Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о бактериальном вагинозе (обзор литературы) 11
1.1. Эпидемиология бактериального вагиноза 11
1.2. Патогенез и клинические проявления бактериального вагиноза 12
1.3. Микроэкосистема влагалища в норме и при бактериальном вагинозе 16
1.3.1. Физиологическая микроэкосистема влагалища 16
1.3.2. Роль лактобацилл в поддержании физиологической микроэкосистемы влагалища 19
1.3.3. Микроэкология влагалища в различные периоды жизни женщины 23
1.3.4. Микроэкосистема влагалища при бактериальном вагинозе 26
1.4. Диагностика бактериального вагиноза 31
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Обследуемая группа пациентов 37
2.2. Образцы биологического материала 39
2.3. Методы исследования 40
2.3.1. Клиническая диагностика бактериального вагиноза (метод Амселя).. 40
2.3.2. Микроскопическая диагностика бактериального вагиноза (метод Нуджента) 41
2.3.3. Исследование микробиоценоза влагалища методом количественной мультиплексной ПЦР в реальном времени (тест Фемофлор-16) 41
2.3.4. Диагностика бактериального вагиноза методом количественной мультиплексной ПЦР в реальном времени (тест Флороценоз/БВ) 44
2.3.5. Статистический анализ результатов 44
Глава 3. Результаты исследования 47
3.1. Бактериальные сообщества формирующие микроэкосистему влагалища в норме и при бактериальном вагинозе 47
3.2. Критерии диагностики бактериального вагиноза с использованием теста Фемофлор-16 69
3.3. Диагностические характеристики теста для выявления бактериального вагиноза Флороценоз /БВ 77
3.4. Оценка и модификация критериев Амселя 79
Глава 4. Обсуждение результатов 84
Выводы 98
Практические рекомендации 100
Список сокращений и условных обозначений 102
Литература 103
- Патогенез и клинические проявления бактериального вагиноза
- Диагностика бактериального вагиноза
- Бактериальные сообщества формирующие микроэкосистему влагалища в норме и при бактериальном вагинозе
- Оценка и модификация критериев Амселя
Патогенез и клинические проявления бактериального вагиноза
Микроэкология влагалищного биотопа находится в постоянном динамическом равновесии и зависит от свойств макроорганизма и различных факторов внешней среды. Это динамическое равновесие регулируется путем взаимодействия эндокринной (главным образом прогестероном и эстрогенами) и иммунной систем. БВ-ассоциированные микроорганизмы довольно часто обнаруживаются во влагалище женщин без клинических проявлений этого состояния. Объясняется это тем, что местом происхождения данных микроорганизмов является желудочно-кишечный тракт. Остается неясным, почему у некоторых женщин развивается БВ, в то время как у других нет. Основные клинические проявления БВ:
Обильные, жидкие, гомогенные, беловато-серые, влагалищные выделения. Они образуются в процессе ферментации муцинового геля влагалища анаэробными, ассоциированными с БВ микроорганизмами. При длительно текущем, хроническом заболевании выделения становятся более густыми, с желтовато-зеленоватой окраской.
Неприятный «рыбный запах» вагинальных выделений, который может появляться или усиливаться во время менструации, а также после полового акта [7]. Его появление обусловлено присутствием биогенных аминов - метиламина, диметиламина, триметиламина, путресцина и кадаверина, которые образуются в результате декарбоксилирования аминокислот анаэробными микроорганизмами.
Для БВ не характерны признаки вульвовагинита - жжение, зуд, диспареуния и дизурия, в тех случаях, когда он не сопровождается трихомониазом или кандидозом. Также отсутствует воспалительная реакция со стороны слизистой оболочки влагалища, а при микроскопической картине -единичные лейкоциты в вагинальном мазке.
