Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Лабораторная диагностика острого повреждения почек (обзор литературы) 13
1.1 Понятие острого повреждения почек, критерии диагностики 13
1.2 Эпидемиология острого повреждения почек 15
1.3 Хроническая болезнь почек и острое повреждение почек 17
1.4 Лабораторные маркеры острого повреждения почек 20
1.4.1 "Классические" маркеры острого повреждения почек 20
1.4.2 "Новейшие" маркеры острого повреждения почек 21
1.4.3 Микроскопия осадка мочи 33
Глава 2 Материалы и методы исследования 42
2.1 Общая характеристика групп больных 42
2.2 Лабораторные методы исследования 44
2.2.1 Определение концентрации креатинина в сыворотке крови 44
2.2.2 Общий анализ мочи с количественным подсчетом форменных элементов осадка мочи 44
2.2.3 Определение концентрации интерлейкина-18 в моче 45
2.2.4 Определение концентрации липокалина-2 47
2.3 Методы сбора и анализа данных 49
Глава 3 Результаты исследования и их обсуждение 51
3.1 Сравнение результатов подсчета гиалиновых цилиндров и клеток почечного эпителия при световой и фазово-контрастной микроскопии 51
3.2 Оценка динамики исследуемых параметров у пациентов до операции и после кардиохирургического вмешательства 58
3.3 Результаты ROC-анализа 66
Заключение 76
Выводы 82
Практические рекомендации 83
Список сокращений 85
Список литературы 86
- Хроническая болезнь почек и острое повреждение почек
- Микроскопия осадка мочи
- Сравнение результатов подсчета гиалиновых цилиндров и клеток почечного эпителия при световой и фазово-контрастной микроскопии
- Результаты ROC-анализа
Хроническая болезнь почек и острое повреждение почек
В последнее десятилетие произошел принципиальный пересмотр отношения к поражению почек: из сугубо нефрологической проблемы она стала общемедицинской [1, 8, 26, 28]. Это связано с разработкой концепции хронической болезни почек (ХБП), значительно расширившей представление о поражении почек и пониманием того, что ХБП служит предиктором развития значимых сердечно-сосудистых событий, существенно влияя на заболеваемость и смертность [15, 23]. Во всем мире отмечают рост распространенности ХБП вследствие: увеличения продолжительности жизни, нарастания заболеваемости сахарным диабетом (СД) и артериальной гипертензией (АГ) и др. [23].
Для постановки диагноза ХБП, независимо от этиологии, необходимо выявить один или несколько маркеров структурного поражения почек, либо снижение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) [8]. В рутинной клинической практике наибольшее распространение получила оценка СКФ по клиренсу креатинина. В настоящее время СКФ рассчитывают на основе ряда формул, опирающихся на концентрацию креатинина в крови и учитывающих ряд дополнительных составляющих, таких, как пол, возраст, расовая принадлежность, поверхность тела [26]. На многих сайтах в Интернете можно воспользоваться услугой для расчёта величины СКФ. Кроме того, существуют приложения для мобильных устройств.
В РФ основными факторами риска нарушения функции почек являются артериальная гипертензия и сахарный диабет [5]. В большинстве случаев ранние стадии ХБП (1–2-я стадии) характеризуются, как правило, бессимптомным течением, особенно при артериальной гипертензии (АГ), сахарном диабете (СД), ожирении, в связи, с чем не привлекают внимания ни пациентов, ни клиницистов. В то же время, маркеры ХБП (снижение СКФ и альбуминурия) были выявлены у 49,4% обследованных: СКФ ниже 60 мл/мин/1,73м2 – у 34,8% пациентов, альбуминурия более 30 мг/г – у 32,6% [8].
Почки являются мишенями многих патологических процессов. К перечню немодифицируемых факторов риска развития и прогрессирования ХБП относят: пожилой возраст, мужской пол, низкая масса тела при рождении, расовые и этнические особенности, отягощенный семейный анамнез по ХБП [1, 130].
По данным эпидемиологических исследований, дисфункция почек развивается у 20–40% больных СД при отсутствии других причин терминальной стадии болезни почек. Во многих крупных развитых странах мира, включая США, Германию и Японию, диабетическая нефропатия находится на первом месте среди показаний к диализу, и ее доля составляет 35–45% [26]. В РФ распространенность диабетической нефропатии при использовании в качестве критериев СКФ и альбуминурию, ХБП достигает 43% [15]. Наиболее ярко и агрессивно дисфункция почек проявляется при сочетании АГ и СД, классическим вариантом которого является метаболический синдром [11]. Развитие ХБП при метаболическом синдроме обусловлено ожирением, эффектами гормонов и цитокинов жировой ткани, инсулинорезистентностью и дислипидемией [22].
