«Клиническое значение определения наивных Т- и В- клеток у больных с опухолями иммунной системы» Образцов Игорь Владимирович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 12

1.1. Опухоли лимфоидного ростка и иммунная дисрегуляция, их сопровождающая 12

1.1.1. Клинико-молекулярная характеристика ОЛЛ 12

1.1.2. Транслокации (12;21) и слияние TEL-AML1 15

1.1.3. Транслокации MLL 16

1.1.4. Транслокации MYC 17

1.1.5. Мутации NOTCH1 17

1.1.6. Цитокиновые рецепторы 18

1.1.7. Каскады PTEN и PI3K-AKT 20

1.1.8. Слияние BCR-ABL и BCR-ABL –подобный ОЛЛ 21

1.2. Клиника ОЛЛ и иммунодефицитное состояние, индуцированное опухолевым процессом 21

1.3. Клинико-молекулярная характеристика ХЛЛ 26

1.4. Компартмент наивных лимфоцитов как показатель эффективности адаптивного ответа 1.4.1. Созревание наивных Т- и В-лимфоцитов и V(D)J рекомбинация 30

1.4.2. Дифференцировка В-клеток 38

1.4.3. Дифференцировка Т-клеток 42

1.5. Подходы к исследованию наивных лимфоцитов 46

1.5.1. Клинико-лабораторная характеристика 46

1.5.2. Примеры клинического применения 48

1.6. Расстройства созревания лимфоцитов у пациентов с опухолями иммунной системы и иммунологический ренессанс 51

Глава 2. Материалы и методы исследования 54

2.1. Клиническая характеристика больных 54

2.2. Характеристика терапии по протоколам МВ-2008 и МВ-2015 у детей с ОЛЛ 55

2.3. Характеристика терапии по схеме ФЦР у взрослых с ХЛЛ 58

2.4. Характеристика групп сравнения 59

2.5. Определение уровня эксцизионных колец 59

2.6. Статистические методы исследования 63

Глава 3. Результаты и обсуждение 76

3.1. Иммунореконституция у детей в первом остром периоде ОЛЛ 76

3.2. Иммунореконституция у детей в ремиссии ОЛЛ 101

3.3. Содержание эксцизионных колец у лиц различного возраста 103

3.4. Созревание наивных Т- и В-клеток у пациентов с различными формами ХЛЛ . 104

Заключение 115

Выводы 118

Практические рекомендации 120

Список сокращений 121

Список литературы 123

Приложение 164

• Клиника ОЛЛ и иммунодефицитное состояние, индуцированное опухолевым процессом
• Расстройства созревания лимфоцитов у пациентов с опухолями иммунной системы и иммунологический ренессанс
• Иммунореконституция у детей в первом остром периоде ОЛЛ
• Созревание наивных Т- и В-клеток у пациентов с различными формами ХЛЛ

Введение к работе

Актуальность исследования

Опухоли иммунной системы, в частности, опухоли из клеток-предшественников Т- и В-лимфоцитов являются наиболее распространенными среди гемобластозов детей и взрослых. Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) является наиболее частой формой лейкемии у пациентов детского возраста - на долю ОЛЛ приходится 75-80% всех опухолевых заболеваний иммунной системы у детей (3-4 случая на 100 тысяч детей в год) [Масчан, Мякова, 2006]. Современные химиотерапевтические подходы обеспечивают высокую вероятность достижения ремиссии, однако недостаточная иммунная реконституция становится причиной развития стойких и рецидивирующих инфекционных осложнений после окончания интенсивной фазы лечения. У взрослых удельный вес ОЛЛ в структуре опухолей иммунной системы составляет не более 20%, при этом основной патологией взрослых является хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ). Заболеваемость ХЛЛ составляет в среднем 3–3,5 случая на 100000 человек в год, увеличиваясь для лиц старше 65 лет до 20, старше 70 — до 50 случаев на 100000 человек [Никитин, 2014; Северина и др., 2014].

Формирующиеся в процессе лимфопоэза зрелые Т- и В-лимфоциты экспрессируют уникальную специфичность Т- или В-клеточного рецептора (ТКР и ВКР, соответственно). Гармоничный адаптивный иммунный ответ развивается за счёт клональной пролиферации Т- и В-клеток в ответ на антигенную стимуляцию через ТКР и ВКР. Колоссальное разнообразие специфичностей ТКР и ВКР достигается благодаря процессам соматического мутагенеза, включающим V(D)J рекомбинацию и соматическую гипермутацию [Cohn, 2016]. В редких случаях эти процессы способствуют появлению мутаций в неприспособленных для того локусах генома: активация онкогена или подавление опухолевого супрессора приводят к аномальной пролиферации и/или блоку дифференцировки [Chen, Mellman, 2017]. В результате происходит формирование и персистирование злокачественного клона, представленного фенотипически зрелыми клетками, обладающими чертами активированных В-лимфоцитов в случае ХЛЛ, или незрелыми лимфобластами при ОЛЛ [Porwit, Bene, 2015; Schmh и др., 2017]. В обоих случаях патологический клон обладает эволюционным преимуществом по сравнению с нормальными лимфоцитами за счёт избыточной активации транскрипционных факторов, ответственных за выживание и пролиферацию опухолевой стволовой клетки. Наличие патологического клона приводит к непрерывной стимуляции антигенами опухолевых клеток, вызывающей ответное формирование клонов нормальных Т- и В-лимфоцитов. Такие клоны обычно оказываются функционально неполноценными; кроме того сужение антигенного репертуара Т- и В-клеток у больных опухолями иммунной системы в результате избыточной клональной пролиферации

приводит к высокому риску инфекционных осложнений [Eyrich и др., 2009; Gutierrez, Armstrong, Look, 2013].

