ИИ, артериальной гипертензией и венозными тромбоэмболическими осложнениями (ВТЭО) [О.А. Львова и др., 2013; А.С. Петриков и др., 2013; И.И. Чукаева и др. 2014].
В Республике Адыгея проведены исследования по ассоциации C677T и A1298C полиморфизмов гена MTHFR с ССЗ, развившимися на фоне атеросклеротических поражений сосудов разных бассейнов [А.Р. Тугуз и др., 2014], однако роль A66G и A2756G SNP генов MTRR и MTR в генезе ЦВА и ССЗ у жителей РА не изучена.
Метилентетрагидрофолат редуктаза играет ключевую роль в метаболизме фолиевой кислоты начиная с восстановления 5,10-метилентетрагидрофолата в 5-метилтетрагидрофолат, затем образования метионина из гомоцистеина и далее -S-аденозилметионина, играющего ключевую роль в процессе метилирования белков, фосфолипидов, РНК и ДНК. Дефицит MTHFR, вызванный SNP полиморфизмами, способствует развитию мутагенных процессов в молекулах ДНК [А.А. Ризванов и др., 2012].
C677/677T и A1298C аллельные варианты гена MTHFR, регулирующего метилирование ДНК исследованы преимущественно для заболеваний, развивающихся на фоне коронарного атеросклероза (КА) и в меньшей степени для цереброваскулярного. Поэтому в соответствии с поставленными целью нами проанализировано распределение C677/677T и A1298C аллелей гена MTHFR в 120 образцах ДНК, в том числе у больных ИИ (n=49) и практически здоровых доноров (n=71), (табл. 32).
В обследованных группах практически здоровых лиц и больных ЦВА не выявлено (р 0,05) достоверных различий между частотами полиморфизмов, локализованных в 677 и 1298 позициях гена MTHFR (C677/677T аллелей / С677С, C677T, Т677Т генотипов и A1298/1298C аллелей/А1298А, A1298C, С1298С генотипов). Однако, в Китае, C677T полиморфизм гена MTHFR является маркером ИИ (p 0.001) [T. Cui et al., 2016].
Учитывая возможность этногенетических различий в распределении единичных нуклеотидных замен и соответственно ассоциаций с ССЗ, мы сравнили частоты этих SNP в популяциях адыгов и русских (табл. 33, 34).
По частотам A1298/1298C аллелей гена MTHFR в обследованных группах русских и адыгов также не установлено межэтнических различий (р 0,05). Следовательно, в соответствии с приведенными выше данными, можно сделать вывод, что C677T и A1298C полиморфизмы гена MTHFR не являются фактором, повышающим риск развития ЦВА у жителей РА, несмотря на то, что в мировых БД представлена информация об ассоциации этих SNP с цереброваскулярным атеросклерозом. Возможно, при дальнейших исследованиях, на более крупных выборках, будут получены другие данные [S. Yadav et al., 2013; S. Kang et al., 2013; P.Li et al., 2014; M. Zhang et al., 2014].
Метионин-синтаза-редуктаза (MTRR) участвует в метаболизме метионина, играющего ключевую роль в синтезе белков, 1-углеродных соединений, реакций биохимического трансметилирования и в первую очередь метилирования ДНК, синтезе de novo нуклеиновых кислот. Полиморфизмы этого гена вместе с генами факторов свёртываемости крови F2 и F5 вносят больший вклад в риск развития тромбофилии. В настоящее время известно, что полиморфизм A66G в гене MTRR связан с атеросклерозом, тромбозом и др. патологическими состояниями [И.И. Ахметов, 2010].
Частоты A66/66G аллелей гена MTRR типированы в образцах ДНК обследованных группах доноров и больных ЦВА с ишемией головного мозга I-стадии (ИГМ) с исходом в ишемический инсульт (табл. 35).
По исследованным SNP одного из ключевого гена метаболизма метионина-MTRR (A66/66G аллелей, А66А, A66G, G66G генотипов) в обследованных группах доноров и больных с осложнениями ЦВА не выявлено достоверных различий (р 0,05), поэтому, предполагая возможные этногенетические различия, частоты A66G (rs1801394) полиморфизмов протестированы в зависимости от этнической принадлежности обследованных лиц (табл. 36).