Несмотря на то, что БВ изучается уже несколько десятилетий, существует множество пробелов в понимании этиологии и патогенеза этого заболевания. Здоровая вагинальная среда, созданная лактобациллами путем выработки молочной кислоты, перекиси водорода и бактериоцинов, препятствует размножению ассоциированных с БВ анаэробов. Молочная кислота усиливает активность как бактериоцинов, так и перекиси водорода. Кроме того, лактобациллы конкурируют за связывание с рецепторами эпителиальных клеток влагалища, что фактически препятствует адгезии патологических микроорганизмов к этим клеткам. Основное, но не единственное звено патогенеза этого полимикробного клинического синдрома - снижение количества лактобацилл и рост анаэробных микроорганизмов. Известно, что уменьшение
содержания Н2О2-продуцирующих лактобацилл, ведет к повышению рН вагинальной среды, после чего влагалище массивно колонизируется комменсальной анаэробной микрофлорой. Темой для дискуссии остается какой из этих факторов является первичным [94]. В то время как большинство исследователей считает, что в индукции низкого рН вагинального отделяемого играют роль лактобациллы, существуют и другие мнения. Так, G.L. Gorodeski и соавт. (2005) предложили теорию, согласно которой рН влагалища регулируется секрецией протонов на поверхность эпителиальных клеток через апикальную мембрану под воздействием эстрогена [41].
Влияние эндогенных и экзогенных факторов нарушает равновесие микроэкосистемы влагалища, что проявляется рядом изменений. Повышение уровня прогестерона приводит к увеличению пролиферации клеток вагинального эпителия. Ассоциированные с БВ анаэробные микроорганизмы, адгезируются на рецепторах влагалищных эпителиоцитов. Таким образом происходит образование «ключевых» клеток, что ведет к увеличению количества влагалищных выделений.
Гликоген, содержащийся в эпителиальных клетках слизистой оболочки влагалища с помощью эндопептидаз расщепляется до моно- и дисахаридов. В процессе их утилизации доминирующие во влагалищной микрофлоре лактобациллы и молочнокислые стрептококки вырабатывают молочную кислоту. Эстрогены отвечают за созревание многослойного плоского эпителия, синтез гликогена и продукцию слизистого секрета шейки матки [11].
Один из клинических признаков БВ связан с повышением уровня биогенных аминов. Они представляют собой органические соединения с одной или несколькими аминогруппами и образуются путем декарбоксилирования аминокислот анаэробными бактериями. Наличием этих аминов и обусловлен неприятный специфический запах выделений при БВ.
Не менее важным звеном патогенеза является повышение активности протеолитических ферментов – сиалидазы и муциназы, которые нарушают функцию образования муцина. Вследствие этого повышается доступность клеток эпителия для адгезии анаэробных микроорганизмов [4]. В 1997 была предложена теория о том, что снижение количества лактобациллл во влагалище может быть вызвано бактериофагами выделенных из штаммов лактобацилл. Участие бактериофагов объясняет, почему это состояние эпидемиологически похоже на ИППП, но частота его рецидива у женщин не зависит от лечения антибиотиками у их партнеров-мужчин [75]. Очень похожее, но гораздо более масштабное исследование, проведенное в 2001 году, подтвердило предыдущий вывод: доля носителей фагов (лизогенов), чаще встречалась у женщин с БВ [31].
В настоящее время многие исследователи считают, что состояние иммунитета является решающим фактором в патогенезе БВ. Врожденный иммунный ответ запускается, когда патоген-ассоциированные молекулярные структуры, которые действуют как лиганды для толл-подобных рецепторов (tolllike receptor, TLR), распознаются клетками-хозяевами. TLR относятся к семейству трансмембранных белков и экспрессируются различными типами клеток, включая нейтрофилы, моноциты и дендритные клетки. Активация TLR вызывает экспрессию провоспалительных цитокинов. До настоящего времени у людей было выявлено 11 TLR [17, 65, 79]. Было высказано предположение, что путем индукции иммуносупрессивных противовоспалительных цитокинов, таких как IL-10 БВ-ассоциированные микроорганизмы, могут инактивировать TLR на цервико-вагинальном эпителии [17].
Еще одним компонентом врожденного иммунитета, участвующим в патогенезе БВ является маннозо-связывающий лектин (mannose-binding lectin, MBL). Этот протеин, локализующийся в слизистой оболочке влагалища, распознает фрагменты маннозы и фруктозы на поверхности микроорганизмов. MBL активирует систему комплемента, конечные компоненты распада которого приводят к повреждению мембраны и лизису микробной клетки [40]. Кроме того, он распознает поврежденные клетки собственного организма и активирует процесс их удаления [10].