Поэтому для определения глубины иммунологического дефекта при ОЛЛ и ХЛЛ представляется целесообразной оценка антигенного репертуара Т- и В-лимфоцитов. Одним из перспективных подходов для решения этой задачи является количественное определение содержания эксцизионных колец Т-клеточного рецептора (ТРЭКов) и рекомбинационных колец -делеционного элемента (КРЭКов) В-клеток [Mensen и др., 2013; Sottini и др., 2014]. ТРЭКи представляют собой внехромосомные эксцизионные продукты реаранжировки гена ТКР в процессе V(D)J рекомбинации, которая происходит по мере созревания Т-лимфоцита в тимусе. Аналогичен механизм формирования КРЭКов; они являются продуктом делеции J-C-интрона при образовании нефункционального локуса IGK гена лёгких цепей иммуноглобулина. Количественная оценка содержания ТРЭКов и КРЭКов в лимфоцитах позволяет идентифицировать наивные Т- и В-клетки, покинувшие тимус или костный мозг, соответственно. ТРЭКи и КРЭКи достаточно стабильны, они не реплицируются в процессе митоза, что позволяет использовать их в качестве показателя пролиферативного потенциала тимуса и костного мозга, а также широты антигенного репертуара Т- и В-лимфоцитов [Borte и др., 2014; Kanda и др., 2012; Zelm и др., 2011].

Определение ТРЭКов и КРЭКов полуколичественными и качественными методами нашло широкое применение в области диагностики и скрининга первичных иммунодефицитов; ведутся работы по внедрению методологии в качестве мониторинга иммунной реконституции после пересадки гематопоэтических стволовых клеток [Гордукова и др., 2015; Deripapa и др., 2017; Zelm и др., 2011]. При этом на сегодняшний день отсутствуют данные по оценке иммунной реконституции до и после интенсивных режимов химиотерапии при ОЛЛ, а также глубины иммунного дефекта при ХЛЛ перед стартом специфического лечения. Кроме того, в работе впервые используется отечественная тест-система, пригодная для симультанного определения ТРЭКов и КРЭКов в образце, способная единовременно охарактеризовать содержание наивных Ти В-клеток прямым количественным образом.

Цель исследования: определить содержание и прогностическую значимость определения наивных Т- и В-клеток у больных острым лимфобластным и хроническим лимфоцитарным лейкозом.

Задачи исследования

1. Построить референсные значения ТРЭКов и КРЭКов для детей и лиц старшего возраста

2. Определить динамику содержания ТРЭКов и КРЭКов у детей с ОЛЛ в процессе лечения по протоколу МВ-2015

3. Определить содержание ТРЭКов и КРЭКов и оценить влияние различных режимов ПХТ на Т- и В-клеточный неогенез у реконвалесцентов ОЛЛ на отдалённых сроках после проведения протокола ОЛЛ-МВ-2008

4. Определить содержание ТРЭКов и КРЭКов у пациентов с ХЛЛ, имеющих показания к режиму ФЦР (флударабин, циклофосфамид, ритуксимаб), перед началом специфического лечения

5. Исследовать влияние цитогенетических и молекулярно-генетических перестроек на созревание наивных Т- и В-клеток и оценить прогностическую значимость ТРЭКов и КРЭКов у пациентов с ХЛЛ в контексте ответа на специфическую терапию

Научная новизна

Впервые проведена количественная оценка содержания ТРЭКов и КРЭКов у больных ОЛЛ и ХЛЛ с помощью отечественного набора БиТ-тест, позволяющего проводить прямую количественную оценку Т- и В-клеточного неогенеза. Построена динамика содержания ТРЭКов и КРЭКов у больных ОЛЛ на фоне лечения. Показано усиление В-клеточного неогенеза после проведения циторедукции у пациентов с ОЛЛ с последующим подавлением в процессе цитостатической терапии. Впервые показано влияние L-аспарагиназы и краниального облучения на иммунную реконституцию после констатации ремиссии у реконвалесцентов ОЛЛ.

Определён уровень ТРЭКов и КРЭКов у лиц старшего возраста; у больных ХЛЛ выявлено
значимое снижение содержания КРЭКов. Также у пациентов с ХЛЛ показано повышенное
содержание ТРЭКов в группе с мутированными генами вариабельного региона

иммуноглобулинов. Определено повышенное содержание КРЭКов у носителей мутации NOTCH1 по сравнению с пациентами, не имеющими мутаций NOTCH1. Выявлена ассоциация между высоким уровнем ТРЭКов и наступлением полной ремиссии ХЛЛ.

Практическая значимость

Предложен способ оценки содержания ТРЭКов и КРЭКов у больных с пролиферативными
гематологическими заболеваниями. Подтверждена нецелесообразность использования

высокодозного метотрексата и выполнения краниального облучения у больных ОЛЛ из-за подавления иммунной реконституции в долгосрочном периоде. Построенные референсные значения для содержания ТРЭКов и КРЭКов пригодны к использованию при оценке Т- и В-клеточного неогенеза у иммунологически скомпрометированных лиц старшего возраста. Исследование уровня ТРЭКов у больных ХЛЛ перед началом режима ФЦР даёт возможность прогнозирования наступления полной ремиссии.