При частотном распределение A66/66G аллелей гена MTRR нами не выявлено статистически значимых межэтнических различий (р 0,05) (табл. 36). Однако по данным Klenkova N.A. et al (2009) и Gaughan D.J. et al (2011), A66A генотип гена MTRR влияет на выработку гомоцистеина, приводит к гипергомоцистеинемии и развитию сердечно-сосудистых заболеваний (р=0,004) [N. A. Klenkova, et al., 2009; D.J. Gaughan, et al., 2011].
При сравнении полученных данных с результатами других авторов, можно сделать вывод, что однонуклеотидные замены и обусловленные ими ассоциации с заболеваниями могут отличаться для разных групп населения вследствие генетических вариаций, включая различия в частотах аллелей и неравновесия по сцеплению структур.
Исследование полиморфизмов гена МТR (метионин синтаза) в патогенезе ЦВА и развивающихся на его фоне прогностически неблагоприятных осложнений обусловлено его важной ролью в повторном метилировании гомоцистеина. Гипергомоцистеинемия в свою очередь увеличивает вероятность атеросклероза и тромбоза. Наиболее распространенный полиморфизм гена MTR - A2756G, с заменой аденина (А) в позиции 2756 на гуанин (G). Аллель 2756G является маркером атерогенеза и ассоциирована с врожденными аномалиями развития сердечно-сосудистой системы у плода. Исследования по ЦВА немногочисленны и весьма противоречивы [http://hugenavigator.net].
Поэтому в соответствии с поставленной целью нами протестированы A2756G полиморфизмы гена МТR как в общих группах доноров и больных с осложнениями ЦВА, так и в этнических группах обследованных лиц (табл. 37,38).
По исследованным A2756G SNP гена MTR в обследованных группах установлено статистически значимое различие в распределении A2756G генотипов и A2756/2756G аллелей: у больных повышена частота гомозиготного "мутантного" G2756G генотипа (р=0,04) и 2756G аллели (р=0,04). Таким образом, у жителей РА носительство нормального G2756G генотипа повышает риск развития осложнений ЦВА.
К аналогичным результатам пришли Kim O.J. et al, (2007), по данным которых A2756G полиморфизмы гена MTR являются маркером ИИ для населения кореи популяции (p=0,04) [O.J. Kim et al., 2007].
Этногенетический анализ распределения A2756/2756G аллелей гена MTR в обследованных группах больных и доноров выявил статистически значимое повышение частот G2756 аллели (р=0,05) у русских с ЦВА (табл. 38). Полученные результаты незначительно отличаются от аналогичных данных для здоровых этнических адыгов (0,650:0,350) и сопоставимы с данными для русских (0,720:0,280), проживающих в Европе [http://alfred.med.yale.edu].
Таким образом, из четырех исследованных аллельных вариантов генов фолатного цикла только A2756/2756G полиморфизмы гена MTR имеют прогностическую значимость при атерогенезе и могут быть использованы в качестве молекулярно-генетических предикторов осложнений цереброваскулярного атеросклероза у жителей РА. Наличие G2756G генотипа и 2756G аллели приводят к нарушению метаболизма гомоцистеина, повышает риск развития атеросклероза и тромбозов, т.к. гомоцистеин повреждает внутреннюю стенку артерий, что приводит к разрывам эндотелия. На поврежденную поверхность осаждаются холестерин и кальций, образуя атеросклеротическую бляшку, вследствие чего просвет сосуда сужается, а иногда закупоривается. [A. Mostowska et al., 2006].
Роль полиморфизмов генов цитокинов в развитии ЦВА у жителей Республики Адыгея
Воспаление является ключевым фактором, тесно связанным с атеросклерозом сосудов разных бассейнов, включая цереброваскулярную систему. Генетические факторы вносят существенный вклад в трансформацию базовой воспалительной реакции, а SNP (single nucleotide polymorphism) генов медиаторов воспаления первой волны IL-17A (G197A), 1L-1/3 (С511Т), TNF (G308A) и противовоспалительного IL-4 (С589Т) запускают триггерные механизмы, обуславливающей развитие ишемического инсульта (ИИ) [Z. Xiaolin et al., 2011]
Полиморфизмы гена основного провоспалительного IL-17A, ассоциированые с нарушением регуляции артериального давления, водно-солевого обмена, могут инициировать атерогенез. Исследования по распределению и ассоциации G197A аллелей гена IL-17A с осложнениями ЦВА в базах данных (БД) («HuGE Navigator», «PubMed», «NCBI», «ALFRED», «GeneCards») представлены единичными работами. В китайской популяции, по данным Z. Xiaolin, et al (2011), выявлена ассоциация G197 полиморфизма гена IL-17А с цереброваскулярным атеросклерозом (р 0,001; OR=0,43; 95% С1=0,33-0,58), но без уточнения локализации и клинического диагноза [Z. Xiaolin et al., 2011; http://hugenavigator.net; http://alfred.med.yale.edu; http://www.genecards.org; http://www.genepassport.ru].
