Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Характеристика иммунного ответа при заболевании гриппом и вакцинации (Обзор литературы)
1.1. Поляризация иммунного ответа и особенности цитокиновых реакций при гриппе 17
1.2. Особенности гуморального и клеточного иммунитета при гриппозной инфекции 35
1.3. Роль окислительно-метаболических процессов при гриппе 41
1.4. Особенности иммунного реагирования на вакцинацию 46
1.5. Иммунокорригирующая терапия при гриппе у детей и взрослых на современном этапе 49
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Контингент и материалы для исследования 55
2.2. Изученные препараты 59
2.3. Методы исследования
2.3.1. Интерфероновый статус и цитокиновый профиль 66
2.3.2. Исследование гуморального и клеточного иммунитета 69
2.3.3. Биохимические исследования 72
2.3.4. Статистические методы 73
Глава 3. Клинико-иммунологические особенности гриппа у детей и взрослых в зависимости от направленности иммунного ответа
3.1. Система интерферона и поляризация иммунного ответа при гриппе 74
3.2. Особенности цитокиновой системы при гриппе у детей и взрослых в зависимости от поляризации иммунного ответа 84
3.3. Особенности цитокиновой системы у детей и взрослых при гриппе в зависимости от выраженности синдрома интоксикации .. 107
3.4. Влияние поляризации иммунного ответа по ТЫ и Th2 типу на гуморальный иммунитет при гриппе у детей и взрослых 121
3.5. Характеристика клеточного иммунитета у больных гриппом в зависимости от направленности иммунного ответа 130
3.6. Результаты изучения динамики показателей окислительно-метаболических процессов при гриппе у детей в зависимости от типа иммунного ответа 142
3.7. Способ прогнозирования клинического течения заболевания при гриппе у детей 145
Глава 4. Влияние противовирусной и иммуно-корригирующей терапии на поляризацию иммунного ответа при гриппе у детей и взрослых
4.1. Влияние противовирусных препаратов на продукцию цитокинов и окислительно-метаболические процессы при терапии гриппа. 149
4.2. Динамика иммунологических и биохимических параметров при использовании препаратов интерферона и его индукторов 163
4.3. Оценка эффективности препарата Беталейкин в зависимости от типа иммунного ответа у взрослых пациентов при гриппе, осложненном пневмонией 175
Глава 5. Изучение иммунного реагирования на введение инактивиров анной гриппозной вакцины
5.1. Цитокиновые реакции при двукратной вакцинации инактивированной вакциной против птичьего гриппа H5N1 189
5.2. Клеточные реакции на двукратное введение инактивированной вакцины 197
5.3 Пролиферативная активность лимфоцитов здоровых добровольцев при двукратной вакцинации 199
5.4. Способ повышения иммуногенности вакцины против птичьего гриппа H5N1 препаратом интерферона гамма у взрослых 203
5.5. Сравнительная оценка спектра цитокинов в поствакцинальном периоде при двух схемах вакцинации 206
5.6. Оценка клеточного звена иммунитета в поствакцинальном периоде при двух схемах вакцинации 212
Заключение 217
Выводы 239
Практические рекомендации 241
Список литературы 2
- Иммунокорригирующая терапия при гриппе у детей и взрослых на современном этапе
- Исследование гуморального и клеточного иммунитета
- Особенности цитокиновой системы у детей и взрослых при гриппе в зависимости от выраженности синдрома интоксикации
- Динамика иммунологических и биохимических параметров при использовании препаратов интерферона и его индукторов
Введение к работе
Актуальность исследования. Грипп является опасной и неуправляемой инфекцией с постоянной изменчивостью антигенной структуры и биологических свойств возбудителя при трансмиссии от одного вида хозяина к другому. Грипп характеризуется высокой вероятностью ургентных состояний и развития осложнений, что может приводить к летальному исходу у пациентов любого возраста (Chien Y.S., 2010; Киселев О.И., 2012; Осидак Л.В. и др., 2014).
Своевременная диагностика и прогнозирование угрожаемых и критических состояний при гриппозной инфекции у детей и взрослых продолжают оставаться актуальной научной и клинической проблемой, сохраняется необходимость оптимизации терапии и вакцинопрофилактики гриппа (Киселев О.И., 2014; Афанасьева О.И., 2012; Cassetti М.С. et al., 2006).
Иммунологическая реактивность организма является основным фактором, определяющим степень тяжести клинической манифестации и исход гриппозной инфекции. В ходе взаимодействия вируса гриппа с клетками-мишенями, его презентации иммунокомпетентным клеткам, начинается выработка гуморальных факторов врожденной защиты (лизоцима, цитокинов, системы комплемента), определяющих формирование иммунного ответа преимущественно по гуморальному или клеточному типу (Железникова Г.Ф., 2007; Boehme K.W. 2004; Zhang Y.H.etal, 2013).
В основу концепции поляризации иммунного ответа легло открытие среди Т-лимфоцитов у мышей, а затем и у человека двух субпопуляций Т-хелперов (ТЫ и Th2), которые продуцируют разный спектр цитокинов (TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-6, характерных для Thl типа) и (IL-4, IL-10, характерных для Th2 типа), оказывающих противоположное влияние на основные звенья иммунного ответа (Mossman T.R.,1986).