Положения, выносимые на защиту

1. Тест-система для определения эксцизионных колец ТКР и ВКР, используемая в работе, применима для оценки компартмента наивных Т- и В-клеток у детей и взрослых. Построены референсные интервалы содержания ТРЭКов и КРЭКов: для детей норма содержания ТРЭКов и КРЭКов составляет, соответственно 8100 – 23600 и 10000 – 26000 копий / 10⁵ клеток у детей и 200 – 600 и 12000 – 26000 копий / 10⁵ клеток у взрослых (р = 0,95). Эти значения пригодны для использования в качестве нормативных параметров при определении количества наивных лимфоцитов у детей и взрослых с различными нозологиями. Подтверждено снижение содержания ТРЭКов, обусловленное возрастной инволюцией тимуса и характеризующее сокращение пула наивных Т-клеток по мере взросления и старения организма.

2. На клинической модели ОЛЛ показана динамика неогенеза Т- и В-клеток у детей на фоне выполнения терапевтических протоколов ОЛЛ МВ 2008 и 2015. Назначение специфического лечения способствует повышению интенсивности созревания наивных В- и Т-клеток на стадии индукции ремиссии, обусловленному подавлением активно пролиферирующего опухолевого клона. Первичное восстановление неогенеза наивных лимфоцитов сменяется его угнетением, связанным с воздействием антиметаболитов на лимфопоэтические предшественники. При этом костномозговое созревание В-клеток полностью восстанавливается в течение трёх лет после констатации ремиссии, в то время как дефицит наивных Т-клеток сохраняется. Кроме того, снижение интенсивности долгосрочного восстановления пула наивных Т-клеток выявлено в группе детей, получавших краниальное облучение. Применение ПЭГ-аспарагиназы в индукционном блоке, напротив, способствует усилению созревания наивных В-лимфоцитов у реконвалесцентов ОЛЛ.

3. Обследование пациентов с ХЛЛ выявило у них значительное подавление костномозгового созревания наивных В-клеток. Кроме того, определено снижение содержания ТРЭКов у больных ХЛЛ с немутированными генами тяжёлых цепей иммуноглобулинов, а также у носителей гомозиготного полиморфизма p53 Arg72Pro. Мутации NOTCH1 способствуют повышению интенсивности созревания В-клеток в костном мозге. Показана ассоциация между содержанием ТРЭКов и достижением полной ремиссии ХЛЛ после выполнения протокола ФЦР. Доказанная предиктивная ценность показателя даёт возможность клинического использования предлагаемого анализа для раннего прогнозирования эффекта терапии.

Внедрение результатов исследования

Результаты, полученные в ходе исследования, внедрены в практическую деятельность отдела научного проектирования и контролируемых клинических исследований ФГБУ НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачёва МЗ РФ, консультативно-диагностического центра детской иммунологии и аллергологии ГБУЗ «ДГКБ №9 им. Г. Н. Сперанского» ДЗМ и отделения клинической иммунологии и ревматологии ФГБУ «РДКБ» МЗ РФ.

Апробация работы

Результаты работы были представлены в виде устных сообщений и тезисов конференций:
10th ENII EFIS EJI Immunology Summer School, 12 – 19 мая 2015 года, Порто Черво, Италия; 5th
Translational Immunology School, 25 – 27 февраля 2016 года, Потсдам, Германия; III конгресс
гематологов России, 14 – 16 апреля 2016 года, Москва, Россия; 10th SIOP Asia Congress, 25 – 28
мая 2016 года, Москва, Россия. Апробация работы состоялась на объединённой научно-
практической конференции отделений иммунологии, детской гематологии/онкологии,
клинической онкологии, клинической физиологии; отдела оптимизации лечения
иммунодефицитов, отдела трансляционных и клеточных исследований, лаборатории цитогенетики
и молекулярной генетики, лаборатории молекулярной биологии федерального государственного
бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр детской
гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачёва» 06 июля 2017, протокол заседания
№ 2/17-18 от "06" июля 2017 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ для публикаций основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 169 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 26 рисунками. Список литературы содержит 289 библиографических источников, в том числе 21 отечественную и 268 иностранных публикаций.

Клиника ОЛЛ и иммунодефицитное состояние, индуцированное опухолевым процессом

Клинические проявления ОЛЛ многообразны и неспецифичны. Дебют заболевания обычно протекает бессимптомно, а первые клинические признаки проявляются при значительной инфильтрации костного мозга лейкемическими бластами, сопровождающей угнетение кроветворения. Миелосупрессия в первом остром периоде ОЛЛ обычно сопровождается поражением всех ростков кроветворения, проявляющимся в анемии, тромбоцитопении и гранулоцитопении. Анемия приводит к появлению одышки и сердцебиения, а также к общему снижению самочувствия; тромбоцитопения проявляется в виде геморрагического синдрома: возможны петехии и экхимозы, а также кровотечения различной локализации [15, 18, 104].

Большинство пациентов с ОЛЛ в первом остром периоде не имеют какого либо иммунодефицита, диагностированного ранее. Однако развитие опухоли само по себе является признаком иммунологической недостаточности, поскольку в норме иммунная система эффективно уничтожает клетки, вставшие на путь злокачественной трансформации [61]. Опухолевая стволовая клетка подвергается постоянному давлению со стороны иммунных эффекторов, что приводит либо к элиминации опухолевого клона, либо к его адаптации и развитию наиболее приспособленной линии под воздействием движущего эволюционного отбора.

