Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Патогенетические аспекты развития остеоартрозов и развития осложнений при эндопротезировании крупных суставов нижних конечностей (обзор литературы) 16
1.1. Распространенность остеоартрозов 16
1.2. Современные аспекты патогенеза деформирующего остеоартроза 18
1.3. Воспаление и его роль в формировании остеоартрозов 18
1.3.1. Роль окислительного стресса при деформирующих остеоартрозах 21
1.3.2. Защитный механизм клеток от окислительного стресса 26
1.3.3. Роль оксида азота в формировании эндотелиальной дисфункции 28
1.3.4. СРБ как неспецифический маркер воспаления при деформирующих остеоартрозах 30
2. Значение дисфункции эндотелия в формировании остеоартрозов 33
2.1. Эндотелин-1 как показатель эндотелиальной дисфункции при деформирующих остеоартрозах 36
2.2. Факторы роста в формировании деформирующих остеоартрозов 38
3. Функциональное состояние системы гемостаза при остеоартрозах 40
4. Современные лабораторные методы диагностики возможных осложнений при деформирующих остеоартрозах 47
4.1 Полиморфизм -455G А гена фибриногена (FGB) 48
4.2. Полиморфизм 20210G A гена протромбина (F2) 49
4.3. Полиморфизм 1691G А гена V фактора свертывания крови (F5) 50
4.4. Полиморфизм -675 5G 4G гена ингибитора активатора плазминогена I типа (PAI-1, SERPINE1) 53
4.5. Полиморфизм 807С T гена тромбоцитарного рецептора к коллагену (ITGA2) 56
4.6. Полиморфизм 1565Т С гена тромбоцитарного рецептора фибриногена (ITGВ3) 57
4.7. Значение полиморфизмов для прогнозирования предрасположенности к тромбозам 58
5. Антикоагулянтная терапия у больных с тотальным эндопротезированием крупных суставов нижних конечностей 60
Глава 2. Материалы и методы 63
2.1. Общая характеристика обследованных больных 63
2.2 Методы исследования 66
2.2.1 Лабораторные методы исследования 66
2.2.2 Статистические методы обработки данных 71
Глава 3.Собственные исследования 74
3.1. Динамика показателей системы плазменного гемостаза у больных деформирующими остеоартрозами 75
3.2. Динамика биохимических показателей больных деформирующими остеоартрозами 80
3.3. Динамика показателей оксидативного стресса и воспаления у больных с деформирующими остеоартрозами 82
3.3.1. Динамика показателей оксидативного стресса в сыворотке крови 83
3.3.2. Динамика концентрации СРБ в сыворотке крови 84
3.4. Динамика концентрации эндотелина-1 в сыворотке крови у больных с деформирующими остеоартрозами 86
3.5. Динамика концентрации фактора роста эндотелия сосудов в сыворотке крови у больных с деформирующими остеоартрозами 87
Глава 4. Оценка диагностической значимости клеточно-молекулярных маркеров при обследовании больных с деформирующими остеоартрозами 89
4.1. Оценка диагностической значимости показателей воспаления и оксидативного стресса у больных с деформирующими остеоартрозами 89
4.2. Оценка диагностической значимости эндотелина-1 в сыворотке крови у больных с деформирующими остеоартрозами 93
4.3. Оценка диагностической значимости фактора роста эндотелия сосудов в сыворотке крови у больных с деформирующими остеоартрозами 95
Глава 5. Распределение аллельных вариантов генов системы свертывания крови у пациентов с деформирующими остеоартрозами 98
5.1. Отбор и распределение пациентов в группы для проведения генетического исследования генов по профилю «Плазмо-скрин. Плазменные факторы системы свертывания крови» на основании данных VEGF-A 99
5.2. Результат генетического исследования больных с деформирующими остеоартрозами 101
5.3. Ассоциированность уровня продукции С-реактивного белка с полиморфизмом анализируемых генов у пациентов с деформирующими остеоартрозами 106
Глава 6. Практическое применение в клинической лабораторной диагностике VEGF-A и СРБ в качестве предиктора и критерия прогноза поражения сосудистого русла при деформирующих остеоартрозах 108
6.1. Практическое применение алгоритма для определения риска возникновения тромбоэмболических осложнений при деформирующих остеоартрозах 108
Заключение 114
Выводы 117
Список сокращений 120
Список литературы 123
Приложение 148
- Роль окислительного стресса при деформирующих остеоартрозах
- Антикоагулянтная терапия у больных с тотальным эндопротезированием крупных суставов нижних конечностей
- Оценка диагностической значимости показателей воспаления и оксидативного стресса у больных с деформирующими остеоартрозами
- Практическое применение алгоритма для определения риска возникновения тромбоэмболических осложнений при деформирующих остеоартрозах
Роль окислительного стресса при деформирующих остеоартрозах
Среди механизмов развития остеоартроза имеет место окислительный стресс и воспалительный аспект патогенеза этого заболевания. Развитие окислительного стресса обусловлено снижением резерва антиоксидативной защиты или резкой интенсификацией процессов свободно-радикального окисления, что приводит к значительному накоплению активных форм кислорода (АФК).