Дифференцировка наивных Т-лимфоцитов на Thl и Th2 тип, опредеяющих направленность иммунного ответа, зависит от дозы антигена, силы сигнала, проводимого через Толл-подобные рецепторы, экспрессии на мембранах макрофагов антигенов МНС II, Fc-рецепторов для JgG. Особенности костимулирующего действия факторов активации генов раннего иммунного ответа обусловлены не только антигенным вариантом возбудителя возбудителя, но и генетическими особенностями индивида (Сологуб Т.В.и др.,2009; Щеплягина Л.А., 2009; McElhaney J.E. et al, 2005).
Наиболее эффективным иммунным ответом при поражении организма внутриклеточными возбудителями, каковым является вирус гриппа, считается клеточный иммунитет Thl типа, тогда как гуморальный ответ Th2 типа не всегда способен обеспечить санацию организма, и чаще ассоциирован с прогрессированием заболевания (Железникова Г.Ф.,2009; Chien Y.S., 2010; Zhang Y.H.,2013).
Степень тяжести гриппа во многом обусловлена системными проявлениями воспаления, которые характеризуются лихорадкой, реакцией кроветворной системы, ускоренным обменом веществ с нарушением редокс-баланса. Изменение иммунологической реактивности, связанной с иммуносупрессией и гиперпродукцией провоспалительных цитокинов (цитокиновый шторм), при срыве
компенсаторных механизмов может приводить развитию синдрома системной воспалительной реакции (ССВР) и полиорганной недостаточности. Поэтому является актуальной своевременная диагностика и прогнозирование течения гриппа в период отсутствия функциональных органных нарушений (Устьянцева И.М., 2006; Сергеева В.А., 2011; Киселев О.И., 2014; Suoqin Jin et all, 2014).
Степень разработанности темы исследования.
Известно, что для гриппа характерна активация ТЫ типа иммунного ответа с выработкой провоспалительных цитокинов TNF-a, IFN-y. Показано, что увеличение продукции про- и противовоспалительных цитокинов IL-ip, IL-4, IL-8, IL-10, TNF-a на фоне недостаточной продукции IFN-a и IFN-y играет важную роль в иммунопатогенезе тяжелого и осложненного гриппа (Оразаев Н.Г., 2007; Cheung C.Y. et аі, 2002; Образцова Е.В., 2007).
Индивидуальные различия в выраженности иммунных реакций, регулируемых медиаторами воспаления, обусловлены полиморфизмом генов цитокинов и их рецепторов (Силков А.Н., 2013; Романова Е.Н., 2014). Сниженная функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов крови, основных клеток врожденной резистентности, является одной из важных причин развития бактериальных осложнений при гриппе (Doherty Т.М., 1995; Хаитов P.M., 2001).
Однако недостаточно изучены коррелятивные связи медиаторов воспаления с показателями гуморального и клеточного иммунитета, а также с биохимическими изменениями в системе перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в зависимости от клинического течения гриппа (Гусева М.Н., 2005; Friedman M.J. et al, 2004; Chien Y.S. et al, 2010).
В исследованиях последних лет показано, что присутствие аутоантител в сыворотке крови не всегда может свидетельствовать об аутоиммунной природе заболевания, а зависит от концентрации субстрата-вещества, вызвавшего его образование, и характеризует их регуляторные функции в иммунном ответе (Лютфалиева Г.Т., 2012). Существуют немногочисленные наблюдения о негативном влиянии высокого содержания anti-IFN-a антител в сыворотке крови, а также рецепторного антагониста IL-lra, которые отражают дисбаланс иммунной системы при остром гепатите С, аутоиммунной патологии. Диагностическая и патогенетическая роль этих показателей при гриппе мало изучена (Ikeda Y., 1991; Волкова Л.В., 2008; Волощук Л.В., 2011).
В многолетних комплексных исследованиях, проведенных сотрудниками ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России, была показана клиническая эффективность цитокиновых препаратов в терапии гриппа (Афанасьева О.И., 2012; Волощук Л.В., 2011). Однако данные, свидетельствующие о влиянии этих препаратов на девиацию иммунного реагирования при гриппозной инфекции, в зависимости от клинического течения гриппа во взаимосвязи с другими звеньями иммунитета не представлены.
После введения инактивированной вакцины против гриппа иммунитет сохраняется не более 12 месяцев, поэтому необходим поиск путей стимуляции иммунного реагирования на вакцинацию для формирования более эффективной
специфической защиты от гриппа, а также возможности активации механизмов врожденного иммунитета (Ерофеева М.К., 2001; Harper S.A., 2009; Govorkova Е.А., 2006).
Таким образом, актуальным является выявление особенностей эндогенной регуляции межклеточных взаимодействий при гриппе, основанных на поляризации иммунного ответа по ТЫ или Th2 типу во взаимосвязи с другими звеньями иммунитета. Это позволит установить новые диагностические критерии прогнозирования характера течения заболевания и найти подходы к разработке тактики направленной иммунокоррекции для усовершенствования и оптимизации терапии и иммунопрофилактики гриппа.
Цель исследования.
Обоснование концептуально-диагностических закономерностей вариантов иммунного ответа при гриппе для прогнозирования характера течения заболевания, оптимизации терапии и вакцинопрофилактики.