Роль иммунной системы в этом процессе невозможно недооценить. Показано, что опухоли, полученные от иммунодефицитных RAG2-/- мышей (у которых отсутствуют клетки адаптивной защиты), обладают большим иммуногенным потенциалом по сравнению с опухолями, полученными у иммунокомпетентных животных [234]. Элиминация опухоли реализуется благодаря взаимодействию эффекторов как врождённой, так и адаптивной защиты. В результате опухолевые клетки уничтожаются значительно раньше, чем происходит какая-либо клиническая манифестация заболевания. Клетки опухоли, развившиеся под воздействием внутренних (молекулярные и хромосомные генетические аномалии) и/или внешних (ионизирующее излучение, химические канцерогены, инфекции) факторов, экспрессируют стрессорные молекулы: мембранный кальретикулин [282], опухолевые антигены в комплексе с MHC I [32, 140], а также лиганды врождённых систем распознавания (NKG2D, [271]). Эти молекулы распознаются эффекторами, ответственными за клеточно-опосредованное уничтожение злокачественно трансформированного предшественника: CD8+ цитотоксическими Т-клетками [213], NKT- [259] и NK-клетками [82], а также Т-клетками [86]. Дендритные клетки ответственны за презентацию опухолевых антигенов и передачу сигналов дифференцировки (с участием CD4+ Т-хелперов) и клональной экспансии CD8+ цитотоксическим эффекторам [38, 107]. Активированные цитотоксические лимфоциты запускают апоптоз опухолевых клеток за счёт секреции лигандов рецепторов смерти (Fas, TRAIL), а также контактным способом с помощью системы перфоринов и гранзимов [30, 264]. Также велика роль цитокинов (особенно Тh1-системы) в развитии противоопухолевого ответа [141]. Так, в процессе иммуноредактирования задействованы интерфероны обоих типов: ИФН- препятствует пролиферации и ангиогенезу опухолевых клеток [197, 245], в то время как ИФН-/ способствует активации презентации опухолевых антигенов дендритными клетками [238]. Синтез интерферонов регулируется интерлейкином (ИЛ) 12, который стимулирует также выработку фактора некроза опухоли (TNF) [84, 240]. Дополнительным источником цитокинов (интерфероны, ФНО, ИЛ-12, ИЛ-1) служат клетки врождённой защиты, относящиеся к миелоидному ростку [118, 137, 162]: макрофаги и нейтрофилы, обладающие также способностью к уничтожению опухолевых клеток за счёт наработки токсичных метаболитов активного кислорода, приводящих к развитию окислительного стресса и гибели клеток-мишеней [76, 122]. Описан также механизм контроля плоидности, задействованный в противоопухолевом иммунном ответе: анэуплоидия, особенно тетраплоидия опухолевых клеток способствует более эффективному их уничтожению. Гиперплоидные клетки подвержены постоянному эндоплазматическому стрессу, который приводит к аберрантной экспрессии кальретикулина и опухолевых антигенов, повышающих иммуногенность опухоли [167, 188]. Эти данные объясняют наличие более благоприятного прогноза у пациентов с ОЛЛ с гиперплоидным кариотипом [212]. Таким образом, преобладание факторов, повышающих иммуногенность опухоли и иммунную реактивность хозяина, в норме приводит к сдвигу равновесия в системе опухоль-хозяин в сторону элиминации злокачественных клеток; это состояние является стационарным и характеризующим адекватный противоопухолевый иммунный ответ.

Несостоятельность факторов иммунной защиты организма вместе с повышенной геномной нестабильностью опухолевого предшественника приводят к поддержанию опухолевого процесса в дормантном состоянии динамического равновесия (эквилибриум) [265]. Это состояние характеризуется персистенцией злокачественных клеток, из-за их малого количества недоступных для выявления клинико-лабораторными методами обследования. Дормантная опухоль сохраняет инфильтрацию цитотоксическими клетками врождённого и адаптивного ответа, однако на этапе эквилибриума появляются клетки, обладающие иммуносупрессивным потенциалом: Т-регуляторные клетки (Treg) [52], миелоидные клетки-супрессоры (myeloid-derived suppressor cells, MDSC) [154]. Отмечается также нарушение процессов презентации опухолевых антигенов, возникают толерогенные дендритные клетки [149]. Цитотоксические клетки, сохраняя своё количество, теряют функциональный потенциал [134]. Развивается сдвиг цитокинового ландшафта в сторону Th2-, Th17- и противовоспалительной осей, проявляющийся в секреции ИЛ-23, ИЛ-6, ИЛ-10, источниками которых служат упомянутые толерогенные и супрессорные клетки. Этап эквилибриума представляется наиболее важным в развитии злокачественного заболевания, поскольку именно на этом этапе происходит иммуноредактирование и эволюция опухолевой линии, которая, в свою очередь, модулирует иммунный ответ, развивая толерантность к опухолевым антигенам. Состояние эквилибриума, характеризующееся компенсацией опухолевого процесса, может держаться длительный период, вплоть до целой жизни организма-хозяина [77].