По данным официальной статистики Medicare (2017), в США больные ХБП в два раза чаще имеют сердечно-сосудистые заболевания по сравнению с лицами без ХБП (65% и 32% соответственно) [23]. Распространенность сердечной недостаточности возрастает с увеличением тяжести ХБП. Так, пациенты с 4-й и 5-й стадиями ХБП имеют сердечную недостаточность в 40% случаев [26].
В настоящее время говорят о «кардиоренальном синдроме» или «кардиоренальном континууме». Под этим термином понимают нарушения, которые развиваются в сердце в ответ на изменения в почках, а также ситуацию, когда патологические изменения сердечно-сосудистой системы становятся триггером почечных нарушений [21].
ОПП часто развивается у больных в критическом состоянии и ассоциируется с высокой летальностью [138].
Частота ОПП на фоне хронической болезни почек (ХБП) составляет 13%. ОПП в 5 раз чаще возникает у пожилых пациентов, чем у молодых. Исход зависит от этиологии и тяжести ОПП, характера основной и сопутствующей патологии, возраста больных и ряда других факторов [96].
Пациенты с ишемической болезнью сердца (ИБС) относятся к группе риска по развитию ОПП. При остром инфаркте миокарда (ОИМ) нередко отмечается снижение сердечного выброса. ОПП в данном случае обусловлено снижением СКФ вследствие неадекватной перфузии почек [26]. Пациенты, подвергающиеся оперативному вмешательству, относятся к группе высокого риска развития ОПП [31]. Наиболее выраженное падение СКФ характерно для пациентов с ИБС, страдающих СД, АГ, поражением сосудов различной этиологии. Операции на сердце в условиях искусственного кровообращения и КШ чреваты развитием гемолиза, гемоглобинурии и ОПП [94].
Микроскопия осадка мочи
В первой половине XIX века в результате достижений в сфере производства усовершенствованных моделей микроскопов, появилась возможность определить роль микроскопического анализа в диагностике заболеваний почек [47].
Одним из самых первых врачей, выполнивших микроскопию осадка мочи с подробным описанием его элементов, был врач больницы Charite в Париже А. Донне (Alfred Donne) [57]. Позднее французские врачи, П. Райе (Pierre Rayer) и Н. Вигла (Napoleon Vigla), оценили клиническое значение обнаружения различных элементов в осадке мочи. Они отметили, что при остром нефрите в моче встречаются эритроциты, клетки плоского эпителия, тогда как для нефротического синдрома, характерно наличие гиалиновых цилиндров, слизи, липидов, крови и кристаллов мочевой кислоты [68].
Таким образом, даже на ранних этапах при микроскопии мочи были выявлены изменения ее состава, которые до сих пор используются для дифференциальной диагностики отдельных заболеваний почек [7, 47].
Многие зарубежные исследователи полагают, что анализ мочи при высоком качестве его выполнения можно отнести к разряду «жидкостной биопсии» и успешно использовать его в диагностике заболеваний почек [122].
Ограничения классического подхода микроскопии осадка мочи Микроскопический метод изучения осадка мочи в его классическом варианте исполнения имеет ряд ограничений в качестве диагностического теста при заболеваниях почек вследствие значительного разброса данных, который может быть связан как с подготовкой образцов мочи на преаналитическом этапе, так и с использованием различных подходов к микроскопии осадка на аналитическом этапе [7, 93].
Существенное влияние на результаты анализа оказывает сбор, доставка и хранение образцов мочи на преаналитическом этапе, объем мочи, взятый для исследования, продолжительность и скорость центрифугирования, а также способ подсчёта элементов и подготовка персонала, проводящего анализ на аналитическом этапе [45].
В рутинной практике, как правило, руководствуются результатами полуколичественного способа выражения результатов в виде минимального/максимального или среднего количества клеток в поле зрения (п/зр). При его использовании необходимо учитывать, что поле зрения зависит от типа микроскопа, следовательно, количество элементов в п/зр. будет отличаться в разных микроскопах [44].