Задачи исследования:
-
Разработать рациональный способ определения Thl, Th2 или смешанного Thl/Th2 типов иммунного ответа при гриппе и выявить закономерности их влияния на степень тяжести заболевания во взаимосвязи с основными параметрами гуморального, клеточного иммунитета и окислительно-метаболических процессов.
-
Оценить значимость рецепторного антагониста IL-lra и anti-IFN-a антител в регуляции иммунного ответа и клинического течения гриппа.
-
Определить диагностические критерии прогнозирования характера клинического течения при гриппе на основании выявленных концептуально-диагностических закономерностей иммунного ответа.
-
Изучить влияние на поляризацию иммунного ответа при гриппе ряда этиотропных препаратов, рекомбинантных цитокинов и индукторов интерферона для оптимизации терапии.
-
Обосновать целесообразность применения препарата рекомбинантного интерферона гамма для повышения иммуногенности вакцины против птичьего гриппа H5N1.
Научная новизна и теоретическая значимость
Впервые на основании выявленных взаимосвязей основных параметров гуморального, клеточного иммунитета и окислительно-метаболических процессов, отражающих степень декомпенсации иммунной системы, обоснованы концептуально-диагностические закономерности влияния типов иммунного ответа при гриппе у детей и взрослых на степень тяжести заболевания и развитие осложнений.
Разработан рациональный способ определения ТЫ, Th2 или смешанного Thl/Th2 типов иммунного ответа при гриппе на основании предложенных коэффициентов поляризации (ЮТ), полученных в результате расчета соотношения показателей содержания в сыворотке крови цитокинов KQl=IL-4/IFNy и KQ2=IL-10/IFN-y.
Впервые при гриппе установлена патогенетическая значимость высокого уровня концентрации рецепторного антагониста IL-lra и anti-IFN-a антител при тяжелом и осложненном течении заболевания у пациентов с различным типом иммунного ответа.
Впервые установлена взаимосвязь Th2 типа иммунного ответа с изменениями ряда иммунологических и биохимических параметров, отражающих степень декомпенсации иммунной системы, что существенно раскрывает и дополняет представление об иммунопатогенезе тяжелых форм и осложненного течения гриппа.
Доказано, что тяжелая степень тяжести заболевания и/или развитие осложнений при гриппе ассоциированы с Th2 типом иммунного ответа, определяемом при КП1 и КГТ2 больше 3, что обусловлено дисбалансом цитокиновых реакций, уменьшением относительного содержания субпопуляций лимфоцитов-киллеров (CD3+CD8+, CD3-CD16+), снижением функциональной активности интерферонпродуцирующих клеток и усилением свободнорадикальных процессов.
Показано, что при гриппе раннее применение противовирусных и иммунокорригирующих препаратов приводит к переключению иммунного ответа с Th2 на ТЫ тип, что способствует устранению дисбаланса окислительно-метаболических процессов и сокращению продолжительности заболевания.
Впервые показано адъювантное влияние на иммунный ответ препарата рекомбинантного IFN-y при однократном введении вакцины ОрниФлю против птичьего гриппа H5N1, что приводит к более эффективному формированию специфических антител и стимуляции врожденного иммунитета.
Практическая значимость работы.
В результате проведенных исследований выявлены концептуально-диагностические закономерности влияния типов иммунного ответа на клиническое течение гриппа независимо от возраста.
Высокая степень положительной корреляции дисбаланса цитокиновых реакций, клеточного и гуморального иммунитета и усиления окислительно-метаболических процессов с Th2 типом иммунного ответа позволяет использовать предложенные коэффициенты поляризации для прогнозирования заболевания тяжелой степени тяжести и развития осложнений при гриппе.
Разработаны и защищены патентами способы прогнозирования тяжести заболевания и обострения хронической бронхолегочной патологии при гриппе на основании динамики предложенных коэффициентов поляризации, что определяет индивидуальную тактику направленной иммунокоррекции в терапии.
Представлено клинико-иммунологическое обоснование эффективности противовирусных препаратов (Осельтамивир, Умифеновир), индукторов интерферона (Деринат, Циклоферон) и рекомбинантных цитокинов (Виферон, Генферон, Гриппферон, Беталейкин) за счет направленной иммунокоррекции в сторону ТЫ типа у пациентов с Th2 и смешанным Thl/Th2 типом иммунного ответа при гриппе.
Предложен новый способ усиления иммуногенности вакцины против птичьего гриппа H5N1 (ОрниФлю) с помощью сочетанного введения препарата рекомбинантного IFN-y (Ингарон), что позволяет перейти на однократную вакцинацию и решить важную медицинскую и социально-экономическую проблему при организации массовой вакцинопрофилактики гриппа.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Иммунопатогенез гриппа определяется формированием иммунного ответа по
трем типам: Thl, Th2 и смешанному Thl/Th2, которые характеризуются
различными коэффициентами соотношения показателей содержания в сыворотке
крови цитокинов IL-4 и IL-10 к IFN-y и обусловливают особенности клинического
течения гриппозной инфекции.
2. Th2 тип иммунного ответа ассоциирован с тяжелым и осложненным
течением гриппа, коррелирует с высоким уровнем концентрации
провоспалительных цитокинов, рецепторного антагониста IL-lra и anti-IFN-a
антител в начале заболевания на фоне уменьшения относительного содержания
лимфоцитов-киллеров CD3+CD8+, CD3-CD16+, при увеличении активности
окислительно-метаболических процессов, что необходимо учитывать при
диагностике и прогнозировании.