Оксидативный стресс рассматривают как один из важных патофизиологических механизмов при развитии остеоартрозов: постоянная генерация АФК в суставах больных активированными макрофагами и нейтрофилами, а также за счет циклически повторяющихся процессов гипоксии - реперфузии при работе суставов приводит к повреждению синовиальных клеток, эрозии костной ткани и разрушению хряща [56, 84].
Низкий антиоксидативный статус клеток и тканей организма является возможным фактором риска для данного заболевания. У больных с остеоартрозом увеличивается оксидативный стресс и уменьшается активность антиоксидативных факторов. Среди маркеров окислительного стресса одним из распространенных является показатель окислительной модификации белков [39, 84, 136, 163].
В 1991 г. Хельмутом Зисом был введен термин оксидативный стресс (oxidative stress). Официально в 1995 г. вошел в словарь Mesh Pubmed. В соответствии данному в PubMed определению, оксидативный стресс – это дисбаланс анти- и прооксидантов в пользу первых, приводящий к повреждению. Оксидативный стресс, проявляющийся в накоплении поврежденных оснований дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), пероксидации продуктов окисления белков и липидов; в уменьшении содержания антиоксидантов и связанной с этим повышенной восприимчивостью липопротеинов и липидов мембран к действию прооксидантов, в том числе ионов Fe2 + или H2O2.
Владимиров Ю.А., 2017 отмечает, что неточность термина «оксидативный стресс» связана с тем, что понятия – антиоксиданты и прооксиданты – крайне расплывчаты, и с тем, что неясно, где кончается баланс и начинается дисбаланс [13].
Влияние свободно-радикального окисления (СРО) на развитие патологических процессов в условиях гипоксии, воспаления и старения общеизвестно. Одним из повреждающих факторов, оказывающих действие, как на начальных, так и на последующих стадиях развития тромбоэмболических осложнений, являются активные формы кислорода (АФК). К АФК перекись водорода (H2O2), относят синглетный кислород (1O2), супероксид анион-радикал (O2 ), гидроксильный радикал ( ОН), гипохлорит (НOCl). Окись азота (NO) и пероксинитрит (ONOO-) относят к АФК, обладающим повышенной окислительной активностью [34].
В клетке отлично известны источники АФК. Одним из важнейших генераторов АФК в клетке являются пероксисомы, в них локализован целый ряд ферментов, которые связанны с метаболизмом H2O2. Перекись водорода использующаяся клеткой основным образом с целью детоксикации ксенобиотиков почти целиком утилизируется внутри вышеперечисленных органелл. Целый ряд цитохром–зависимых оксигеназ локализован в эндоплазматическом ретикулуме, продуцирующих супероксидные радикалы. НАД(Ф)Н- оксидазная система существует в плазмалемме макрофагов и эндотелиоцитов, она продуцирует супероксид анион во время воспалительного и иммунного ответа.
В нормальных клетках происходит восстановление молекулярного кислорода до воды при участии фермента цитохромоксидазы без образования каких-либо промежуточных продуктов. В дальнейшем, уже при участии ферментативных и неферментативных систем, восстановление молекулярного кислорода происходит с образованием супероксид-радикала, пероксида водорода, пергидроксил-радикала и гидроксил-радикала. В начальной стадии воспаления свободные радикалы образуются в основном за счет внутриклеточных механизмов. Образующиеся в организме свободные радикалы могут инициировать каскад цепных реакций, продолжающихся до тех пор, пока они не будут удалены.
СР - это активные молекулярные частицы, имеющие неспаренный электрон на внешней электронной оболочке. Их изучение ведется методами электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), хемилюминесценции и с помощью ингибиторов. Первичные радикалы (супероксид, убисемихинон и нитроксид) образуются ферментативным путем и нужны клетке. Вторичные радикалы, такие, как гидроксил или радикалы липидов, повреждают ее [13].