Кроме того, результаты микроскопии осадка мочи существенно зависят от способа подсчета организованных элементов осадка мочи и способа выражения результатов в количественной (кл/объём) или полуколичественной форме (п/зр). В соответствии с современными руководствами, последний по-прежнему рекомендуют использовать в повседневной практике ввиду простоты выполнения и низкой стоимости [93].
Традиционная световая микроскопия является простым и наиболее часто используемым способом, несмотря на относительно слабые возможности визуализации клеточных элементов, что затрудняет идентификацию некоторых элементов, встречающихся в осадке мочи.
Определённые трудности могут возникнуть при идентификации гиалиновых цилиндров и цилиндроидов, лейкоцитов и клеток эпителия почечных канальцев, эритроцитов, овоидных оксалатов и дрожжевых клеток [92].
В ряде зарубежных руководств по проведению анализа мочи отмечают недостаточную информативность анализа мочи при использовании световой микроскопии, даже при суправитальном окрашивании препарата, рекомендуя взамен использовать фазово-контрастную микроскопию (ФКМ) [93]. Использование фазово-контрастной микроскопии Принцип фазового контраста был открыт в 1934 году голландским физиком Ф. Цернике (Frits Zernike). Достоинства данного метода при проведении микроскопического исследования были быстро признаны, поскольку его использование обеспечивало более точную визуализацию структур по сравнению с предшественником – световой микроскопией [67].
Поскольку с помощью фазово-контрастной микроскопии формируется изображение прозрачных элементов с высокой контрастностью и степенью разрешения биологических структур, многие исследователи настаивают на том, что ее использование при изучении осадка мочи обеспечивает более высокую выявляемость таких структур как гиалиновые цилиндры, а соответственно и элементов, расположенных на поверхности цилиндра [38, 67].
Суправитальная окраска
Другим методом улучшения и облегчения дифференциации компонентов мочевого осадка при недоступности фазово-контрастной микроскопии является метод так называемой «суправитальной» окраски [18].
В рутинной работе чаще всего используют модификацию окраски Sternheimer, которая ранее использовалась для выявления так называемых «активных» лейкоцитов в осадке мочи [133].
Существуют компании-производители, выпускающие готовые красители, тем самым сводя процедуру окрашивания к смешиванию нескольких капель красителя с осадком мочи.
Использование данного метода позволяет облегчить дифференцировку между лейкоцитами и клетками почечного эпителия, а также улучшить визуализацию цилиндров [18].
Суправитальное окрашивание осадка мочи облегчает просмотр препарата, но требует не только соблюдения четкого соотношения между красителем и осадком, но и соблюдения времени экспозиции [19]. Кроме того, требуется предварительная проверка, а при необходимости, корректировка данных параметров при использовании новой партии красителей [44].
Согласно рекомендациям, принятым в странах ЕС, при проведении световой микроскопии суправитальное окрашивание является обязательной процедурой для надлежащего дифференцирования элементов осадка [93].
Решение проблемы различения клеток в осадке мочи лежит в рациональном использовании различных подходов суправитального окрашивания и при возможности применения фазово-контрастной микроскопии [44].
Стандартизация этапов анализа осадка мочи
Не вызывает сомнения, что техника приготовления препарата и навыки микроскопии осадка мочи должны быть тщательно отработаны, во избежание возникновения ошибок в распределении элементов в препарате и их идентификации [97].
Особого внимания заслуживают: строгое соблюдение определенного промежутка времени от момента приготовления препарата до осаждения клеток и собственно микроскопического анализа, просмотр достаточного количества полей зрения препарата, особенно препарата, приготовленного из осадка с низким содержанием элементов [51].
Необходимость направленной подготовки специалиста, занимающегося микроскопией осадка мочи
Известный итальянский нефролог G.B. Fogazzi настаивает на проведении обучения навыкам микроскопии осадка мочи у пациентов с ОПП как клинициста-нефролога, так и лабораторного специалиста, поскольку при сравнении результатов сотрудника лаборатории и подготовленного нефролога часто обнаруживают существенные расхождения в результатах [67]. Сотрудники лаборатории чаще допускали неточности при выявлении таких важных составляющих осадка мочи, как клеток канальцевого эпителия и разных типов цилиндров, которые были правильно идентифицированы нефрологом, специально подготовленным и владеющим микроскопией [137].
Кроме того, было установлено, что при идентификации клеток плоского эпителия и гиалиновых цилиндров возникает меньше трудностей, чем при выявлении клеток переходного эпителия и жировых цилиндров [122].