Ранее проведенные в Республике Адыгея (РА) исследования по ассоциации G197A полиморфизма гена IL-17A с ССЗ, развившимися на фоне атеросклеротических поражений сосудов разных бассейнов не учитывают их роль в генезе цереброваскулярного атеросклероза (ЦВА) с исходом в ИИ, тромбоз глубоких вен, эмболии легких и болезни периферических артерий [А.Р., Тугуз и др., 2012].
В развитии цереброваскулярной патологии важная роль принадлежит плейотропному IL-1/3, участвующему в повреждении головного мозга после ишемического инсульта. Есть сведения о резком повышении экспрессии IL-1/3 в головном мозге на ранней и хронической стадии ИИ. Однако данные по ассоциации С511Т полиморфизма гена 1L-1/3 с риском развития цереброваскулярного атеросклероза весьма противоречивы. Так, при мета-анализе результатов 19 работ, включающих 5280 пациентов и 5699 доноров, значимой связи С511Т SNP гена 1L-1J5 с ишемическим инсультом не выявлено. В последующих исследованиях, выполненных на меньших выборках больных и доноров из тех же популяций показана ассоциация С511Т SNP гена IL-1/3 с развитием ИИ [J.Y. Um et al, 2003; Т. Dziedzic et al, 2005; L. Iacoviello et al., 2005; F. Ye et al, 2012; L. Zou et al, 2013; X.F. Qi et al, 2014; N.A. Rezk et al, 2015; B. Yang et al., 2015].
Противовоспалительный IL-4, продуцируемый активированными CD4+ Т-лимфоцитами (Th2), тучными клетками и эозинофилами, подавляет провоспалительную активность макрофагов и секрецию IL-1J3, TNF-a и IL-6. Данные об ассоциации С589Т SNP гена IL4 с ЦВА в мировых популяциях единичны, требуют дальнейшего изучения их роли в генезе ИИ. Связь «мутантного» 589Т аллеля гена IL-4 с ИИ для жителей Китая и Греции подтверждена Tong Y.Q. et al (2013) и Marousi S., et al (2011), но в исследованиях Park H.J., et al 2011 ассоциация не выявлена (р 0,05) [H.J. Park et al, 2011; S. Marousi et al, 2011; Y.Q. Tong et al, 2013; http://www.uniprot.org/uniprot/P05112].
Избыточная продукция фактора некроза опухоли (TNF-a), продуцируемого моноцитами и макрофагами вызывает расстройства гемодинамики (снижает сократимость миокарда, минутный объем крови, диффузно увеличивает проницаемость капилляров), оказывает цитотоксический эффект на клетки организма и может способствовать развитию ишемического инсульта (ИИ). В мировых базах данных («HuGE Navigator», «PubMed», «NCBI», «ALFRED», «GeneCards») представлены противоречивые результаты по ассоциации G308А полиморфизмов гена TNF- с ИИ [W. Swardfager et al, 2010; Y. Dowlati et al, 2010; http://hugenavigator.net; http://alfred.med.yale.edu; http://www.genecards.org; http://www.genepassport.ru].
Согласно данным Kumar P. et al (2016), Cui G. et al (2012), Tong Y. et al (2010), Кіт O.J. et al (2010), Pereira TV. et al (2007), патологическая 308A аллель может являться предиктором ИИ у некоторых популяций Китая, Кореи и Кавказа (р 0,05). Однако в исследованиях других авторов, Gu L. et al (2016), Niu Y.M. et al (2015), Wawrzynek et al (2014), Gu L. et al (2013), проведенных для жителей этих же стран, ассоциация не установлена (p 0,05) [T.V. Pereira et al., 2007; Y. Tong et al., 2010; O.J. Kim et al., 2010; G. Cui et al., 2012; L. Gu et al., 2013; A. Wawrzynek et al., 2014; Y.M. Niu et al., 2015; L. Gu et al., 2016; P. Kumar et al., 2016].