Диагностика бактериального вагиноза
Диагностику БВ условно разделяют на клиническую и лабораторную. В настоящее время самым распространенным методом клинической диагностики БВ является метод Амселя (R. Amsel) [72]. Метод основан на применении 4 критериев: наличие специфических выделений из влагалища (при БВ жидкие и однородные), рН вагинального отделяемого выше 4,5, положительный аминный тест, обнаружение «ключевых» клеток при микроскопическом исследовании нативного препарата. Наличие 3 из этих 4 критериев является достаточным для постановки диагноза БВ.
Для того чтобы определить рН вагинального содержимого используют тест-полоски или специальные перчатки с индикатором на указательном пальце. Значение рН влагалищных выделений превышает нормальные показатели при БВ. Однако следует помнить о том, что цервикальная слизь, кровь, сперма по сравнению с отделяемым влагалища имеют более высокий рН, и при их попадании возможны ложноположительные результаты рН-метрии. Кроме того, при трихомонадной инфекции рН влагалища тоже повышается [7].
Аминный запах вагинальных выделений появляется в результате изменения состава органических кислот вагинальной жидкости и повышения уровня путресцина, кадаверина, триэтиламина и других органических аминов в процессе реакции декарбоксилирования аминокислот анаэробными микроорганизмами. Нелетучие соли этих соединений при повышении значения рН становятся летучими аминами, и появляется «рыбный» запах, или ощутимо усиливается. Именно эти реакции лежат в основе аминного теста – одного из критериев Амселя: появление специфического запаха при добавлении к капле выделений из влагалища капли 10% раствора КОН [7].
Присутствие более 20% «ключевых» клеток является наиболее чувствительным и специфичным методом диагностики БВ. Однако его использование как единственного диагностического критерия зависит от квалификации врача и умения грамотно оценить мазок.
Преимуществом метода Амселя является вероятность оперативно установить диагноз БВ на приеме у врача и сразу назначить лечение. Недостатками являются отсутствие возможности для микроскопического исследования нативного препарата у большинства врачей, а также субъективность метода.
В качестве лабораторных методов диагностики БВ в настоящее время применяют, главным образом, микроскопические методы. Традиционно самым быстрым, информативным и недорогим методом оценки изменений микробиоценоза влагалища является метод прямой микроскопии нативных препаратов, или микроскопии «у постели больного» («bed-side»), с помощью которого поставить диагноз БВ можно прямо в клинике. В частности, в скандинавских странах микроскопическое исследование клинических образцов, полученных из влагалища, выполняет врач ведущий прием, что дает возможность не тратить время на ожидание ответа из лаборатории и это, несомненно, является преимуществом. Метод позволяет выявлять лактобациллы, другие микроорганизмы, «ключевые клетки» (эпителиальные клетки, на которых адгезированы микроорганизмы), лейкоцитов в нативных препаратах. Чтобы установить диагноз БВ необходимо найти только одну «ключевую» клетку при исследовании трех полей зрения светового микроскопа, используя увеличение 400 [80]. Кроме того, в методе прямой микроскопии нативных препаратов для того чтобы установить диагноз БВ используются следующие критерии: отношение полиморфно-ядерных лейкоцитов к клеткам вагинального эпителия 1:1, доминирование мелкой кокковидной микрофлоры, уменьшение количества лактобактерий или их отсутствие [80].
Золотым стандартом лабораторной диагностики БВ считается метод Нуджента (R. P. Nugent), основанный на оценке морфотипов бактерий в окрашенных по Граму препаратах отделяемого влагалища с использованием стандартизованной десятибалльной системы [73]. Микробиоценоз влагалища рассматривают как нормоценоз при количестве баллов от 0 до 3, как промежуточный вариант – при количестве баллов от 4 до 6 и как БВ – при количестве баллов от 7 до 10. Оценивают 3 бактериальных морфотипа: морфотип лактобацилл, морфотип гарднерелл и бактероидов и морфотип мобилюнкусов (табл. 1.2).