Клиническая картина заболевания развивается в случае декомпенсации и отказа механизмов иммунного сдерживания злокачественного клона. Декомпенсация может произойти в результате различных событий: прекращение иммунного распознавания (потеря MHC I и костимуляторных молекул) [96], развитие резистентности к апоптозу (активация STAT-3 каскада, избыточный синтез антиапоптотических белков) [63, 262], а также формирование протективного иммунного микроокружения под воздействием растворимых факторов, выделяемых клетками опухоли. К этим веществам относят семейство трансформирующего фактора роста (TGF [208]), васкулярно-эндотелиальный фактор роста (VEGF, [90]). Эти факторы в значительной мере подавляют цитотоксические свойства лимфоцитов, способствуют привлечению Treg и MDSC, а также приобретению фенотипа Treg наивными Т-клетками (формирование так называемых индуцированных Treg [128]) [39, 159], поступающими в очаг. Противовоспалительный иммуносупрессивный фенотип появляется у нейтрофилов [216, 286] и макрофагов [89, 241], которые становятся неспособными к продукции активных форм кислорода (АФК) и провоспалительных цитокинов, секретируя вместо них супрессорные молекулы. Описанные процессы усугубляются за счёт активации противовоспалительных сигнальных каскадов, таких как PD-1/PD-1L [108, 120], Tim-3/galectin-9 [72, 94], CTLA-4 [144], IDO [164] и LAG-3 [235]. В результате система опухоль-хозяин приходит в новое стационарное состояние, характеризующееся тотальным превалированием опухолевого клона и отказом систем иммунной защиты [77]. Принципы и механизмы коэволюции опухоли и иммунной системы хозяина резюмированы на рисунке 2.

Расстройства созревания лимфоцитов у пациентов с опухолями иммунной системы и иммунологический ренессанс

Приведённые данные свидетельствуют о глубине и многообразии иммунологического дефицита развивающегося у пациентов с опухолями иммунной системы. В особенности страдает иммунная система детей, поскольку цитостатическое воздействие антиметаболитов, применяемых для специфической терапии ОЛЛ, в значительной мере угнетает продукцию наивных лимфоцитов.

ПХТ угнетает все популяции лимфоцитов: функциональный дефект В-клеточного звена проявляется в дефиците иммуноглобулинов [26, 266]; кроме того, определяется снижение содержания различных субпопуляций Т-клеток. Показана частичная инверсия CD4 / CD8 соотношения, а также относительное увеличение уровня Т-клеток памяти у детей-реконвалесцентов ОЛЛ. В работах [250, 251] отмечается быстрое восстановление количественных показателей Т-клеточного звена, однако процесс реконституции в значительной мере зависит от остаточной функциональной активности тимуса, возраста и интенсивности терапии. Т-клеточная реконституция развивается за счёт параллельного протекания тимус-зависимой и тимус-независимой регенерации, баланс между которыми в существенной мере определяется возрастом пациентов. Так, авторы [150] продемонстрировали восстановление наивных CD4+ Т-лимфоцитов у детей, прошедших курс ПХТ по поводу солидных опухолей, в течение 6 - 12 месяцев после окончания терапии; в то время как у подростков и молодых взрослых этот процесс проходит значительно медленнее. Содержание CD8+ Т-лимфоцитов обычно восстанавливается спустя три месяца после выполнения ПХТ и происходит тимус-независимым образом [151].

Реконституция В-клеточного компартмента изучена значительно менее подробно. Сокращение содержания В-клеток в периферической крови и костном мозге на этапе интенсивной фазы лечения позволяет предположить дефицит В-клеточной функции у реконвалесцентов. Кроме того, метотрексат и меркаптопурин, применяемые на стадии поддерживающей терапии, также в значительной степени подавляют В-лимфоциты, в то время как воздействие на Т-клетки выражено меньше. Реконституция В-клеточного звена сопровождается относительным ростом содержания клеток с наивным IgM+IgD+CD27-фенотипом, что косвенно свидетельствует о генерации В-лимфоцитов de novo как об основном механизме её реализации [81, 267].

Таким образом, процессы, лежащие в основе восстановления функционально полноценных компартментов Т- и В-клеток, вместе формируют ренессанс иммунной системы пациента, прошедшего интенсивную фазу терапии ОЛЛ. Невозможно переоценить роль наивных Т- и В-лимфоцитов, эффективное созревание которых обеспечивает восстановление широты антигенного репертуара ТКР и ВКР, обеспечивающего защиту как от вирусных и бактериальных патогенов, так и от повторного развития лейкемического клона. Слабо выраженный иммунологический ренессанс у больных характеризуется преимущественно периферической клональной экспансией лимфоцитов на фоне дефицита наивных Т- и В-клеток, приводящему к сужению антигенного репертуара ТКР и ВКР и, как следствие, повышенному риску развития инфекционных осложнений, а также рецидива основного заболевания. Количественная оценка иммунологического ренессанса способна предоставить ценную информацию для клинициста в прогностическом аспекте. Однако до сегодняшнего дня отсутствовали достоверные данные, позволяющие судить о динамике и нормативных показателях содержания наивных Т- и В-клеток у пациентов с опухолями иммунной системы. Предлагаемая работа заполняет этот пробел.

Иммунореконституция у детей в первом остром периоде ОЛЛ

При исследовании уровня ТРЭКов в общих группах ремиссии и первого острого периода ОЛЛ на инициальном этапе терапии (день 0) выявлено отсутствие значимых различий между содержанием колец в контрольной группе условно здоровых детей и в группе первого острого периода ОЛЛ. Пациенты в ремиссии ОЛЛ характеризуются значимым (р 0,001) снижением уровня ТРЭКов как по сравнению с группой больных на инициальном этапе терапии, так и по сравнению с контрольной группой (рисунок 14). Эти данные свидетельствуют о значительном токсическом воздействии интенсивной фазы ПХТ на созревание наивных Т-лимфоцитов в тимусе на фоне отсутствия явного подавляющего воздействия опухолевого клона, причём дефект неогенеза Т-клеток сохраняется не менее трёх лет после констатации ремиссии. Поэтому можно предположить, что сокращение антигенного репертуара ТКР является одним из факторов восприимчивости к вирусным инфекциям детей-реконвалесцентов ОЛЛ.