В организме увеличенное образование СР и связанное с этим усиление процессов пероксидации липидов сопровождается рядом нарушений в функционировании клеток и свойствах биологических мембран, а именно: изменением свойств липидного слоя; изменением поверхностного заряда мембран и липопротеинов; повышением микровязкости мембран; уменьшением гидрофобного объема; увеличением полярности липидной фазы; повышением проницаемости для ионов водорода и кальция.
Помимо прямого повреждающего действия накопление СР способствует нарушению энергетического обмена, развитию эндоневральной гипоксии. Не следует также забывать, что активация прооксидантных систем организма сопровождается активацией процессов атерогенеза и, следовательно, повышением риска сосудистых осложнений.
Будучи заряженной молекулой, супероксид-радикал не может покинуть клетку и оказывается внутри ее, как в ловушке. Окислительные реакции, протекающие в полости митохондрий, идут в определенной последовательности. Элементы дыхательной цепи вмонтированы в мембрану митохондрий, и там образуется большая часть АФК. Более других органелл митохондрии подвергаются атаке АФК, а значит и повреждению ДНК, мембранных белков, липидов и их гибели [175].
Митохондрии, обладающие системой защиты от АФК, включающей глутатионпероксидазу за счет деградации перекиси водорода; ферменты супероксиддисмутазу осуществляющие нейтрализацию супероксид–аниона в перекись водорода и пероксидазу; аскорбиновую кислоту, восстановленную форму коэнзима Q, а также глутатион и различные низкомолекулярные антиоксиданты. Когда митохондрии не справляются с детоксикацией образуемые ими АФК в клетке вопреки вышеперечисленным механизмам защиты формируется так называемый «окислительный стресс». Вследствие чрезмерного появления кислородных радикалов, главным образом они выполняют деструктивные функции, и служат в качестве сигнальных молекул [55, 104].
«Реперфузионное поражение» является другим повреждением сосудистой системы сопровождающимся более выраженными процессами ПОЛ, внутриклеточным накоплением ионов К+ и Ca2+, повреждениями ферментных систем и мембран, которое в большинстве случаев определено действием лавинообразно образующихся активных форм кислорода. Из чего следует, что первостепенное значение оксидативного стресса для формирования многих повреждений сосудистой системы определяется унифицированным механизмом его действия.
Оксидативный стресс способствует атерогенной модификации липопротеидов низкой плотности и появлению на поверхности сосудов липидных отложений, а также повреждению клеточного гликокаликса, возникновению эндотелиальной дисфункции, изъязвлению и разрыву тромботической бляшки.
При разнообразных патологических процессах в последние время в литературе значительный интерес представляет анализ изменений функционального состояния эндотелиальной стенки и его сосудодвигательная функция. Весьма разнообразен спектр условий, которые способны изменять функционирование эндотелия из числа факторов, которые способны инициировать дисфункцию эндотелия, необходимо особенно выделить системное воспаление [23]. Согласно сведениям ученых, медиаторы воспаления способны активировать эндотелий и повреждение, приводящее к его дисфункции, что статически значимо подтверждено среди пациентов с ревматоидным артритом и анкилозирующем спондилите [23, 24, 140].
На сегодняшний день, роль воспаления в формировании и прогрессировании ОА считается общепризнанной [51, 74, 87, 88]. Установлена общность механизмов хронического воспаления среди пациентов с ОА, у которых выявляются признаки дисфункции эндотелия [80]. Помимо этого, при ОА главную значимость в патогенезе эндотелиальной дисфункции играет окислительный стресс [56, 82], провоспалительные цитокины, подавляющие продукцию NO, а кроме этого продукцию мощных вазоконстрикторов обеспечивают АТ ІІ, эндотелины и эндопероксиды [56, 76].
Наиболее изученным является механизм пероксидного окисления липидов в работах А.И. Арчакова и Ю.А. Владимирова (1972) и выяснено строение системы окисления чужеродных соединений, таких как ксенобиотики, в мембранах клеток печени. Нарушение работы окислительной системы приводит к тяжелым изменениям в обмене веществ и дисбалансу функционирования клеток, лежащим в основе интоксикаций, образования канцерогенных соединений и атеросклероза.
Так, поверхность эндотелия сосудистой стенки является одной из основных мишеней АФК, повреждение которой приводит к активации тромбогенеза.
