Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Особенности иммунного ответа при вич инфекции на фоне ВААРТ (обзор литературы) 13
1.1 Иммунологические особенности при ВИЧ–инфекции 13
1.1.1 Иммунологические изменения при острой ВИЧ-инфекции 13
1.1.2 Дисфункция Т-лимфоцитов при хронической ВИЧ-инфекции 15
1.1.3 Изменения цитокинового статуса при хронической ВИЧ-инфекции 18
1.2 Изменения показателей иммунной системы на фоне ВААРТ 23
1.3 Факторы со стороны ВИЧ, влияющие на эффективность ВААРТ 27
1.3.1 Генетическое разнообразие ВИЧ-1 27
1.3.2 Мутационный процесс в популяции ВИЧ-1 32
1.4 Существующие критерии эффективности ВААРТ 36
Глава 2 Материалы и методы исследования 43
2.1 Общая характеристика контингента обследованных больных с ВИЧ-инфекцией 44
2.2 Направления, методы и объем исследований 49
Глава 3. Анализ эффективности высокоактивной антиретровирусной терапии с учетом вирусологического и иммунологического ответа 54
3.1 Клинико-лабораторные особенности пациентов, достигших вирусологического и иммунологического ответа на фоне ВААРТ (I группа), до начала терапии 55
3.2 Клинико-лабораторные особенности пациентов с ВИЧ-инфекцией, не достигших вирусологического и иммунологического ответа на фоне лечения (II группа), до начала терапии 59
3.3 Сравнительные данные оценки клинико-лабораторных параметров у пациентов до начала ВААРТ 62
3.4 Сравнение клинико-лабораторных показателей пациентов с ВИЧ-инфекцией I и II групп на фоне ВААРТ 66
3.5 Характеристика результатов молекулярно-генетического исследования лекарственной устойчивости у ВИЧ-инфицированных пациентов 73
3.5.1 Характеристика результатов молекулярно-генетического исследования лекарственной устойчивости к ингибиторам протеазы у ВИЧ-инфицированных пациентов 73
3.5.2 Характеристика результатов молекулярно-генетического исследования лекарственной устойчивости к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы у ВИЧ-инфицированных пациентов 77
3.5.3 Характеристика результатов молекулярно-генетического исследования лекарственной устойчивости к ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы у ВИЧ-инфицированных пациентов 80
3.5.4 Распространенность мутаций резистентности к ИП, НИОТ и ННИОТ у пациентов с ВИЧ-инфекцией 83
Глава 4 Цитокиновый статус и его оценка у пациентов с учетом лекарственной устойчивости ВИЧ 86
4.1 Оценка профиля цитокинов на фоне развития лекарственной устойчивости ВИЧ 87
4.1.1 ИЛ-2 в сыворотке крови у пациентов с ВИЧ-инфекцией с учетом лекарственной устойчивости 90
4.1.2 ИЛ-6 в сыворотке крови у пациентов с ВИЧ-инфекцией с учетом лекарственной устойчивости 93
4.1.3 ИЛ-16 в сыворотке крови у пациентов с ВИЧ-инфекцией с учетом лекарственной устойчивости 95
4.1.4 ИЛ-23 в сыворотке крови у пациентов с ВИЧ-инфекцией с учетом лекарственной устойчивости 97
4.1.5 ФНО- в сыворотке крови у пациентов с ВИЧ-инфекцией с учетом лекарственной устойчивости 100
Глава 5 Иммунологические предикторы лекарственной устойчивости ВИЧ к высокоактивной антиретровирусной терапии 104
5.1 Анализ корреляций между показателями цитокинов, CD4+-лимфоцитов и вирусной нагрузки с учетом лекарственной устойчивости ВИЧ 104
5.2 Оценка иммунологических предикторов с учетом лекарственной устойчивости ВИЧ 110
Заключение 119
Выводы 132
Рекомендации для внедрения результатов исследования в медицинскую науку и практическое здравоохранение 134
Список сокращений 135
Список литературы 137
- Изменения цитокинового статуса при хронической ВИЧ-инфекции
- Сравнение клинико-лабораторных показателей пациентов с ВИЧ-инфекцией I и II групп на фоне ВААРТ