При изучении образцов мочи пациентов с доказанным ОПП нефролог правильно оценил клеточный состав мочи у больных с ОПП в 92% случаев, сотрудник лаборатории только в 19% случаев. При этом нефролог сообщил о более высоком количестве клеток почечного эпителия, зернистых цилиндров, гиалиновых и эпителиальных цилиндров [137].
Приведенные данные доказывают необходимость проведения направленной подготовки исследователей для проведения микроскопии осадка мочи у пациентов с ОПП, поскольку в осадке могут встречаться измененные клетки почечного эпителия, различные типы цилиндров (смешанные, в частности, зернисто-гиалиновые), с которыми не подготовленный специально работник не сталкивался в рутинной лаборатории [36].
Сравнение результатов подсчета гиалиновых цилиндров и клеток почечного эпителия при световой и фазово-контрастной микроскопии
Подготовка образцов мочи, получение осадка для световой микроскопии, подсчет элементов являются в целом, рутинными процедурами для выявления изменений в моче при различных заболеваниях. Это, как правило, не является существенной проблемой в рутинной работе в клинико-диагностических лабораториях. В ряде зарубежных монографий и публикаций авторы отдают предпочтение фазово-контрастной микроскопии при изучении осадка мочи нефрологических пациентов, указывая на ее более высокую чувствительность [38, 44, 67]. В большинстве отечественных лабораторий сотрудники недостаточно знакомы с данным методом, в связи с чем он не получил широкого распространения, и остается практически невостребованным, несмотря на продолжающийся выпуск фазово-контрастного устройства ФАТЕК М6-7 (АО ЛОМО) для микроскопов МИКМЕД 6 вариант 7.
В связи c этим нами была проведена серия исследований, направленных на сравнение результатов подсчета организованных элементов осадка мочи с применением световой микроскопии и фазово-контрастной микроскопии.
С этой целью подсчет элементов в камере Фукс-Розенталя проводили в режиме световой микроскопии, затем в тех же квадратах их подсчитывали с использованием фазово-контрастной микроскопии, путем смены объектива поворотом револьверного держателя. Концентрацию в препарате элементов осадка мочи выражали в количестве элементов в 1 мкл мочи.
Микроскопический анализ проводился одним оператором (Птицына А.И.) с использованием микроскопа «Leica DM 4000 B» («Leica Microsystems GmbH», Германия), объектив 10 (40), окуляр 10.
Гиалиновые цилиндры
По результатам подсчета гиалиновых цилиндров в моче при использовании световой и фазово-контрастной микроскопии было выявлено, что их концентрация была достоверно ниже при проведении метода с использованием световой микроскопии (Ме 0,3 [0; 0,09]), чем при фазово-контрастной (Me 0,8 [0,1; 0,22]) (p=0,003). Результаты представлены на рисунке 3.1.
На рис. 3.2–3.5 видны преимущества фазово-контрастной микроскопии по сравнению со световой при подсчете гиалиновых цилиндров и сводятся к следующему: при использовании фазового контраста наблюдаются четкие контуры, насыщенность объектов по сравнению с размытостью контуров цилиндра на общем фоне. Микроскопия в режиме фазового контраста обладает достоинствами по сравнению со световой микроскопией (рис. 3.2– 3.5).
Клетки почечного эпителия
Ввиду того, что мелкие прозрачные включения клеток, невидимые в светлом поле, дают контрастную интерференцию с фоном и становятся видимыми (рис. 3.7, 3.8), облегчается процесс их идентификации было выявлено, что концентрация клеток почечного эпителия в моче была достоверно ниже при использование световой микроскопии (Ме 0,1 [0,03; 0,32]) по сравнению с фазово-контрастной (Me 0,2 [0,08; 0,47]) (p=0,005). Результаты представлены на рисунке 3.6.
Таким образом, в предварительной серии экспериментов нами было установлено:
1. использование фазово-контрастной микроскопии существенно облегчает визуализацию гиалиновых цилиндров и клеток почечного эпителия, что улучшает их идентификацию;
2. подсчет гиалиновых цилиндров и клеток почечного эпителия в камере Фукс-Розенталя дает возможность количественно оценить их наличие и провести в дальнейшем статистическую обработку.
Результаты ROC-анализа
Анализ диагностической информативности маркеров был проведен с использованием ROC-анализа. Оценивали чувствительность и специфичность тестов, площадь под кривой (AUC) и отношение правдоподобий (LR).