Клинический пример 1

Острый лимфобластный лейкоз, L1-L2 морфологический вариант, В(II) иммунологический вариант; хромосомная транслокация t (12;21), первый острый период

Мальчик, 1 год 7 месяцев, после неоднократных эпизодов вирусных инфекций с фебрильной лихорадкой, катаром верхних дыхательных путей в гемограмме выявлен умеренный лейкоцитоз лимфоцитарного характера, анемия. Ребёнок направлен на госпитализацию с подозрением на острый лейкоз. При поступлении – состояние ребёнка тяжёлое, соматический статус в норме, периферический бластоз – 57%.

Миелограмма: костный мозг гиперплазирован, бласты 78 %.

Иммунологическое исследование костного мозга: Фенотип опухолевых клеток – CD79а cyt+, CD22 cyt+, CD19+ CD10+, CD34+ HLA-DR+ CD20-, CD38+/-, CD13+/-, что соответствует ОЛЛ В II с коэкспрессией CD13. Цитохимическое исследование костного мозга: ОЛЛ, L1-L2 вариант с вакуолизацией Исследование ликвора: ликвор прозрачный, белок – 0,075 г/л, цитоз – 0/3. Атипичных клеток не выявлено. Молекулярно-генетическое исследование костного мозга: обнаружена хромосомная транслокация t(12;21) TEL/AML. Цитогенетическое исследование: при исследовании методом FISH обнаружена транслокация t(12;21).

Исследование содержания эксцизионных колец методом ПЦР (день 0): ТРЭКи - 105 копий/105 клеток, КРЭКи – 8,06 104 копий/105 клеток На основании данных анамнеза, клинической картины и проведенного обследования поставлен диагноз:

Острый лимфобластный лейкоз, L1-L2 морфологический вариант, В II иммунологический вариант; первый острый период. После установления диагноза основного заболевания ребенку было начато лечение по программе ALL-MB-2015 для группы стандартного риска, индукция с дексаметазоном 6 мг/кв. м. S тела 0,58 кв. м (рост 90 см, масса тела 13,6 кг): Форфаза: профилактика и лечение синдрома острого лизиса опухоли -инфузионнная терапия 3000 мл/м2/сутки + форсированный диурез (лазикс); дексаметазон с постепенным достижением терапевтической дозы - 6 мг/м2/сутки (3,5 мг) перорально в 3 приема + аллопуринол 200 мг/сутки. Антибактериальная терапия (цефтриаксон). Деконтаминация: «Бисептол» 280 мг/сутки 3 дня в неделю.

3 день индукции: онкаспар 580 Ед в/в за 1 час.

8 день индукции:

Общий анализ крови: периферический бластоз 3%,

Исследование содержания эксцизионных колец методом ПЦР:

ТРЭКи - 2,73 104 копий/105 клеток,

КРЭКи - 2,31 104 копий/105 клеток Продолжена гормональная терапия: Дексаметазон 6 мг/м2/сутки (3,5 мг/сутки)

Винкристин 1,5 мг/м2 (0,9 мг/сутки) в/в струйно;

Рубомицин 45 мг/м2 (26 мг/сут) в/в капельно за 6 часов;

Интратекально введено 8 мг Mtx, 20 мг Ага-С, 2 мг Dexa в 0; 8; дни терапии.

Химиотерапию перенес удовлетворительно. В связи с развитием медикаментозной коагулопатии ребёнок получал трансфузии свежезамороженной плазмы. На фоне проводимого лечения основного заболевания объем опухолевой массы уменьшился, интоксикационный синдром уменьшился, улучшилось самочувствие. 15 день терапии:

Исследование содержания эксцизионных колец методом ПЦР: ТРЭКи - 5,33 104 копий/105 клеток, КРЭКи - 4,29 104 копий/105 клеток

Состояние больного стабильное, продолжено специфическое лечение в рамках протокола:

Винкристин 1,5 мг/м2 (0,9 мг) в/в струйно.

Интратекально: МТХ 8 мг, ARA-C 20 мг, DEXA 2 мг. 22 день терапии:

В связи с коагулопатией проводилась заместительная терапия свежезамороженной плазмой (СЗП). Продолжено специфическое лечение:

Винкристин 1,5 мг/м2 (0,9 мг) струйно;

Интратекально введено: МТХ 8 мг, ARA-C 20 мг, DEXA 2 мг. 29 день терапии:

На фоне сохраняющихся явлений коагулопатией продолжалась терапия СЗП, специфическое лечение по протоколу:

Винкристин 1,5 мг/м2 (0,9 мг) струйно

Интратекально введено: МТХ 8 мг, ARA-C 20 мг, DEXA 2 мг. 36 день терапии:

Исследование содержания эксцизионных колец методом ПЦР:

ТРЭКи - 1,18-10 копий/10 клеток,

КРЭКи - 0,52-104 копий/105 клеток Миелограмма: костный мозг клеточный, бласты 0%, миелобласты 0%, нейтрофильный росток 17,4%, эозинофилы 0,8%, базофилы 0%, лимфоциты 1,0%, моноциты 1,2%, ретикуло-эндотелиальные клетки 1,4%, плазматические клетки 0%, эритроидный росток 78,2%, мегакариоциты 1 на 250, зрелые, отшнуровка тромбоцитов есть.