-
Применение этиотропных и цитокиновых препаратов на ранних сроках гриппа способствует переключению иммунного ответа на ТЫ тип и нормализации баланса окислительно-метаболических процессов, что обусловливает сокращение продолжительности клинических синдромов и предупреждает развитие осложнений.
-
Сочетанное применение препарата IFN-y с вакциной против птичьего гриппа H5N1 способствует активации, как клеточного, так и гуморального звена, способствуя более эффективному формированию специфических антител и стимуляции активности врожденного иммунитета.
Реализация и внедрение результатов исследования.
Способы прогнозирования степени тяжести гриппа, обострения бронхиальной астмы и/или муковисцидоза при гриппе у детей, способ лечения гриппа, осложненного пневмонией, у взрослых защищены патентами и внедрены в клиническую практику у детей в ДГБ Святой Ольги и ДГКБ №5 им.Н.Ф.Филатова, а также отделения РВИ у взрослых ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России г. Санкт-Петербурга.
Подготовлена для утверждения Новая медицинская технология «Способы прогнозирования тяжелых форм острых респираторных вирусных инфекций и обострения бронхиальной астмы и/или муковисцидоза при гриппе у детей».
Научные положения и выводы включены в образовательную программу клинической ординатуры по специальности «Инфекционные болезни» в ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России. Материалы диссертации включены в методические пособия для врачей, в том числе «Острые респираторные инфекции у
детей и подростков: практическое руководство для врачей» под ред. Л.В. Осидак, 2014.
Возможные области применения и формы внедрения. Клиническая лабораторная диагностика, клиническая иммунология, инфектология, вакцинопрофилактика. Экономический эффект от внедрения будет определяться снижением частоты развития осложнений гриппа, а также сокращением длительности пребывания в стационаре.
Методология и методы исследования. Для реализации цели исследования и обоснования основных положений были использованы аналитический обзор литературы, современные методы клинической лабораторной диагностики и методы статистической обработки данных.
Степень достоверности и апробация результатов исследования.
Достоверность полученных результатов исследований определяется достаточным и репрезентативным объемом выборок обследованных пациентов и проведенных исследований с использованием современных методов клинической лабораторной диагностики и подтверждена методами статистической обработки данных, адекватных поставленным задачам.
Основные материалы диссертации представлены на Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2006, 2009), VII Российском съезде врачей-инфекционистов (Санкт-Петербург, 2008), V- XIII конгрессах детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей (диагностика и лечение)» (Москва, 2007-14гг), на XIV и XV Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 2011 и 2015 года, на Всероссийской научно-практической конференции «Инфекционные аспекты соматической патологии у детей» (Москва, 2012, 2013, 2014).
По теме диссертации опубликовано 62 работы, из них 39 статей в рецензируемых журналах, включенных в список ВАК, 4 патента на изобретение, издано 5 методических пособий и руководств для врачей.
Личное участие автора. Диссертант лично участвовал в планировании и организации работы, проведении и интерпретации лабораторных исследований, обработке, анализе, обобщении и представлении полученных данных.
Объем и структура диссертации.
Иммунокорригирующая терапия при гриппе у детей и взрослых на современном этапе
Иммунопатогенез гриппозной инфекции в настоящее время достаточно хорошо изучен, но в последние годы по данным большинства авторов в комплексном взаимодействии факторов врожденного и приобретенного (адаптивного) иммунитета одна из первостепенных ролей отводится системе цитокинов, регулирующих механизмы иммунных реакций.
В литературе все больше данных о дисбалансе системы цитокинов при вирусных инфекциях. В свете новых достижений клинической лабораторной диагностики остаются неясными некоторые механизмы иммунной защиты в зависимости от исходного состояния организма заболевшего человека. Неоднозначны и недостаточны литературные данные и о характере цитокиновых реакций при гриппе в сравнении у детей и взрослых [48, 51, 57, 258, 269, 271].
Цитокины представляют собой средние молекулы гликопротеина, продуцируемые различными по гистогенетическому происхождению типами клеток организма, которые образуют цитокиновую сеть, обеспечивают нормальное функционирование иммунной системы, регулируют процессы пролиферации, миграции и дифференцировки клеток, а также интенсивность и направленность иммунных реакций [69, 79, 146, 295, 314].
Цитокины ответственны, как за инициацию, так и за разрешение процесса локального и системного воспаления, обладают плейотропностью (один и тот же цитокин может действовать на многие типы клеток, вызывая различные эффекты в зависимости от вида клеток-мишеней), а также взаимозаменяемостью биологического действия [149,150, 296, 314, 327].
Т. R. Mossman [293, 294] в своих исследованиях показал, что в результате дифференцировки наивных CD4+T-клеток образуются два типа Т-хелперов - ТЫ и Th2. Открытие методов количественного анализа цитокинов позволило автору показать, что Т-хелперы различаются между собой спектром продуцируемых цитокинов: ТЫ продуцируют IFN-y, TNF-a, IL-2, тогда как Th2 - IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, что и обеспечивает поляризацию иммунного ответа [66, 194, 197].
Направленность поляризации дифференцировки ThO лимфоцитов зависит от генетических особенностей человека, возраста, свойств и инфекционной дозы вируса гриппа [53, 153, 175, 176, 202, 342].