- Распространенность мутаций резистентности к ИП, НИОТ и ННИОТ у пациентов с ВИЧ-инфекцией
- Оценка иммунологических предикторов с учетом лекарственной устойчивости ВИЧ
Изменения цитокинового статуса при хронической ВИЧ-инфекции
Как известно, CD4+Т-лимфоциты в зависимости от набора секретируемых цитокинов делятся на Т-хелперы первого и второго типов, а также Т-хепперы 17 и Тreg. Т-хелперы 1-го типа вырабатывают ИЛ-2 и ИФН-, которые стимулируют эффекторные механизмы иммунной системы и оказывают свое влияние на CD8+Т-лимфоциты, натуральные киллеры и макрофаги [211]. Т-хелперы 2-го типа вырабатывают ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10 и ИЛ-13, активирующие гуморальный иммунный ответ [90]. Кроме того, при ВИЧ-инфекции большая роль принадлежит моноцитам/макрофагам, продуцирующим цитокины и хемокины. Их функция нарушается в результате снижения числа CD4+Т-хелперных лимфоцитов и их активности [221]. Провоспалительный клон макрофагов М1 продуцирует ИЛ-6, ИЛ-12, ФНО, внося свой вклад в дисбаланс цитокиновой сети [230]. Установлено, что увеличение провоспалительных цитокинов в плазме ВИЧ-инфицированных пациентов приводит к усилению активности рецептора запрограммированной смерти PD-1 на моноцитах [245].
Цитокины представляют собой универсальную регуляторную систему медиаторов, контролирующих процессы пролиферации и дифференцировки клеточных элементов в кроветворной, иммунной и других гомеостатических системах организма [68]. Феномен масштабных изменений в синтезе цитокинов иммунокомпетентными клетками при ВИЧ-инфекции получил название «цитокиновый шторм». Этот термин отражает ответ иммунной системы на внедрение и дальнейшую репликацию ВИЧ-1 и по сути своей описывает высокую степень рассогласованности в цитокиновой регуляции, в которую вмешивается инфекционный агент. Проникновение вируса в лимфоидную ткань вызывает иммунный ответ, включающий в себя в том числе синтез и продукцию цитокинов [133; 227]. Локальное поддержание значительных концентраций некоторых из них, а также снижение концентраций ряда других цитокинов, активирует экспрессию ВИЧ, находящегося в интегрированном состоянии в инфицированных клетках. Оппортунистические инфекции способствуют прогрессированию заболевания за счет дополнительной стимуляции иммунитета и влияния тем самым на синтез цитокинов [35; 206]. Комплекс цитокиновых эффектов даже при относительной иммунологической стабильности способствует поддержанию постоянного уровня экспрессии вируса, в том числе и на бессимптомной стадии инфекции [164].
В ряде исследований было показано, что изменения в продукции цитокинов опосредуются вирусными белками и приводят к необратимым изменениям в иммунной системе, и в конечном итоге – к развитию терминальной стадии ВИЧ [215; 224].
ВИЧ-1 использует активацию синтеза цитокинов и их биологические эффекты для регуляции своей экспрессии и поддержания состояния латентности. При этом формируется механизм обратной связи взаимного влияния вирусной экспрессии и синтеза цитокинов: ВИЧ активирует продукцию ряда цитокинов на высоком уровне, они усиливают экспрессию вируса, увеличение популяции антигена вновь стимулирует синтез цитокинов [8; 192]. Продукция цитокинов не является универсальной и контролируется типом клетки [69]. Изменения вирусной репликации под воздействием цитокинов составляют суть концепции цитокин-индуцированных изменений пермиссивности вируса. Среди регулирующих экспрессию ВИЧ цитокинов наиболее известны ИЛ-1 ( и ), ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО- [258].