Молекулярно-генетическое исследование костного мозга: хромосомная транслокация t(12;21) TEL/AML не обнаружена.

Фаза индукции завершена в соответствии с протоколом: Винкристин 1,5 мг/м2 (0,9 мг) струйно

Интратекально введено: MTX 8 мг, ARA-C 20 мг, DEXA 2 мг.

В отделении проводилась заместительная терапия компонентами крови (эритровзвесь, СЗП), антибактериальная терапия (цефтриаксон).

Протокол индукции выполнен полностью, достигнута клинико-гематологическая ремиссия и молекулярная ремиссия.

Согласно протоколу ОЛЛ-МВ-2015 больной получил первый блок консолидации, включающий 5 введений метотрексата 30 мг/м2 (17,5 мг), 4 введения аспарагиназы 5000 Ед/м2 (3000 ЕД) на фоне приема меркаптопурина 50 мг/м2 (31 мг). Доза метотрексата и меркаптопурина модулируется под контролем уровня нейтрофилов. Четвёртое введение аспарагиназы осложнилось анафилактической реакцией, решено заменить препарат на онкаспар. Выполнен курс первой реиндукции в составе:

Винкристин 1,5 мг/м2 (0,9 мг) струйно (два введения) на фоне ежедневного приема дексаметазона 6 мг/м2 (3,75 мг/сутки) per os в течение 10 дней с последующей постепенной отменой

Эндолюмбально введено: MTX- 8 мг, ARA-C-20 мг, Dexa-2 мг; состав ликвора без патологии.

Созревание наивных Т- и В-клеток у пациентов с различными формами ХЛЛ

Сопоставление содержания эксцизионных колец у больных ХЛЛ и в контрольной группе условно-здоровых взрослых выявило отсутствие статистически значимых различий между уровнями ТРЭКов на фоне значительного достоверного (р 0,001) уменьшения содержания КРЭКов в группе пациентов с ХЛЛ (таблица 6, рисунок 22). Таким образом подтверждается подавление клоном ХЛЛ созревания наивных В-клеток в костном мозге, в отличие от ОЛЛ, при котором наблюдается некоторое повышение содержания КРЭКов в первом остром периоде заболевания на инициальном этапе лечения. С другой стороны, обе патологии не оказывают достоверного влияния на Т-клеточный неогенез в тимусе.

Определено влияние различных цитогенетических и молекулярно-генетических факторов ХЛЛ на формирование наивных Т- и В-клеток. Одним из основопологающих предикторов исхода и течения ХЛЛ является мутационный статус генов тяжёлых цепей иммуноглобулинов (IGHV). Клиническое течение мутированного ХЛЛ (M-ХЛЛ, mutated) значительно более благоприятно по сравнению с немутированным (U-ХЛЛ, unmutated). При исследовании мутационного статуса генов IGHV у 28 пациентов (33,8 %) диагностирован вариант с мутациями VH-генов, у 51 (66,2 %) – вариант без мутаций VH-генов. У больных с мутациями содержание ТРЭКов статистически значимо (р 0,05) выше по сравнению с группой больных без мутаций (рисунок 23), при этом значимые различия в уровне КРЭКов не выявлены.

Проанализировано содержание хромосомных и молекулярных аномалий в обследованной группе больных ХЛЛ. Делеция 13q14 выявлена у 53 больных (48,6 %) из 109 обследованных; сочетаний с делецией 11q23 из них – 8 (15,1 %), с трисомией 12 – 1 (1,9 %), с делецией 17р – 4 (7,5 %). Делеция 13q14 сочеталась с мутацией SF3B1 и NOTCH1 в 7 случаях (13,2 %) каждая, с мутацией ТР53 – в 6 случаях (11,3 %). Среднее одержание ТРЭКов и КРЭКов у больных с делецией 13q14 статистически значимо не отличалось от такового у пациентов без аномалии. Доля клеток ХЛЛ с делецией составила 80,5 ± 5,4 %, причём выявлена статистически значимая (р 0,05) слабая обратная взаимосвязь ( = - 0,21) между уровнем делеции и количеством ТРЭКов, что говорит о сокращении антигенного репертуара ТКР при увеличении содержания делеции 13q14.

Группа больных с делецией 11q23 в предлагаемом исследовании представлена 20 пациентами (18,3 %), В одном случае делеция 11q23 сочеталась с трисомией 12. Из тестируемых молекулярно-генетических нарушений в группе делеций 11q23 выявлены 2 случая (10 %) мутации SF3B1 и 3 случая (15 %) мутации NOTCH1; мутации ТР53 не определялись. Среднее содержание делеции 11q23 составило 76,3 ± 10,6 %. Среди обследованных больных с ХЛЛ трисомия 12 хромосомы выявлена в 13 случаях (11,9 % от общей выборки), 5 из которых (38,5 %) сопровождались мутацией NOTCH1. Воздействие трисомии 12 и делеции 11q23 на содержание ТРЭКов или КРЭКов не выявлены.

В обследованной совокупности пациентов с ХЛЛ делеция 17р определена у 9 больных из 109 (8,3 %); cодержание делеции составило 67,7 ± 22,6 %, причём выявлена отрицательная корреляция средней силы между содержанием делеции и уровнем ТРЭКов ( = - 0,38), что говорит о возможном подавлении продукции наивных Т-клеток в тимусе и сокращении антигенного репертуара ТКР при повышении количества делеции 17р в клетках ХЛЛ. 8 из 9 (88,9 %) случаев делеции 17р сопровождались мутацией ТР53, в одном случае (11,1 %) делеция 17р сочеталась с мутацией NOTCH1.