После распознавания антигена клетками врожденной системы иммунитета (нейтрофилы, моноциты и макрофаги) в зависимости от состояния «паттерн-распознающих рецепторов», к которым, прежде всего, относятся Toll-подобные рецепторы, передаются сигналы к активации ИКК с последующим синтезом провоспалительных цитокинов и хемокинов с развитием локальных воспалительных реакций. При высокой вирулентности и высокой инфекционной дозе вируса воспалительные реакции приобретают системный характер со значительным выбросом в кровь цитокинов и белков острой фазы, что клинически соответствует тяжелой степени тяжести заболевания [104, 117, 269, 284].
В основе причин развития тяжелого заболевания и летального исхода человека от многих инфекций могут лежать дефекты функции Toll-подобных рецепторов, а также протеинкиназы, ассоциированной с рецептором IL-1 (IRAK) [235,280,285].
Toll-подобные рецепторы (toll-like TLR) - семейства молекул, состоящих из 11 трансмембранных одноцепочечных белков-рецепторов со сходным строением и общим свойством взаимодействия с белковыми структурами вирусов -гликопротеидами, липопротеидами, РНК и ДНК, формирования и проведения в ядро активационного сигнала, ведущего к повышению защитных неспецифических механизмов организма, в частности воспалительной реакции. Toll-подобные рецепторы экспрессированы на моноцитах, макрофагах, нейтрофилах, дендритных клетках, NK-клетках и, в меньшей степени, на эозинофилах, Т- и В-лимфоцитах. Эпителиоциты респираторного тракта и дендритные клетки экспрессируют все известные TLR [211, 239, 282, 325].
Железниковой Г.Ф. с соавторами (2007г.) была сформулирована концепция формирования четырех вариантов иммунного ответа в соответствии с исходным уровнем устойчивости к возбудителю инфекции, различающимися наличием или отсутствием супрессии реакции бласттрансформации Т-лимфоцитов на фитогемагглютинин (ФГА-РБТЛ), коррелирующие с показателями цитокинов, характеризующих баланс ТЫ и Th2, что и позволяет определить направленность иммунного реагирования при инфекционных заболеваниях [53, 58, 67].
Известно, что поляризация Th-О лимфоцитов зависит от функционального состояния и типа антиген-презентирующих клеток, прежде всего дендритных клеток и макрофагов, которые могут направлять дифференцировку ThO, создавая условия для предпочтительного развития иммунного ответа по ТЫ типу, продуцируя в раннюю фазу взаимодействия организма с антигеном цитокин IL-12. При его недостаточном синтезе и увеличении уровня цитокина IL-4 происходит активация иммунных реакций Th2 типа, В-лимфоциты дифференцируются в плазматические клетки, и стимулируется синтез иммуноглобулинов всех изотипов. Однако при избыточной активации Th2 типа возможно увеличение цитокина IL-5, являющегося хемоаттрактантом для эозинофилов, вызывающего их дегрануляцию, а также происходит стимуляция продукции IgG4 и IgE, что играет значительную роль в патогенезе аллергического воспаления [69, 96, 316, 326].
Максимальная частота острых респираторных инфекций среди детей отмечается именно в возрасте от 6 месяцев до 6 лет, когда происходит смена иммунного ответа Т1і2-типа, преобладающего с рождения, на ТЫ-тип, обеспечивающего противоинфекционную защиту и устойчивость к вирусным инфекциям. С увеличением возраста и при повторных заболеваниях ОРВИ в процессе иммунного ответа на вирусные антигены происходит девиация ThO в сторону ТЫ с выработкой IFN-y и IL-2. Их высокая концентрация способствует подавлению активности Т1і2-клеток [9, 54, 103, 299, 300]. Известно, что соотношение клеток ТЫ и Th2 типов в разные возрастные периоды имеет определенные различия. Если у здоровых взрослых отмечается относительное преобладание лимфоцитов ТЫ типа и их соотношение Th2:Thl в периферической крови составляет 3:4, то в пуповинной крови это отношение составляет 10-100:1. Для плода характерна Т1і2-поляризация, которая обеспечивает физиологическое течение беременности, предотвращает риск отслойки плаценты и иммунологических конфликтов с участием цитотоксических лимфоцитов (CD8+) и естественных киллеров (NK-клеток). Переход от Th2 к ТЫ типу иммунного ответа в норме происходит в первые годы жизни [34, 41, 110, 232].
Повышенную восприимчивость детей младшего возраста и лиц с неблагоприятным преморбидным фоном к вирусным инфекциям, а также более тяжелое течение ОРВИ обусловливают незрелость Т-лимфоцитов, низкий уровень естественных киллеров и недостаточный гуморальный ответ на антигенный стимул, с чем многие исследователи ассоциируют низкие уровни IFN-a и IFN-y в сыворотке крови у детей [6, 99,164, 166].
Одним из ведущих факторов врожденной защиты организма, является система интерферонов (IFN), относящихся к цитокинам, обладающим различными свойствами, направленными на инактивацию и элиминацию возбудителя, участвующих в иммунных и воспалительных реакциях [50, 250, 337].
Имеется тесная взаимосвязь между Толл-подобными рецепторами и системой интерферонов. При вирусных инфекциях пять типов Толл-подобных рецепторов (3, 4, 7, 8, 9) участвуют в индукции синтеза интерферонов [209, 295, 321].