Фактор некроза опухолей (ФНО-, или TNF) является одним из провоспалительных цитокинов. Его воздействие на клетки приводит к развитию и поддержанию воспалительного ответа на различные антигены за счет продукции других цитокинов и хемоаттрактантов [283]. ФНО- играет решающую роль в экспрессии вирусного генома. Это связано с тем, что и экспрессию ФНО-, и экспрессию LTR (длинные концевые повторы – единственный промотор транскрипции ВИЧ) контролируют одни ядерные транскрипционные факторы (NFkB). ВИЧ-1 напрямую индуцирует продукцию ФНО-, который затем способствует репликации вируса, находящегося в клетке в состоянии латентности [30; 137]. ФНО-, в свою очередь, усиливает синтез и продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-1 и ИЛ-6, которые также усиливают экспрессию генома ВИЧ-1 [236]. ФНО- является одним их индукторов М1 поляризации макрофагов, которые начинают продуцировать провоспалительные цитокины, такие как IL-12, IL-18 и вновь ФНО-, и большее количество воспалительного белка макрофагов 1 (MIP-1), который способен подавлять репликацию штаммов ВИЧ [104].
Однако, ФНО- вносит не только негативный вклад в течение ВИЧ-инфекции: он оказывает цитолитическое действие на инфицированные клетки и является медиатором киллинга у цитотоксических CD8+Т-лимфоцитов и натуральных киллеров. Кроме того, ряд исследователей полагают, что цитотоксическое действие на пораженные ВИЧ клетки ФНО- реализует посредством апоптоза [30].
В целом, можно отметить, что чем выше продукция ФНО-, тем выше уровень репликации вируса. Некоторые исследователи полагают, что определение этого цитокина в крови ВИЧ-инфицированных пациентов имеет прогностическую значимость и ухудшает прогноз, при этом уменьшение уровня ФНО- свидетельствует об эффективности ВААРТ [30].
Другим важным патогенетическим звеном является утрата Т-лимфоцитами способности продуцировать ИЛ-2. Вирусные белки не влияют напрямую на его синтез; снижение концентрации ИЛ-2 опосредовано интеграцией вирусного генома рядом с регуляторными последовательностями гена ИЛ-2, что приводит к подавлению его синтеза. Будучи Т-клеточным ростовым фактором, ИЛ-2 влияет на дифференцировку Т-лимфоцитов, активность натуральных киллеров (NK-клетки), хелперную активность CD4+Т-лимфоцитов и их способность реагировать на повторное введение антигена. Дефицит его нарастает с прогрессией заболевания и совпадает со снижением количества CD4+Т-лимфоцитов [145].
По другому пути увеличивает продукцию вируса ИЛ-6 – он усиливает трансляцию РНК ВИЧ. Физиологический эффект ИЛ-6 заключается в воздействии на пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов. Тем самым он играет ведущую роль в поликлональной активации В-клеток. ИЛ-6 секретируется в первую очередь Т-лимфоцитами памяти, которые являются преимущественной мишенью для инфицирования ВИЧ. Таким образом, заражение Т-лимфоцитов памяти сопровождается секрецией этого цитокина и, следовательно, поддержанием процесса поликлональной активации В-лимфоцитов [147; 214].
Повышение уровней ИЛ-6 не зависит от наличия у больного сопутствующей инфекции. Данные исследования, проведенного в Южной Африке, свидетельствуют, что высокая концентрация ИЛ-6 до начала лечения на поздних стадиях ВИЧ-инфекции может быть предиктором повышенного риска смертности после начала ВААРТ в группе обследованных пациентов [240]. В этом же исследовании не было отмечено корреляции между уровнем ИЛ-6 и ВН.
Интерес вызывают исследования, свидетельствующие о роли ИЛ-6 в качестве предиктора возрастных заболеваний, включая астению и смертность, на фоне преждевременного иммунного старения при инфицировании ВИЧ [175; 180]. Связанное с возрастом хроническое воспаление и дисрегуляция иммунной системы считаются вероятными механизмами иммуногенности при ВИЧ-инфекции. Среди биомедиаторов, ответственных за хроническое воспаление и старение, в научной литературе описаны ИЛ-6 и ФНО- [114; 139; 280]. Таким образом, устойчивое состояние воспаления и иммунной активации даже при подавлении вирусной репликации на фоне ВААРТ связано со старением, функциональной недостаточностью и развитием терминальной стадии инфекции.