Относительно высокие чувствительность и специфичность, высокая степень стандартизации и высокая воспроизводимость являются преимуществами метода Нуджента. Недостатки – метод трудоемкий, его сложно использовать в рутинной практике. Также спорным вопросом является наличие «промежуточного» варианта микробиоценоза. Необходимо отметить, что в реальной клинической практике диагностика БВ чаще всего основывается на различных модификациях метода Амселя, использующих, как правило, всего два критерия. Диагностика БВ в нашей стране как правило основывается только на одном критерии – критерии специфических вагинальных выделений, который обладает очень низкой чувствительностью и специфичностью. Два других критерия (повышенное значение pH отделяемого влагалища и положительный аминный тест) практически не используются. В лучшем случае, врач учитывает отсутствие лактобацилл и наличие ключевых клеток в окрашенном по Граму препарате вагинального отделяемого. Метод Нуджента в нашей стране практически не применяется.
Авторы еще одного микроскопического метода – метода Айсон-Хэй (Ison-Hay) – предлагают разделить микрофлору влагалища на 5 категорий: 0 – наличие эпителиальных клеток, отсутствие бактерий; I – нормальная микрофлора влагалища (морфологические типы лактобацилл); II – снижение количества лактобактерий, наличие другой микрофлоры; III – наличие смешанной бактериальной микрофлоры, низкое количество или полное отсутствие лактобактерий; IV – наличие грамположительных кокков. Категории 0, I и IV выявляются у женщин с отсутствием БВ. Категория II – промежуточная, категория III – диагноз БВ по критериям Амселя [58].
Проведение бактериологического исследования и выделение чистых культур микроорганизмов является трудоемким и довольно длительным (до 7-10 дней), требует строгого методического подхода к организации лаборатории, хранению и транспортировке клинических материалов. Бактерии, ассоциированные с БВ, иногда являются элементом нормальной микрофлоры влагалища, а диапазон микроорганизмов, которые нужно идентифицировать, достаточно широкий. Кроме того, в большинстве лабораторий, как правило, определяют только аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы. Для выделения облигатных анаэробов и микроаэрофилов требуется специальное оборудование, которое есть не во всех лабораториях. Таким образом, культуральный метод не может использоваться для диагностики БВ. Существует метод газожидкостной хроматографии, который позволяет сравнить в вагинальном отделяемом количество основных продуктов метаболизма лактобактерий и G. vaginalis: молочной кислоты – лактата и янтарной кислоты – сукцината. При БВ содержание янтарной кислоты в содержимом влагалища повышается, а уровень молочной кислоты, выделяемой лактобактериями и стрептококками, наоборот, снижается. Более высокий уровень содержания сукцината по отношению к лактату используется как диагностический критерий БВ. Возможно также, выявление высоких концентраций ацетата, бутирата, и пропионата. Это летучие жирные кислоты, которые продуцируются строгими анаэробными микроорганизмами. Обычно, метод газожидкостной хроматографии редко используется, вследствие дороговизны и высокой степени сложности [7].
Существует также несколько коммерческих экспресс-тестов: перчатки для измерения рН влагалища непосредственно пациенткой; определение уровня концентрации триметиламина («электронный нос»); измерение рН и пролин-иминопептидазной активности (тест FemExam); определение содержания фермента сиалидазы, продуцируемой микроорганизмами, ассоциированными с БВ, в вагинальных мазках (тест BVBlue). Необходимо отметить, что массового использования в практике эти методы не нашли, ввиду их невысокой чувствительности и/или специфичности [7].
Бактериальные сообщества формирующие микроэкосистему влагалища в норме и при бактериальном вагинозе
Всего в исследование было включено 280 женщин в возрасте от 19 до 45 лет (32,4±1,2). С использованием критериев Амселя БВ был выявлен у 86 женщин, 194 женщины не имели БВ. Согласно классификации вагинальных проб по методу Нуджента, 172 образца были причислены к категории нормальной микрофлоры, 27 – промежуточной микрофлоры, 81 – БВ (табл. 3.1).
Всего с использованием теста Фемофлор-16 было протестировано 280 проб отделяемого влагалища. Результаты 10 проб были признаны невалидными ввиду низкого значения контроля взятия материала и исключены из анализа. Таким образом, в анализ было включено 270 проб. Из них 164 пробы были из категории нормальной микрофлоры по Нудженту, 26 – промежуточной микрофлоры и 80 – БВ.