Гиалиновые цилиндры
В 1-й группе через 2 часа диагностическая чувствительность и специфичность гиалиновых цилиндров составила 95% и 85% соответственно. Отношение правдоподобий для положительных результатов составило 6,67 (LR+), что свидетельствует об «удовлетворительной» способности распознавать наличие ОПП. Отношение правдоподобий для отрицательных результатов составило менее 0,01 (LR), что характеризует его как «чрезвычайно высокую» способность распознавать отсутствие ОПП. Максимальная диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность теста обнаруживается при отрезном значении (cut-off) выше 1,7. Значение площади под кривой для теста составила 0,940 (Таблица 3.1).
Через 4 часа в 1-й группе после операции диагностическая чувствительность и специфичность составила 98% и 95% соответственно. Отношение правдоподобий для положительных результатов составило 20 (LR+), что свидетельствует о «хорошей» способности распознавать наличие ОПП.
Отношение правдоподобий для отрицательных результатов составило менее 0,01 (LR), что характеризует его как «чрезвычайно высокую» способность распознавать отсутствие ОПП. Значение площади под кривой составило 0,950. Максимальная диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность теста обнаруживается при отрезном значении больше 3. В 1-й группе через 24 часа диагностическая чувствительность теста составила 90%, диагностическая специфичность 90%. Отношение правдоподобий для положительных результатов составило 10 (LR+), что свидетельствует о «хорошей» способности распознавать наличие ОПП. Отношение правдоподобий для отрицательных результатов составило меньше 0,01 (LR), что характеризует его как «чрезвычайно высокую» способность распознавать отсутствие ОПП. Значение площади под кривой составил 0,930. Максимальная диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность теста обнаруживается при отрезном значении больше 2,2 (таблица 3.1).
Во 2-й группе через 2 часа после операции диагностическая чувствительность гиалиновых цилиндров составила 64%, специфичность-73%. Значение площади под кривой (AUC) составило 0,640. Отношение правдоподобий для положительных результатов составило 2,36, что свидетельствует «неудовлетворительной» способности распознать наличие ОПП. Отношение правдоподобий для отрицательных результатов составило 0,5, что говорит о «неудовлетворительной» способности отсутствие ОПП.
Через 4 часа после операции диагностическая чувствительность составила 72%, диагностическая специфичность – 69%. Значение площади под кривой 0,682. Отношение правдоподобий для положительных результатов (LR+) составило 2,25, что соответствует «неудовлетворительной» способности распознавать наличие ОПП. Отношение правдоподобий для отрицательных результатов составило 0,5, что говорит о «неудовлетворительной» способности распознавать отсутствие ОПП.
Клетки почечного эпителия
В 1-й группе через 2 часа диагностическая чувствительность для клеток почечного эпителия составила 92%, диагностическая специфичность 65%. Отношение правдоподобий для положительных результатов составило 2,86 (LR+), что свидетельствует об «удовлетворительной» способности теста распознавать наличие ОПП. Отношение правдоподобий для отрицательных результатов составило менее 0,01 (LR), что характеризует его как «чрезвычайно высокую» способность распознавать отсутствие ОПП. Максимальная диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность теста обнаруживается при отрезном значении выше 0,06. Значение площади под кривой (AUC) составила 0,860.
Через 4 часа в 1-й группе после операции диагностическая чувствительность составила 95%, диагностическая специфичность 75%. Отношение правдоподобий для положительных результатов составило 4 (LR+), что свидетельствует о «хорошей» способности распознавать наличие ОПП.
Отношение правдоподобий для отрицательных результатов составило менее 0,01 (LR), что характеризует его как «чрезвычайно высокую» способность распознавать отсутствие ОПП. Значение площади под кривой (AUC) составило 0,930. Максимальная диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность теста обнаруживается при отрезном значении выше 0,09.
Через 24 часа диагностическая чувствительность теста составила 98%, диагностическая специфичность 95%. Отношение правдоподобий для положительных результатов (LR+) составило 20, что свидетельствует о «хорошей» способности теста распознавать наличие ОПП. Отношение правдоподобий для отрицательных результатов (LR) составило менее 0,01, что характеризует его как «чрезвычайно высокую» способность распознавать отсутствие ОПП. Значение площади под кривой составило 0,985. Максимальная диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность теста обнаруживается при отрезном значении выше 0,24 (таблица 3.2).