В другом исследовании было показано, что ИЛ-6 стимулирует Т-клеточную пролиферацию in vitro, следовательно, как полагают авторы, ИЛ-6 может вызывать прогрессирование ВИЧ-инфекции [30]. В активированных Т-лимфоцитах вирус размножается больше и активнее, чем в покоящихся, а значит, и индуцированная этим цитокином Т-клеточная пролиферация может привести к увеличению количества Т-клеток, в большой степени подверженных инфицированию.
CD8+Т-лимфоциты также продуцируют специфический хемотаксический фактор ИЛ-16, воздействующий на CD4+Т-лимфоциты и являющийся для них хематтрактантом. Его действие основано на блокировании клеток этой субпопуляции, вследствие чего ИЛ-16 блокирует вирусную репликацию. Кроме того, ИЛ-16 защищает от апоптоза Т-лимфоциты, стимулированные ИЛ-2 [110].
Сравнение клинико-лабораторных показателей пациентов с ВИЧ-инфекцией I и II групп на фоне ВААРТ
Нами была проведена сравнительная оценка динамики клинико-лабораторных показателей пациентов I и II групп на фоне высокоактивной антиретровирусной терапии через шесть, двенадцать и восемнадцать месяцев после начала ВААРТ.
При изучении жалоб, предъявляемых пациентами I группы во время проведения высокоактивной антиретровирусной терапии, было установлено снижение частоты всех изучаемых клинических проявлений по мере увеличения срока ВААРТ. На фоне ВААРТ через 18 месяцев наблюдения полностью исчезли такие клинические проявления, как кожный зуд, геморрагический синдром, боли в мышцах и суставах. При оценке достоверности снижения частоты клинических проявлений до начала ВААРТ и спустя 18 месяцев было установлено статистически значимое снижение (Р95%) частоты всех жалоб, предъявляемых пациентами (Рисунок 9).
При оценке жалоб, предъявляемых пациентами II группы при проведении ВААРТ, также было выявлено снижение частоты всех изучаемых клинических проявлений по мере увеличения срока ВААРТ. При оценке достоверности снижения частоты клинических проявлений до начала ВААРТ и спустя 18 месяцев было установлено, что статистически значимое снижение (Р95%) регистрировалось для таких жалоб, как диарея, потеря массы тела, нарушение сна, кожный зуд, боли в мышцах и суставах (Рисунок 10).
Снижение частоты таких клинических проявлений, как слабость, тошнота, геморрагический синдром, на протяжении 18 месяцев терапии было статистически не значимым (Р 95%).
При сравнении частоты клинических проявлений у пациентов I и II групп через 18 месяцев после начала ВААРТ были получены следующие данные (Таблица 13).
При сравнении частоты клинических проявлений у пациентов I и II групп через 18 месяцев после начала ВААРТ была установлена статистически достоверная разница в снижении частоты предъявляемых жалоб в отношении следующих симптомов: слабость (13,3% против 68,8% соответственно; Р 95%), тошнота (20,0% против 56,6% соответственно; Р 95%), диарея (6,7% против 37,7% соответственно; Р 95%), потеря массы тела (23,3% против 49,1% соответственно; Р 95%), кожный зуд (0,0% против 11,3% соответственно; Р 95%), геморрагический синдром (0,0% против 9,4% соответственно; Р 95%).
При сравнительной оценке уровней С04+Т-лимфоцитов была отмечена тенденция к росту показателей в обеих исследуемых группах пациентов. Достоверно значимые различия были установлены у пациентов I и II групп в стадии 4А (через 6 месяцев терапии 462,3±31,3 кл/мкл по сравнению с 439,3±23,6 кл/мкл соответственно, р 0,05; через 12 месяцев терапии 498,2±24,0 кл/мкл по сравнению с 454,2±23,6 кл/мкл соответственно, р 0,001; через 18 месяцев терапии 514,9±22,4 кл/мкл по сравнению с 463,4±23,8 кл/мкл соответственно, р 0,001); у пациентов I и II групп в стадии 4Б (через 12 месяцев терапии 375,1±22,8 кл/мкл по сравнению с 343,9±26,1 кл/мкл соответственно, р 0,01; через 18 месяцев терапии 391,5±20,1 кл/мкл по сравнению с 352,8±25,7 кл/мкл соответственно, р 0,001); у пациентов I и II групп в стадии 4В (через 6 месяцев терапии 251,6±10,1 кл/мкл по сравнению с 206,7±24,2 кл/мкл соответственно, р 0,001; через 12 месяцев терапии 271,0±22,3 кл/мкл по сравнению с 215,1±22,3 кл/мкл соответственно, р 0,001; через 18 месяцев терапии 282,0±8,8 кл/мкл по сравнению с 220,4±21,1 кл/мкл соответственно, р 0,001). Уровни С04+Т-лимфоцитов достоверно не отличались у пациентов I и II групп в стадии 4А через 6 месяцев после начала ВААРТ (348,4±23,6 кл/мкл по сравнению с 331,3±27,9 кл/мкл соответственно, р 0,05) (Таблица 14).