Мутации SF3B1 выявлены у 14 из 109 пациентов (12,8 %); содержание эксцизионных колец достоверно не различается в группах с мутацией и без неё. Это свидетельствует об отсутствии влияния мутации SF3B1 в лейкемических клетках на продукцию наивных Т- и В-клеток тимусом и костным мозгом. Один случай мутации SF3B1 сопровождался мутацией NOTCH1; мутации ТР53 в группе SF3B1 не зарегистрированы.

Из 109 обследованных больных мутации NOTCH1 определены в 17 случаях (15,6 %). Среднее содержание КРЭКов значимо (р 0,05 для t-критерия) выше по сравнению с группой пациентов без мутаций NOTCH1 (рисунок 24, А). Один случай (5,9 %) мутации NOTCH1 сопровождался мутацией ТР53.

При исследовании замены p53 Arg72Pro в общей выборке определено 56 пациентов без замены; 34 пациента с гетерозиготной мутацией и 4 пациента с гомозиготной. Уровень ТРЭКов оказался статистически значимо (р 0,05) выше в группах с гетерозиготными заменами и с геном дикого типа (рисунок 24, Б), что свидетельствует о сужении антигенного репертуара ТКР при наличии гомозиготного полиморфизма p53 Arg72Pro.

При клинической оценке активности основного заболевания стадия А определена у 11 больных (10 %), В – у 76 (69,7 %) и C – у 22 (20,3 %), при этом достоверные различия в уровнях эксцизионных колец между группами пациентов с различными стадиями ХЛЛ обнаружены не были. Оценили содержание эксцизионных колец при различных клинических исходах после выполнения специфического лечения (рисунок 25, А). Все пациенты получили в среднем 5 циклов по протоколу ФЦР. При этом отсутствие ответа наблюдалось в 16 случаях; 29 больных достигли частичной ремиссии, ещё 11 – частичной ремиссии с минимальной остаточной болезнью (МОБ). Полная ремиссия, наблюдавшаяся в 36 случаях, сопровождалась значимо более высоким уровнем ТРЭКов по сравнению со значением показателя в группах отсутствия ответа (р 0,01) и частичной ремиссии (р 0,05). Наличие МОБ на фоне полной ремиссии, зарегистрированное у четырёх пациентов, также ассоциировано со значимым (р 0,001) снижением содержания ТРЭКов. Двое пациентов погибли до начала специфической терапии от пневмонии; у одного из них эксцизионные кольца отсутствовали вовсе, у второго уровень ТРЭКов составил 17 копий, КРЭКов – 219 копий. ROC анализ (рисунок 25, Б) подтвердил прогностическую значимость ТРЭКов в контексте наступления благоприятного исхода в виде полной ремиссии без МОБ: площадь под кривой для ТРЭКов составила 0,713, р = 0,001

Клинический пример 4

Женщина, 44 года. Пациентка госпитализирована для обследования по поводу лейкоцитоза до 50 тыс. с лимфоцитозом до 80 %. Объективно состояние больной удовлетворительное; В-симптомы отсутствуют, определяется увеличение периферических лимфоузлов до 1.5 – 2 см, селезёнка не увеличена. Сопутствующие заболевания – бронхиальная астма, атопическая форма, среднетяжёлое течение; язвенная болезнь желудка, ремиссия. На основании проведенного клинико-лабораторного обследования (трепанобиопсия с пункцией костного мозга, иммунофенотипирование клеток крови) установлен диагноз ХЛЛ, стадия А по Binet: в пунктате костного мозга лимфоцитов 44.4%, из них 4 % с омоложенным ядром, в трепанобиоптате инфильтрация лимфоидными клетками небольших размеров, сужение остальных ростков гемопооэза, иммунофенотипирования клеток крови от 04.08.2011 г. - клон CD45++ CD23+ CD 19+ CD5+ -- составляет 73%; уровень иммуноглобулинов в пределах нормы, 2-микроглобулин 3.4 мг/л. Учитывая удовлетворительные показатели периферической крови, нормальный уровень иммуноглобулинов, отсутствие симптомов опухолевой интоксикации и большой опухолевой массы, цитостатическое лечение отложено.

Спустя 2 месяца при обследовании у больной выявлено нарастание лейкоцитоза до 95 тыс/мкл, уровень лимфоцитов - 92 %. Пациентка вновь госпитализирована; цитогенетическое исследование показало, что 96 % опухолевых клеток содержат делецию 13ql4, обнаружена мутация ТР53 и мутированный статус генов IGHV кластера. Исследование эксцизионных колец методом ПЦР:

ТРЭКи - 8,02 103 копий/105 клеток,

КРЭКи - 1,10 103 копий/105 клеток

Таким образом, у больной можно выделить ряд благоприятных прогностических факторов ХЛЛ, включающих молодой возраст, наличие делеции 13ql4 и мутированных генов вариабельного региона тяжёлых цепей иммуноглобулинов. Кроме того, высокий уровень ТРЭКов дополнительно свидетельствует о возможном благоприятном исходе для пациентки. С другой стороны, мутация ТР53 является фактором неблагоприятного прогноза.

В связи с быстрой прогрессией лейкоцитоза пациентке начато лечение по протоколу ФЦР, всего выполнено 6 блоков. Контрольное обследование показало полную клинико-гематологическую и молекулярную ремиссию ХЛЛ.