Исследование гуморального и клеточного иммунитета
Умеренное нарастание уровня спонтанной продукции IFN-a свидетельствовало о реакции организма на вторжение вируса гриппа. При этом у детей в возрасте от 1 года до 6-ти лет спонтанная продукция IFN-a была статистически значимо более низкой, чем у детей до 1 года и взрослых пациентов 63,9±3,2 пг/мл против 75,4±3,9 и 77,0±3,6 пг/мл.
У детей младше 6-ти лет, больных гриппом, содержание цитокина IL-4, а также его соотношение с IFN-y превышало показатели у здоровых почти в 2 раза, и было статистически значимо выше, чем у старших детей, что не противоречит концепции других авторов о преимущественной поляризации дифференцировки ТО-лимфоцитов в сторону Th2 типа у младших детей [34, 110, 232].
У пациентов старше 7 лет и взрослых значения Kni=IL-4/IFN-y и Kn2=IL-10/IFN-y в пределах 1,0±0,2 свидетельствовали о преимущественной поляризации по ТЫ типу с активацией клеточного иммунитета при гриппе.
Установлено, что у детей с гриппом независимо от возраста при гладком течении заболевания при ТЫ типе иммунного ответа средний уровень спонтанного и сывороточного IFN-a был статистически значимо выше, чем при других типах ИО и составлял 60,2±2,7 и 58,4±2,2 пг/мл соответственно (табл. 3.1.4.).
Было показано, что при гриппе с вовлечением в процесс нижних отделов респираторного тракта при бронхите были пациенты с ТЫ типом иммунного ответа, но показатели спонтанного и сывороточного IFN-a был статистически значимо ниже, чем при гладком течении и составляла 54,0±1,2 и 34,4±1,3 пг/мл соответственно.
У детей при бронхитах Th2 тип ИО определялся в 54,6, смешанный Thl/Th2 тип ИО в 33,3% случаев, а при развитии пневмонии - в 76,3 и 23,7% случаев соответственно, при этом уровень спонтанного IFN-a и содержание в сыворотке крови были 27,3±1,4 и 23,3±1,5 пг/мл, при смешанном Thl/Th2 типе ИО - 31,1±1,6 и 31,8± 1,5 пг/мл соответственно. Таблица 3.1.4
При развитии пневмонии в первые дни заболевания гриппом у детей разного возраста определялся Th2 тип ИО в 76,3% и смешанный Thl/Th2 тип - в 23,7% случаев.
Содержание спонтанного IFN-oc составляло 17,3±1,4 и 26,1±1,4 пг/мл, а сывороточного 16,3,3+1,5 и 22,8±1,4 пг/мл соответственно, что было в пределах референсных значений у здоровых детей. Индуцированная продукция IFN-oc при Th2 типе ИО составила 102,0+2,7 пг/мл и при смешанном Thl/Th2 типе ИО -118,4±2,9 пг/мл, что было статистически значимо ниже показателей при гладком течении и при бронхитах. Эти данные свидетельствовали о нарушении активации врожденных механизмов иммунной защиты и отражали недостаточную иммунореактивность у пациентов.
У пациентов с гриппом без осложнений при ТЫ типе ИО содержание в сыворотке и спонтанная продукция IFN-y были выше показателей здоровых детей и составляли 56,2+2,1 и 55,4±1,2 пг/мл, соответственно. При развитии бронхита эти показатели были статистически значимо ниже и не превышали референсных значений (34,9±1,2 и 39,4±1,3 пг/мл, соответственно) (табл.3.1.5).
При гладком течении гриппа без бронхолегочных поражений индуцированная продукция IFN-y была на нижней границе референсных значений и составляла 194,7±2,3 пг/мл при ТЫ типе ИО и 172,0±1,7 пг/мл при смешанном Thl/Th2 типе иммунного ответа.
Показано, что в острую фазу гриппа с поражением нижних отделов респираторного тракта уровни спонтанного и сывороточного IFN-y снижены у пациентов всех возрастных групп, что обусловливает активацию лимфоцитов Th2 типа и определяет гуморальную направленность иммунного ответа. Таблица 3.1.5. Динамика продукции IFN-y у детей при гриппе в зависимости от уровня поражения респираторного тракта (М±т)
При исследовании на 2-3 день от начала заболевания у большинства обследованных детей наблюдалось некоторое повышение всех показателей интерферонового статуса, что свидетельствовало об адекватной защитной реакции организма на инфекцию.
При третьем исследовании в период реконвалесценции, как правило, отмечалось снижение уровня спонтанной и индуцированной продукции IFN-y и снижение его содержания в сыворотке крови, что объясняется некоторым истощением функциональной активности ИКК, то есть появляется состояние вторичного иммунодефицита, что может быть опасно при суперинфицировании пациента. Этот факт может свидетельствовать о том, что функциональная активность интерферонпродуцирующих клеток сохранена, однако не происходит активации
Повышение в динамике содержания сывороточного и спонтанного IFN-y указывает на активность иммунного ответа в целом на заболевание, но при тяжелой степени тяжести гриппозной инфекции увеличения этих показателей не наблюдается, что возможно связано с недостаточной активацией клеток, ответственных за продукцию IFN-y. При этом иммунный ответ идет по Th2 типу, что является неблагоприятным фактором при заболевании гриппом и свидетельствует о недостаточности других защитных систем организма, приводящих к осложненному течению заболевания.