При сравнительной оценке уровней С04+Т-лимфоцитов у пациентов исследуемых групп без учета стадий ВИЧ-инфекции через 18 месяцев ВААРТ были выявлены достоверные различия в уровнях С04+Т-лимфоцитов (419,4±94,6 кл/мкл у пациентов I группы по сравнению с 355,4±96,5 кл/мкл у пациентов II группы, р 0,01).
При сравнительной оценке уровней ВН ВИЧ была выявлена статистически достоверная разница показателей в обеих исследуемых группах пациентов (Таблица 15).
Уровни ВН ВИЧ у пациентов I группы были достоверно ниже, чем у пациентов II группы в стадии 4А (через 6 месяцев терапии 80,8±77,8 копий/мл против 2029,8±689,2 копий/мл соответственно, р 0,001; через 12 месяцев терапии 0 копий/мл против 4723,6±958,9 копий/мл соответственно, р 0,001; через 18 месяцев терапии 0 копий/мл против 10651,2±1921,4 копий/мл соответственно, р 0,001); в стадии 4Б (через 6 месяцев терапии 162,7±144,2 копий/мл против 16998,0±8222,8 копий/мл соответственно, р 0,001; через 12 месяцев терапии 105,0±72,5 копий/мл против 8021,6±6306,6 копий/мл соответственно, р 0,001; через 18 месяцев терапии 0 копий/мл против 8072,3±5383,4 копий/мл соответственно, р 0,001); в стадии 4В (через 6 месяцев терапии 757,3± 154,7 копий/мл против 38306,1±9866,0 копий/мл соответственно, р 0,001; через 12 месяцев терапии 107,1±73,2 копий/мл против 18026,9±5384,0 копий/мл соответственно, р 0,001; через 18 месяцев терапии 0 копий/мл против 9141,6±3176,7 копий/мл соответственно, р 0,001).
При сравнительной оценке уровней ВН ВИЧ у пациентов исследуемых групп без учета стадий ВИЧ-инфекции через 18 месяцев ВААРТ были выявлены достоверные различия в уровнях вирусной нагрузки (0 копий/мл у пациентов I группы по сравнению с 9230,6±3976,8 копий/мл у пациентов II группы, p0,001).
Таким образом, при сравнительной оценке клинико-лабораторных показателей пациентов обеих групп было установлено, что для больных I группы, достигших вирусологического и иммунологического успеха ВААРТ характерны более высокие уровни CD4+Т-лимфоцитов в динамике, чем у больных II группы, не достигших ожидаемого ответа на ВААРТ. Наибольший прирост абсолютного количества CD4+Т-лимфоцитов наблюдался у пациентов в стадии 4А. Это согласуется с имеющимися литературными данными о лучшей способности к восстановлению иммунных клеток при их относительно высоком исходном количестве [40]. Наименьший прирост CD4+Т-лимфоцитов наблюдался у пациентов II группы 4В стадии.
Уровни вирусной нагрузки ВИЧ у всех пациентов I группы 4А стадии достигли неопределяемого уровня через 12 месяцев от начала ВААРТ, что свидетельствует об успешной высокоактивной антиретровирусной терапии. У пациентов на стадиях 4Б и 4В неопределяемый уровень был достигнут в целом спустя 18 месяцев от начала ВААРТ, что может быть результатом более высоких исходных уровней ВН ВИЧ, чем у пациентов в стадии 4А. У пациентов II группы недетектируемая вирусная нагрузка не была достигнута к 18 месяцам ВААРТ и регистрировалась на максимальных уровнях у пациентов в стадии 4В.