Антикоагулянтная терапия у больных с тотальным эндопротезированием крупных суставов нижних конечностей
Актуальной проблемой современного здравоохранения остается профилактика ТГВ и ТЭЛА у больных хирургического профиля, особенно у пациентов, которым выполняется ТЭП. Одной из основных угроз для пациентов, которым проводят ТЭП тазобедренного или коленного сустава являются ТЭО. Данные осложнения могут служить непосредственной причиной летальных исходов, ухудшают результаты лечения, значительно повышают финансовые затраты и провоцируют повышение частоты других осложнений. Установлено, если у пациентов, перенесших ТЭЛА, в особенности если она не была выявлена своевременно как первопричина критического состояния, и лечение не проводилось целенаправленно, то в течение 3 месяцев возникает стойкая легочная гипертензия с необратимым и постоянно нарастающим нарушением функции правых отделов сердца. Имеют немаловажное значение и различные последствия тромбоза проксимальных отделов вен нижних конечностей, которые при отсутствии медикаментозного лечения через 3 года в 35-70%, а через 5-10 лет - в 49-100% случаев приводят к инвалидизации пациентов, которая на фоне посттромбофлебитической болезни обусловлена хронической венозной недостаточностью [90].
Антикоагулянты – это одна из групп лекарственных средств, оказывающих воздействие на свертывающую систему крови, препятствующих образованию в сосудах тромбов. В зависимости от механизма действия данные лекарственные средства принято делить на 2 подгруппы: антикоагулянты прямого и непрямого действия.
Низкомолекулярные гепарины – это класс дериватов гепаринов, которые имеют молекулярную массу 2000-10000 Да. Эти препараты применяются для изменения свертываемости крови. Они применяются при варикозном расширении вен, для лечения венозной тромбоэмболии и различных тромбофилий.
С целью профилактики ВТЭ у больных, которым проводились ортопедические операции на крупных суставах нижних конечностей, наравне с непрямыми антикоагулянтами, длительное время применялись нефракционные гепарины (НФГ). Далее появились низкомолекулярные гепарины (НМГ), и не так давно нашли применение в медицинской практике прямые пероральные антикоагулянты - Прадакса, Ксарелто [33].
Профилактика ВТЭО в настоящее время обязательно проводится в виде курса продолжительностью, как минимум 10 суток, согласно рекомендациям уровня 1А для протезирования тазобедренного или коленного суставов, в соответствии с рекомендациями Американского общества торакальных врачей (АССР) [129, 166]. Для пациентов, которым производят ТЭП тазобедренного сустава продолжительность тромбопрофилактики должна составлять не менее 35 суток, начиная с первого дня после оперативного вмешательства (рекомендации уровня 1А) [166]. Данные рекомендации, к сожалению, соблюдаются не всегда, что, возможно, сопряжено с недостаточной информированностью пациентов по поводу зачастую проходящих бессимптомно ВТЭО, а кроме того суждением о практической пользе и безопасности существующих схем антикоагулянтной терапии [14].
Оперативные вмешательства при ортопедических заболеваний, а именно тотальное эндопротезирование тазобедренного или коленного сустава, связаны с повышенным риском развития тромбоэмболических осложнений. ТГВ нижних конечностей после эндопротезирования крупных суставов в отсутствие антитромбической профилактики развивается у 40-60% пациентов [16, 129, 212].
Важным фактором активации системы гемостаза, что также способствует тромбозу, является увеличение уровней катехоламинов, кортизола, вызванное послеоперационной операционным стрессом и болью [30, 64, 90, 152].
В последние годы перечень антитромбических средств дополнился большим количеством новых препаратов из группы НМГ. Но, изучение их антитромботического эффекта и рациональный способ введения у больных травматолого-ортопедического профиля в целях надежной профилактики в раннем послеоперационном периоде требует дальнейшего изучения и определения оптимальных доз их введения на различных этапах лечения.
Оценка диагностической значимости показателей воспаления и оксидативного стресса у больных с деформирующими остеоартрозами
Данные ROC–анализа средних значений СРБ в сыворотке крови приведены на рис. 3 (а, б, в). При поступлении у пациентов отмечается самое низкое значение СРБ (15,8+4,7 ммоль/л) относительно контрольной группы (4,36+0,96). Концентрация СРБ на 2-3 день после введения НМГ и при выписке значительно возрастают и составляют 120,6+8,8 ммоль/л и 75,6+5,7 ммоль/л соответственно.
Оптимальная точка разделения (сutoff) при поступлении, на фоне введения НМГ и выписке отличалась и составила 3,8 ммоль/л, 11,35 ммоль/л и 20,2 ммоль/л соответственно. Такие точки разделения позволяют добиться относительно высокой специфичности и чувствительности (таб. 9) с высокой площадью под кривой (таб. 8), что свидетельствует о значимости данного показателя как диагностического теста.