Особенности цитокиновой системы у детей и взрослых при гриппе в зависимости от выраженности синдрома интоксикации
Развитие нейтропении, свидетельствующей об истощении резервных возможностей организма, в совокупности с недостаточностью других защитных механизмов может способствовать развитию бактериальных осложнений и присоединению госпитальных инфекций.
При развитии иммунного ответа по Th2 типу, кроме того, имело место статистически значимое по сравнению с другими группами, увеличение числа эозинофилов, что может в свою очередь способствовать выработке эозинофильного катионного белка (ЭКБ), одного из реагинов, который стимулирует секрецию слизи в бронхах, тормозит пролиферацию Т-лимфоцитов, связывает и нейтрализует гепарин. Клинически это может приводить к пролонгации воспалительного процесса и более длительному периоду реконвалесценции, а также способствует аллергизации организма ребенка [9, 308].
В начале заболевания показатель спонтанного НСТ-теста при гладком течении при поляризации по ТЫ типу в среднем был 118,4±2,3 ед/млн.кл, тогда как при поляризации по Th2 типу 78,0±2,3 ед/млн.кл, что свидетельствовало о снижении функциональной активности нейтрофилов и клинически соответствовало осложненному течению гриппа (табл.3.5.2).
У пациентов с бронхолегочными осложнениями при поляризации по Th2 типу показатели спонтанного и индуцированного НСТ-теста были статистически значимо меньше нижней границы нормы, что составляло 42,2±2,1 и 102,4±3,2 ед/млн.кл соответственно.
Снижение спонтанного и индуцированного НСТ-теста свидетельствовало о значительном снижении функциональной активности нейтрофилов. В сочетании с нейтропенией это приводило к более длительному и тяжелому течению заболевания.
У больных гриппом детей без осложнений при поляризации иммунного ответа по ТЫ и смешанному Thl/Th2 типу активность нейтрофилов периферической крови в спонтанном НСТ-тесте сохраняется в пределах нормальных значений, тогда как при поляризации иммунного ответа по Th2 типу отмечается статистически значимое снижение уровня как спонтанного, так и индуцированного НСТ-теста.
В период ранней реконвалесценции во всех наблюдаемых группах отмечается тенденция к восстановлению показателей НСТ-теста, однако в большинстве случаев их значения не достигают нормальных величин.
В связи с этим можно полагать, что при тяжелом и осложненном течении в очаг воспаления в дыхательные пути мигрируют функционально неполноценные нейтрофильные лейкоциты с низким уровнем антибактериальных компонентов.
Также гипореактивное состояние нейтрофилов может быть связано с уже реализованным цитопатогенным потенциалом in vivo, то есть с уже истощенными резервными возможностями, что может привести к распространению воспалительного процесса и развитию осложнений.
Таким образом, было показано, что при поляризации иммунного ответа по ТЫ и смешанному Thl/Th2 типу реализуется более выраженное возрастание уровня активации нейтрофилов in vitro, что характерно для нормального течения острого воспалительного процесса без угрозы развития осложнений.
Поляризация иммунного ответа по Th2 типу ассоциирована со снижением функциональной активности нейтрофилов периферической крови, что определяется в значительно более низких показателях в нагрузочном тесте и характеризует высокую вероятность распространения воспалительного процесса и развития таких осложнений, как бронхит и пневмония.
Развитие воспалительного процесса, обусловленного гриппозной инфекцией, сопровождается изменением относительного и абсолютного содержания субпопуляций лимфоцитов, различающихся по генетическим и функциональным признакам.
Причиной нарушения в количественном составе иммунокомпетентных клеток, как правило, являются незавершенность дифференцировки клеток и влияние на них различных ингибирующих факторов. При этом снижается цитотоксическая активность Т-лимфоцитов и макрофагов, наблюдается уменьшение числа В-лимфоцитов (CD3-CD19+) и Т-хелперов (CD3+CD4+), может также снижаться активность естественных киллеров (CD3-CD16+).
Среди лимфоцитов, обладающих киллерной активностью, основную роль в элиминации вирусов из пораженных ими клеток играют цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+) и естественные киллеры (NK-клетки CD3-CD16+), осуществляющие прямую цитотоксическую функцию. Хотя последние проявляют защитное действие на ранней стадии инфекции, тем не менее, ведущее значение в разрушении инфицированных клеток и освобождении организма от возбудителя принадлежит цитотоксическим Т-лимфоцитам [39, 172, 225, 247].
Динамика иммунологических и биохимических параметров при использовании препаратов интерферона и его индукторов
Пролиферативный ответ лимфоцитов (индекс стимуляции более 1) на антиген ВШВГ in vitro в образцах культивированной крови имел место у 71% волонтеров группы Плацебо на 29-й день наблюдения, у 67% - на 35-й и 56-й день. Пролиферативный ответ пациентов группы Плацебо на ВШВГ может быть обусловлен наличием в периферической крови клонов как наивных Т- и В-лимфоцитов, так и клонов клеток памяти, несущих специфический рецептор к антигенам вируса гриппа. На разных сроках наблюдения значимых различий в количестве пациентов, индекс стимуляции пролиферации лимфоцитов, которых был более 1, не выявлено, что связано с отсутствием специфического иммунного ответа in vivo в этой группе (рис. 5.3.1).