Исследование резистентности методом секвенирования проводилось у пациентов, получавших ВААРТ, но не достигших вирусологического, или вирусологического и иммунологического успехов. У таких пациентов ВН ВИЧ варьировала в пределах от 3230 копий/мл до 18420 копий/мл во время проведения терапии. Известно, что репликация ВИЧ при инфекции, вызванной исключительно «диким вариантом» вируса, достигает высоких уровней [7].
К оценке резистентности уровень CD4+Т-лимфоцитов не имеет прямого отношения. Именно репликация вируса непосредственно реагирует на терапию, а ответ иммунной системы не всегда и не сразу соответствует изменениям уровня ВН. Ниже представлены данные уровней С04+Т-лимфоцитов и ВН ВИЧ у пациентов II группы, которым было проведено исследование лекарственной резистентности ВИЧ (Таблица 16).
Распространенность мутаций резистентности к ИП, НИОТ и ННИОТ у пациентов с ВИЧ-инфекцией
Выше мы описали особенности возникновения мутаций лекарственной устойчивости для каждой гру1пы применяемых антиретровирусных препаратов. Однако, спектр возникающих мутаций у каждого конкретного пациента необходимо оценивать в целом с учетом всех возникающих изменений, поскольку только комплексный подход в оценке изменений генома ВИЧ позволяет сделать адекватные выводы по коррекции терапии. Вирусный квазивариант, который приобрел одну или более мутаций резистентности, снижающих чувствительность к действию препаратов ВААРТ, в присутствии этих препаратов начинает размножаться быстрее, чем вирус дикого варианта. Соответственно, он легче ускользает из-под надзора иммунной системы.
Данные совокупной оценки выявленной ЛУ среди пациентов исследуемой группы представлены ниже (Таблица 23).
При оценке структуры резистентности у пациентов с сохраняющейся ВН было установлено, что у части больных (41,5%) мутации резистентности выявлены не были. При объяснении этого факта следует обратиться к заявленным особенностям используемой в исследовании тест-системы для проведения генетического исследования.
Любая тест-система имеет установленный диапазон чувствительности с границами, в пределах которых получаемый при исследовании результат считается достоверным. Генотипирование ВИЧ-1 с помощью коммерческих тест-систем также имеет свои ограничения. В данном случае при использовании комплекта ViroSeq «HIV-1 Genotyping System» v 2.0 (Celera Diagnostics, Abbott, США) выявление мутаций возможно только при достижении вариантов ВИЧ-1, несущих искомые мутации, уровня в 20% от всей вирусной популяции, согласно инструкции производителя. Если общее количество мутантных вариантов ниже этого порогового уровня, то результат генетического исследования может быть отрицательным, то есть клинически не значимым. По достижении уровня 20% от вирусной популяции возникающие мутации резистентности могут оказывать влияние на формирование вирусологического ответа. Тем не менее, отрицательный результат генотипирования не исключает возможности формирования мутаций резистентности, которые будут выявлены в будущем при их накоплении. С другой стороны, отсутствие детектируемых мутаций при сохранении ВН позволяет предполагать и преобладание дикого варианта ВИЧ-1 на фоне низкой приверженности ВААРТ, что характерно для пациентов исследуемой группы.
Все вышеизложенное позволило нам разделить пациентов на две группы на основании результатов, полученных в ходе молекулярно-генетического исследования. Больные со сформированной лекарственной устойчивостью на фоне сохраняющейся репликации ВИЧ (31 человек) и больные без лекарственной устойчивости также на фоне репликации ВИЧ (22 человека) в дальнейшем исследовании уровней цитокинов рассматривались нами как самостоятельные группы.
При оценке характера выявленной ЛУ было установлено, что наиболее часто у больных регистрировалась резистентность к НИОТ и ННИОТ, как в комплексе, так и по отдельности к препаратам этих групп. Низкий уровень приверженности терапии в сочетании с низким ГБ, характерным для этих терапевтических групп, способствуют быстрому и относительно легкому возникновению мутаций резистентности. Назначение НИОТ и ННИОТ требуют полного соблюдения режимов приема и дозировки пациентами и тщательного контроля за терапией врачом при динамическом наблюдении за больными.