Частота выявления микроорганизмов/групп микроорганизмов в зависимости от категории по шкале Нуджента представлена на рис. 3.1. Лактобациллы и аэробные бактерии кишечной группы (энтеробактерии, стрептококки и стафилококки) обнаруживались с высокой и практически одинаковой частотой во всех категориях по шкале Нуджента. Представители анаэробной микрофлоры существенно чаще встречались при БВ, чем в норме. Особенно заметные различия наблюдались для Sneathia/Leptotrichia/ Fusobacterium, Megasphaera/Veillonella/Dialister, Lachnobacterium/ Clostridium, Atopobium vaginae.
Так как все включенные в анализ микроорганизмы относятся к эндогенной микрофлоре влагалища, при анализе их ассоциации с БВ необходимо учитывать их количественный состав. Для изучения ассоциации определяемых микроорганизмов с БВ был проведен анализ корреляции количества микроорганизмов/групп микроорганизмов с клиническими и микроскопическими показателями БВ, а именно, числом баллов по шкале Нуджента, суммой положительных критериев Амселя и со значениями рН влагалища (рис. 3.1). Сильная отрицательная корреляция с БВ была установлена для соотношения Lactobacillus/ОБМ. Анаэробные бактерии/группы бактерий предсказуемо показали положительную корреляцию с БВ, при этом самые высокие коэффициенты корреляции наблюдалась для групп Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas, Sneathia/Leptotrichia/Fusobacterium и Megasphaera/Veillonella/Dialister (табл. 3.2 и 3.3). Положительная корреляция с БВ также наблюдалась для Mycoplasma hominis. Из бактерий, традиционно связываемых с БВ, Mobiluncus не показал значимой корреляции ни с одним из показателей БВ, что может быть связано с тем, что эти бактерии в тесте Фемофлор-16 выявляются в совокупности с филогенетически родственными, но не связанными с БВ бактериями рода Corynebacterium. Обнаружение ДНК аэробных бактерий кишечной группы (энтеробактерий, стрептококков и стафилококков), а также уреаплазм и дрожжеподобных грибов рода Candida ожидаемо не коррелировало с показателями БВ.
Следующим этапом нашего анализа было изучение микробных сообществ методом кластерного анализа. Особенностью неиерархической кластеризации является то, что она требует предположения о числе кластеров. При выборе числа кластеров мы руководствовались следующими соображениями. Известно, что основная микробиологическая характеристика БВ – низкое содержание лактобацилл. Однако это свойство присуще не только БВ, но и так называемому аэробному (неспецифическому) вагиниту, которое характеризуется замещением лактобацилл бактериями кишечной группы. Далее, микрофлора при БВ включает широкий спектр анаэробных бактерий, среди которых можно выделить факультативно-анаэробные (G. vaginalis, A. vaginae) и облигатно-анаэробные (бактероиды, фузобактерии, клостридии) бактерии. Таким образом, мы предположили, что все изучаемые случаи могут быть разделены на 4 кластера, или типа микробиоценоза, в зависимости от доминирования тех или иных групп бактерий: с преобладанием лактобацилл, аэробных бактерий (семейства Enterobacteriaceae, стафилококков и стрептококков), факультативно-анаэробных бактерий и облигатно-анаэробных бактерий.
Кластеризацию проводили по микробиологическим (количественное содержание бактерий в образцах) и клиническим (значение рН влагалища, наличие или отсутствие выделений, положительный или отрицательный аминный тест, наличие или отсутствие ключевых клеток) признакам. Были включены следующие бактерии/группы бактерий: Lactobacillus/ОБМ, Enterobacteriaceae/ОБМ, Streptococcus/ОБМ, Staphylococcus/ОБМ, Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas/ОБМ, Eubacterium/ОБМ, Sneathia/Leptotrichia/Fusobacterium/ОБМ, Megasphaera/Veillonella/Dialister/ОБМ, Lachnobacterium/Clostridium/ОБМ, Corynebacterium/Mobiluncus/ОБМ, Peptostreptococcus/ОБМ, Atopobium vaginae/ОБМ, Mycoplasma hominis/ОБМ (в тесте Фемофлор-16 количество ДНК M. hominis выражается в абсолютных единицах концентрации, однако для кластерного анализа количественное содержание этих бактерий было представлено в относительном выражении). Микроорганизмы родов Ureaplasma и Candida в кластерный анализ не включили в связи с отсутствием их ассоциации с БВ. Несмотря на то, что группа бактерий Corynebacterium/Mobiluncus также не показала корреляции с БВ, данный параметр был включен в кластерный анализ ввиду того, что Mobiluncus spp. традиционно рассматривается как важный компонент БВ.