В последующие сроки наблюдения число волонтеров с индексом стимуляции больше 1 не увеличивалось, а даже снижалось.
На 29-й день после первого введения вакцины индекс стимуляции пролиферации на специфический антиген больше 1 отмечался в 47% случаев.
Через неделю после ревакцинации (35-й день наблюдения от проведения первой вакцинации) число волонтеров с высоким индексом стимуляции пролиферации статистически значимо увеличилось до 71% (р 0,05), а к 56-му дню - до 83% (рис.5.3.2).
Пролиферативный ответ лимфоцитов in vitro на ВШВГ вакцинированных волонтеров в зависимости от сроков после 1-ой вакцинации. По оси абсцисс - время, прошедшее после 1-ой вакцинации, по оси ординат -процент пациентов с увеличенным ( 1) индексом стимуляции пролиферации ВШВГ
На 29-й день после первого введения вакцины отмечено статистически значимое снижение уровня пролиферации лимфоцитов в РБТЛ, индуцированного ВШВГ, приводящее к снижению индекса пролиферации у привитых волонтеров. Возможно это было связано со снижением общей иммунореактивности, которая также выражалась в снижении функциональной активности ИКК по динамике цитокиновых реакций, описанных выше.
В группе вакцинированных пациентов первое исследование пролиферативной активности лимфоцитов на введение ВШВГ в культуру клеток проводили в первый день иммунного ответа на ревакцинацию, то есть в период окончания первичного иммунного ответа что, по-видимому, определило более низкий процент пациентов с высоким пролиферативным ответом на специфический антиген, чем в группе волонтеров, получивших Плацебо.
Число привитых, имеющих индекс пролиферации лимфоцитов более 1, увеличилось в 2 раза на 56-й день по сравнению с группой плацебо, что свидетельствовало о завершении эффекторной фазы и бустерном эффекте повторной вакцинации.
Через неделю после повторного введения вакцины (на 35-й день) уровень спонтанной и индуцированной пролиферации в реакции бласттранформации лимфоцитов статистически значимо снизился в обеих группах наблюдения, однако в группе привитых индекс пролиферации при этом увеличился, тогда, как в группе Плацебо не изменялся (табл. 5.3.1).
На 56-й день спонтанная пролиферация в РБТЛ в обеих группах была одинаковой, тогда как РБТЛ, индуцированная ВШВГ, в группе привитых статистически значимо была выше, что приводило к значительному повышению индекса пролиферации.
Эти данные свидетельствуют о том, что у привитых людей с двукратным введением вакцины праймированные лимфоциты начинают активнее пролиферировать при встрече с антигеном, в данном случае - вакцинным штаммом вируса гриппа, что при встрече с реальным вирусом поможет организму своевременно и адекватно среагировать на вирусную инвазию.
Отмеченная корреляция величины содержания IL-4 и IL-6 с индексом пролиферации более 1 (г=0,58, р 0,05) косвенно свидетельствует об активации гуморального иммунного ответа на 35 день, то есть на 7 день после ревакцинации.
Таким образом, показано, как положительное, так и отрицательное влияние двукратной вакцинации на факторы врожденного и специфического иммунитета. Положительное влияние повторного введения вакцины оказывается в проявлении бустерного эффекта, которое приводит к более выраженному реагированию на вакцинный штамм in vitro. Увеличивается количество и функциональная активность NK-лимфоцитов через месяц после проведения двукратной вакцинации, увеличивается пролиферативная активность в РБТЛ, что может способствовать элиминации не только вируса гриппа, к которому была сделана прививка, но и других возбудителей, что соответствует другим исследованиям [108,273,310].
Выявленное снижение функциональной активности ИКК, отвечающих за синтез IFN-a и IFN-y в первую неделю после вакцинации, может явиться причиной заболевания в ранние сроки после вакцинации.
Поскольку был выявлен большой разброс в значениях изученных показателей, свидетельствующий о неодинаковом иммунном реагировании на вакцинацию у каждого индивидуума, встает вопрос о необходимости применения адъюванта для получения более эффективного иммунного ответа с формированием стойкого иммунитета, который позволит более успешно вакцинировать и иммунокомпрометированный контингент (с наличием хронических заболеваний и часто болеющих).
Способ повышения иммуногенности вакцины против птичьего гриппа H5N1 препаратом рекомбинантного интерферона гамма у взрослых
По параметрам иммуногенности вакцина ОрниФлю с содержанием ГА 15 мкг/доза после однократного введения не удовлетворяла ни одному из национальных и европейских критериев ежегодной регистрации сезонных инактивированных гриппозных вакцин (ИГВ) для лиц в возрасте 18-60 лет.
Для повышения иммуногенной активности подобного типа вакцин, необходимо повторное, т.е. двукратное, введение высоких доз антигена, что связано с увеличением числа побочных эффектов при вакцинации и является очень нежелательным явлением при массовой вакцинации для предупреждения эпидемий и, особенно, пандемий [16, 29, 126, 317, 319].
Был предложен способ сочетанного парентерального введения препарата рекомбинантного IFN-y с вакциной ОрниФлю. Нами был выбран отечественный препарат рекомбинантного человеческого IFN-y - Ингарон, рекомендованный для лечения инфекционных, вирусных заболеваний, а также для профилактики и лечения гриппа, в том числе птичьего происхождения.