Количество случаев возникновения мутаций резистентности к ИП невелико, но особого внимания заслуживают случаи одновременного возникновения мутаций резистентности к препаратам трех используемых классов – ИП, НИОТ и ННИОТ. Среди пациентов исследуемой группы их количество составляет 7,5% (4 человека).
При неэффективности ВААРТ необходимо исключать все возможные причины, в том числе соблюдение режима приема лекарственных препаратов, нарушение их метаболизма, особенности взаимодействия друг с другом и с другими лекарственными препаратами. Тем не менее, только исследование лекарственной устойчивости ВИЧ позволяет сделать конкретные выводы об адекватности проводимой терапии, провести ее коррекцию и добиваться вирусологического успеха ВААРТ, наблюдая за изменением вирусной популяции в каждом отдельном случае.
Оценка иммунологических предикторов с учетом лекарственной устойчивости ВИЧ
В нашем исследовании мы выявили целый ряд факторов, которые в той или иной степени изменялись на фоне проводимой антиретровирусной терапии и различались в группах пациентов в зависимости от наличия или отсутствия лекарственной устойчивости ВИЧ. Для их анализа и оценки по отдельности мы использовали различные статистические методы (непараметрический критерий Манна-Уитни, корреляционный анализ). Однако, для анализа совокупного действия потенциальных биомаркеров в развитии такого нежелательного явления антиретровирусной терапии, как лекарственная устойчивость, мы использовали иной подход. С целью прогнозирования у пациентов риска развития лекарственной устойчивости нами были использованы модели логистической регресии [100]. Метод логистической регрессии используется в качестве инструмента по разработке математико-статистической модели прогноза вероятности наступления лекарственной устойчивости при наличии двух возможных вариантов исхода.
Логистическая регрессия представляет собой разновидность множественной регрессии, общее назначение которой состоит в анализе связи между несколькими независимыми переменными (называемыми также регрессорами или предикторами) и зависимой переменной. Таким образом, с помощью данной статистической модели возможно предсказание вероятности возникновения некоторого события по значениям множества признаков. В нашем случае предикторами логистической регрессии являются показатели исследуемых цитокинов, а независимой переменной – факт наличия или отсутствия лекарственной устойчивости.
Для решения задачи на первом этапе мы использовали корреляционный анализ и диаграммы размаха, позволившие нам выявить наиболее перспективные для выделения групп пациентов биомаркеры. Ими оказались ИЛ-16, ИЛ-6, ИЛ-2 (Рисунок 21).
Прямые линии внутри «короба» - медиана. Внутри «короба» - значения 95%-х доверительных интервалов для медиан. Вертикальные отрезки под и над «коробами» - «усы», которые накрывают наибольшее и наименьшее наблюдаемые значения, укладывающиеся в три межквартильных интервала.
Далее, были определены условия, которые позволяют сформировать дерево решений для выделения больных с лекарственной устойчивостью (Таблица 31). Условия выделения позволяют выделить пациентов либо только с лекарственной устойчивостью, либо только тех, у кого ее нет. Среди приведенных условий нет условий, которые бы выделяли пациентов двух групп одновременно.
Из-за того, что размах значений ФНО- у пациентов без лекарственной устойчивости лежит полностью внутри размаха значений ФНО- пациентов с лекарственной устойчивостью, условия выделения по фактору ФНО- отсутствуют.
Минимально достаточное решающее дерево для выделения всех пациентов с лекарственной устойчивостью (31 человек) выглядят следующим образом: пациенты с ЛУ = ИЛ-6 12,0 пг/мл, или ИЛ-16 26,15 пг/мл (1)
Для графического представления предложенного правила в иерархической структуре нами была предложена модель дерева решений. Дерево решений предполагает, что у модели существует несколько вариантов развития событий. Каждое решение, принимаемое по модели, определяет один из сценариев его дальнейшего развития (Рисунок 22).