Неоднозначность данных в мировых популяциях и отсутствие подобных исследований в России и Республике Адыгея требует дальнейшего изучения роли G308A полиморфизма гена TNF- в патогенезе цереброваскулярного атеросклероза.
G197/197A аллели гена основного провоспалительного IL-17A типированы в образцах ДНК 109 жителей РА двух этнических групп: адыгов (n=56) и русских (n=53). Контрольная группа представлена неродственными донорами без признаков и наследственной отягощенности ССЗ. У обследованных больных подтверждены диагнозы ишемии головного мозга (ИГМ) 1 стадии с исходом в ишемический инсульт (n=50), окклюзии АПС (аорто - подвздошный сегмент - 2), ИНК 3-4 стадии, развившимися на фоне ЦВА -3.
При анализе распределения частот G197/197A аллелей и генотипов полиморфизма G197A гена основного провоспалительного IL-17A в общих группах больных и доноров выявлены достоверные различия, подтверждающие ассоциацию триггерного IL-17A с ишемией головного мозга (табл.49).
В группе больных ИИ по сравнению с донорами установлено статистически значимое повышение G197G генотипа IL-17A (0,618; р=0,000001). При этом риск развития цереброваскулярного атеросклероза у носителей G197G вариантов возрастает в два раза (ОR=2,18). Исходя из полученных данных, можно с большой долей вероятности утверждать, что G197G генотипы IL-17A являются факторами повышенного риска развития ЦВА.
Наше исследование подтверждает результаты Xiaolin Z.et al, (2011), по данным которых G197 полиморфизм является маркером ЦВА для жителей Китая (р 0.001) [Z. Xiaolin et al., 2011].
Этногенетические особенности в распределении полиморфных вариантов гена IL-17A и возможные ассоциации с ЦВА проанализированы в этнических группах адыгов и русских (табл. 50).
Влияние генотипов генов цитокинов на продукцию медиаторов
Повышенная функциональная активность, резервные возможности РВМС и роль хронического воспаления в развитии ЦВА подтверждена высокими уровнями провоспалительных цитокинов IL-17A, IL-1B, TNF-, выявленных в супернатантах интактных и стимулированных ФГА РВМС больных ИИ (гл. 3.6). Значительное (р 0,05) повышение концентрации исследуемых нами медиаторов (IL-17A, IL-1B, TNF-), у больных ИИ по сравнению с донорами, свидетельствует об оверэкспрессии их генов.
С целью исследования влияния G197A, Т511С, G308A и С589Т полиморфизмов генов IL-17A, IL-lp, TNF-a и IL-4 на спонтанную и стимулированную in vitro ФГА продукцию медиаторов воспаления (более информативные в сравнении с сывороточными), нами проанализированы концентрации цитокинов в супернатантах РВМС у носителей разных вариантов генотипов в норме и при ИИ (табл. 59-61).
Уровни продукции медиаторов иммунной системы могут быть обусловлены SNP, расположенными в промоторных регионах соответствующих генов. Влияние G197A (rs2275913) полиморфизмов на продукцию IL-17А PBMC в норме и при ЦВА в международных базах данных не представлены (HuGEN, Pubmed), однако имеются данные о концентрациях медиаторов в культурах интактных и стимулированных клеток при онкопатологии, бронхиальной астме и у здоровых жителей РА (HuGEN, Pubmed) [Анохина Е.Н., 2015; Руденко К.А., 2016]. Поэтому, роль SNP rs2275913 в развитии цереброваскулярных нарушений посредством влияния на уровни спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукции IL-17А PBMC, исследована у 10 больных ИИ в зависимости от носительства G197G, G197A, А197А генотипов (табл. 59).
Как следует из данных, представленных в таблице 59, в сыворотке крови и супернатантах интактных PBMC доноров и больных ИИ независимо от вариантов генотипов, IL-17A детектируется в следовых концентрациях. При действии ФГА, резервные возможности РВМС доноров и больных по продукции IL-17A резко возрастают, но у больных ЦВА достоверно выше.