Полученная модель кластеризации была оценена как «хорошее разделение кластеров» (рис. 3.2).
В результате анализа все случаи были отнесены к одному из 4 кластеров (рис. 3.3). Кластер 1, самый многочисленный (n=171), включал случаи, когда вагинальная микрофлора состояла преимущественно из лактобацилл. В кластер 2, самый малочисленный (n=11), вошли случаи доминирования аэробной микрофлоры: Enterobacteriaceae, Streptococcus и Staphylococcus. К кластерам 3 (n=57) и 4 (n=31) были отнесены случаи доминирования факультативно анаэробной (Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae) и облигатно-анаэробной (Sneathia/Leptotrichia/Fusobacterium, Megasphaera/Veillonella/Dialister, Lachnobacterium/Clostridium) микрофлоры, соответственно.
Оценка и модификация критериев Амселя
Чувствительность и специфичность критериев Амселя по отдельности и в совокупности определяли с использованием метода Нуджента как референтного стандарта.
Так как определение диагностических характеристик требует бинарной классификации случаев («есть болезнь» или «нет болезни»), случаи промежуточной микрофлоры были исключены из анализа. В результате в анализ было включено 253 случая. Чувствительность и специфичность критериев Амселя по отдельности и в совокупности представлены в табл. 3.10.
Известно, что критерии Амселя существенно различаются по своей чувствительности и специфичности, на которые, в свою очередь, существенно влияет степень их объективности. В качестве самых объективных критериев рассматриваются повышенное значение вагинального рН ( 4,5) и обнаружение ключевых клеток. Из этих двух критериев только критерий рН является количественным параметром. Кроме того, этот критерий нередко используется при синдромном подходе к диагностике и лечению БВ. Так как специфичность данного критерия при общепринятом пороге 4,5 была относительно низкой (81%), мы решили выяснить, можно ли ее улучшить путем оптимизации порогового значения. С этой целью был проведен ROC-анализ данного параметра. Площадь под ROC-кривой составила 0,991, что можно интерпретировать как отличную классифицирующую способность (рис. 3.22).
Координаты ROC-кривой параметра рН в диапазоне от 4 до 6 представлены в табл. 3.11. При значении рН 5,0 чувствительность данного критерия составила 99%, специфичность – 91%. Таким образом, оптимизация порогового значения рН позволила существенно повысить специфичность при несущественной потере чувствительности.
Распределение случаев нормальной микрофлоры, промежуточной микрофлоры и БВ по Нудженту в зависимости от значения рН представлено на рис. 3.23. Категория рН равная 5 включала 32 случая – 12 и 13 случаев нормальной и промежуточной микрофлоры, соответственно, и 7 случаев БВ. Рис. 3.23. Распределение случаев нормальной микрофлоры, промежуточной микрофлоры и БВ (по Нудженту) в зависимости от значения рН
Мы предположили, что можно ограничить применение всей совокупности критериев Амселя только случаями, когда рН влагалища равняется 5, в остальных же случаях использовать для установления диагноза БВ критерий рН 5. В результате необходимость применения всей совокупности критериев Амселя сокращается практически на 90% (32 из 280). Чувствительность и специфичность такого комбинированного подхода к диагностике БВ составляют 99% (80 из 81) и 98% (168 из 172), соответственно.
Таким образом, оптимизация стандартного порога рН, входящего в критерии Амселя, приводит к существенному повышению специфичности этого критерия (с 81% до 90%) при несущественной потере его чувствительности (со 100% до 99%). Применение совокупности критериев Амселя только для разрешения случаев, когда рН равняется 5, позволяет сократить его использование на 90%, при этом сохраняется высокая чувствительность и специфичность клинической диагностики БВ – 99% и 98%, соответственно.