График ROC-кривой оксистата проходит далеко от верхнего левого угла, что не позволяет считать его идеальным классификатором, а значит доля ложноположительных результатов очень высока (рис. 4 а, б, в).
ROC-анализ специфичности и чувствительности оксистата обнаружил его различные диагностические характеристики. Так все предложенные точки разделения выявляют 100% чувствительность, но пониженную специфичность (таб. 11).
Полученные данные не позволяют рекомендовать оксистат в качестве маркера для исследования ТЭО (рис. 4 а, б, в, таб. 11) у больных с деформирующими остеоартрозами.
Практическое применение алгоритма для определения риска возникновения тромбоэмболических осложнений при деформирующих остеоартрозах
Стремительно развивающимся направлением лабораторной диагностики, считается поиск новых диагностически значимых маркеров при сердечно-сосудистой патологии, которые смогли бы превзойти по информативности уже существующие на сегодняшний момент, а также содействовать улучшению диагностики и профилактики возможных осложнений. Такие исследования способствуют развитию прогностических маркеров, что дает возможность диагностировать развитие возможных осложнений еще в доклиническом периоде.
Несмотря на многочисленные работы в области профилактики ТЭО НМГ требуется проведение комплексной оценки диагностических показателей и выявление маркеров ТЭО, которые могут быть внесены в стандартное обследование больных.
У больных с деформирующими остеоартрозами наблюдается статистически значимое нарастание с высокой чувствительностью и специфичностью VEGF-A и СРБ в сыворотке крови относительно контрольной группы. Причем, с возрастом пациентов, эти изменения более выражены. Поэтому определение содержания в крови фактора ангиогенеза и воспалительных изменений сосудистой стенки (VEGF-A, СРБ) у таких пациентов возможно для прогноза тромбоэмболических осложнений, а также быть методами профилактики и контроля за эффективностью введения НМГ.
Учитывая оптимальные значения cutoff исследованных показателей, для разработки алгоритма взят уровень выделенного значения VEGF-A и СРБ с наибольшей чувствительностью и специфичностью от больных в момент их поступления в стационар (таб. 21).
Полученные результаты позволили нам разработать алгоритм, который позволяет своевременно выявить пациентов с высоким риском развития ТЭО и провести дополнительную профилактику возможных осложнений, в том числе и продление введения НМГ.
Для подтверждения имеющихся лабораторных данных было проведено исследование генотипов, которое позволило определить наличие взаимосвязи между изменением VEGF-A, СРБ и определенным генотипом РАI-1 у пациентов, включенных в исследование.
Разработанный алгоритм может быть включен вместе с другими методами диагностики в стандарты обследования лиц при планируемых оперативных вмешательствах травматолого-ортопедического профиля. Ниже приведены примеры, показывающие необходимость назначения дополнительных доз НМГ на основе лабораторных исследований.
Пример № 1
Больная К., 57 лет, поступила в клинику на оперативное вмешательство в Научно-исследовательский институт травматологии, ортопедии и нейрохирургии ФГБОУ ВО СГМУ им. В.И. Разумовского Министерства здравоохранения Российской Федерации 14.01.14г., № истории болезни 408, с диагнозом: коксартроз (артроз тазобедренного сустава).
До операции провели общеклиническое обследование, согласно стандартам обследования. Осуществили забор венозной крови и подготовили образцы проб сыворотки крови. При поступлении содержание VEGF-A в сыворотке крови составило 204,7 пг/мл, СРБ - 8,5 ммоль/л после чего больного отправили на дообследование методом пиросеквенирования по профилю «Плазмо-скрин. Плазменные факторы системы свертывания крови». В результате генетического исследования по профилю «Плазмо скрин» № 371233 - из 5 исследованных полиморфизмов выявлен один неблагоприятный аллель - в гене антагонисте тканевого активатора плазминогена PAI-1 -rs1799768, гомозигота, таким образом был выявлен полиморфизм гена PAI-1, который способствует снижению фибринолитической активности крови и повышает риск коронарных нарушений. Провели оперативное вмешательство: ТЭП тазобедренного сустава. На 2-3 день после операции уровень VEGF-A в сыворотке крови составил 310,1 пг/мл, СРБ - 247,7 ммоль/л. Несмотря на проводимую терапию уровни VEGF-A и СРБ в сыворотке крови к моменту выписки составили 343,7 пг/мл и - 150,2 ммоль/л соответственно, что указывает на необходимость индивидуального подбора низкомолекулярных гепаринов.