С помощью других цитокинов также можно сформулировать правило, например, правило выделения пациентов без лекарственной устойчивости: пациенты без ЛУ = ИЛ-6 13,9 пг/мл, или ИЛ-16 24,15 пг/мл, или ИЛ-23 2,48 пг/мл (3)
Соотношение (3) позволяет выделять 21 из 22 пациентов без лекарственной устойчивости. Используя совместно правила (1) - (3), можно, например, сделать следующее заключение: если у пациента значения показателя ИЛ-16 24,15 пг\мл, то у него нет лекарственной устойчивости. Если у пациента ИЛ-16 26,15 пг/мл, то у него есть лекарственная устойчивость. Если у пациента 24,15 пг/мл ИЛ-16 26,15 пг/мл, то надо анализировать ИЛ-6. Если при этом ИЛ-6 12,0 пг/мл, то у пациента нет лекарственной устойчивости, в противном случае лекарственная устойчивость у пациента есть.
Нами построены логистические модели, из которых наилучшие результаты получены для модели вида: Ln(P(y=1)/P(y=0)) = 2,34 ИЛ-16 - 58,65 (4)
Модель имеет p 0,0001. Она определяет, что отношение шансов иметь лекарственную устойчивость повышается в 10,34 раза при увеличении ИЛ-16 на 1. При этом значимость предиктора ИЛ-16 p 0,01. Для сравнения моделей с разным числом параметров для выделения наилучшего набора объясняющих гипотезу переменных нами был использован информационный критерий Акаике (AIC). Для модели (4) он составляет 15,14.
Проверка модели (4) показала ошибку выделения пациентов с лекарственной устойчивостью и без нее для двух случаев. В первом случае для 1 из 31 пациента с лекарственной устойчивостью была определена вероятность иметь ЛУ всего 22%. Во втором случае для 1 из 22 пациентов без лекарственной устойчивости была определена вероятность иметь ЛУ с вероятностью 91,5%. Во всех остальных случаях вероятности представлены ниже (Таблица 32).
Для того, чтобы дать оценку качеству модели по разделению двух классов на основе определения точки отсечения непрерывного или дискретного количественного признака была построена ROC-кривая (Рисунок 23) [20].
Кроме графика ROC-кривой, для оценки качества модели используется характеристика площади под кривой ROC AUC (Area under ROC). Можно считать, что чем больше показатель AUC, тем лучшей прогностической силой обладает модель. Вся площадь в рамках осей графика равна 1, а площадь под кривой – в долях 1. Чем выше значение площади под ROC-кривой, тем лучше качество модели [86]:
– 0,9–1,0 – отличное;
– 0,8–0,9 – очень хорошее,
– 0,7–0,8 – хорошее;
– 0,6–0,7 – среднее;
– 0,5–0,6 – неудовлетворительное.
Площадь под кривой в нашем исследовании составила 0,993, что свидетельствует об отличном качестве предложенной модели.
В качестве альтернативы использованию интерлейкинов в качестве основных маркеров наличия лекарственной устойчивости нами была также построена логистическая модель на основе показателей CD4+ Т-лимфоцитов и вирусной нагрузки ВИЧ: Ln(P(y=1)/P(y=0)) = -0,075 CD4 - 0,002 Вирусная нагрузка + 46,36 (5)
Оба предиктора модели (5) значимы с p 0,05. Модель в целом имеет p 0,001. Информационный критерий Акаике AIC = 20,3. Анализ результатов прогноза на основе модели (5) показал, что все пациенты с ЛУ имеют вероятность наличия признака резистентности более 44%, при этом у 27 пациентов вероятность была более 91,5%, а у 4-х - варьировала от 44% до 62%. Среди 22 пациентов без лекарственной устойчивости один пациент оценивался как имеющий признак резистентности с вероятностью 91,5%, два пациента имели вероятность резистентности 44% и 55% соответственно, остальные 18 - от 0% до 16%. Площадь под ROC-кривой = 0,988, что подтверждает отличное качество модели (5).
Модель (5), позволяющая оценить риски иметь ЛУ на основании CD4+ Т-лимфоцитов и вирусной нагрузки, может представлять интерес в отсутствии данных об ИЛ-16. По всем характеристикам модели, в том числе значимости модели в целом, значимости предикторов, площади под ROC-кривой, критерию Акаике эта модель хуже модели (4), но ее преимуществом является использование только широко применяемых результатов исследований крови, без необходимости расширять спектр клинических лабораторных исследований.