Стимулированные in vitro ФГА PBMC больных с «нормальным» гомозиготным G197G генотипом продуцируют достоверно более высокие уровни IL-17А по сравнению с гетерозиготным G197А (t=4,78 при р 0,05) и гомозиготным «мутантным» А197А (t=3,89 при р 0,05) вариантами (табл. 59).
Также по стимулированной in vitro ФГА продукции основного провоспалительного IL-17A между больными ИИ и донорами с G197 полиморфизмом, в гомо- и гетерозиготном состоянии (G197G и G197A), выявлены достоверные различия (т=13,45 и т=12,59 при р 0,01).
Таким образом, G197 аллель в гомозиготном (G197G; т=13,45; р 0,01) и гетерозиготном (G197A; t=12,59; р 0,01) состоянии ассоциирована с повышенной стимулированной in vitro ФГА продукцией IL-17A РВМС.
Патогенетическая роль SNP С511Т (rs 16944) и соответствующих генотипов в развитии цереброваскулярного атеросклероза с исходом в ишемический инсульт посредством влияния на уровни спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукции IL-ip РВМС больных ЦВА в мировых популяциях практически не исследована (HuGEN, Pubmed). Поэтому в диссертационной работе экспериментально проанализирована функциональная активность и резервные возможности РВМС доноров и больных ЦВА с исходом в ИИ по продукции IL-ір. С этой целью методом ИФА определены уровни медиатора в культуральной среде интактных и стимулированных мононуклеарных клеток периферической крови в зависимости от вариантов генотипов промоторного региона гена IL-1/3 (табл. 60).
511С аллель в гомо- и гетерозиготном состоянии ассоциирована с повышенной стимулированной продукцией IL-lp (р 0,01) преимущественно у больных ИИ. Несмотря на низкие уровни спонтанной продукции IL-lp РВМС доноров, у лиц с гетерозиготным С511Т генотипом по сравнению гомозиготным нормальным С511С и мутантным Т5ПТ, статистически значимо повышена продукция IL-ip.
Между донорами и больными ИИ выявлены достоверные различия по стимулированной in vitro ФГА продукции IL-1J3: С511Т и Т511Т генотипы у больных в отличие от доноров ассоциированы с повышенной секрецией IL-lp (табл. 60).
Таким образом, у больных ЦВА с исходом в ИИ в отличие от доноров достоверные различия установлены по стимулированной in vitro ФГА РВМС продукции IL-ip. Носительство С511Т (т=6,29; р 0,05) и Т511Т (т=13,19; р 0,01) генотипов ассоциировано с повышенной секрецией IL-lp.
TNF-a обладает широчайшим спектром биологической активности, стимулирует различные звенья иммунной системы, изменяет экспрессию многих цитокинов, индуцирует гибель клеток путём апоптоза, учавствует в поддержании воспаления и активирует макрофаги, тем самым поддерживает атерогенез. Влияние G308A (rsl800629) полиморфизмов на продукцию TNF-a РВМС в норме и при ЦВА в БД представлены единичными работами (HuGEN, Pubmed). Показано, что 308А аллель повышает, а G308 не влияет на продукцию TNF-a [Hoffmann S.C et al., 2002].
Уровни спонтанной, стимулированной in vitro ФГА продукции TNF-a РВМС больных ИИ и доноров сравнивали между носителями нормального гомозиготного G308G, гетерозиготного G308A и патологического гомозиготного А308А генотипов. (табл. 61).
В сыворотке крови больных ИИ концентрации TNF-a находятся в следовых количествах и статистически не отличаются от доноров, поэтому исследована спонтанная и стимулированная in vitro ФГА продукция TNF-a в соответствии с G308G, G308A и А308А вариантами генотипов. 308А аллель гена TNF-a, в гомо- и гетерозиготном состоянии (А308А, G308A) у больных ЦВА ассоциирована с достоверно повышенной спонтанной продукцией TNF-a. У больных ИИ в отличие от доноров G308G генотип подавляет, a GA, АА генотипы повышают способность интактных РВМС продуцировать провоспалительный TNF-a и отвечать на стимулирующее воздействие поликлонального активатора ФГА (табл. 61).
Исходя из полученных данных, повышение спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукции TNF-a ассоциировано с носительством гетерозиготного G308A (1=27,54; т=25,57; р 0,001) и гомозиготного «мутантного» А308А (1=14,39; р 0,01; т=39,77; р 0,001) генотипов у больных ИИ, проживающих в РА.