Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Структурная и функциональная характеристика грелина 16
1.2. Роль грелина в регуляции репродуктивной системы 26
1.3. Роль грелина в регуляции клеток иммунной системы 27
1.4.Характеристика основных типов дендритных клеток и регуляторных лимфоцитов 30
1.5.Механизмы, определяющие формирование иммунной толерантности при беременности .38
Глава 2. Материалы и методы 41
2.1. Методология и методы исследования .41
2.2. Объекты исследования .45
2.3. Биологически активные вещества 45
2.4. Получение мононуклеарных клеток периферической крови 45
2.5. Получение клеток тимуса 46
2.6. Генерация дендритных клеток из моноцитов периферической крови .46
2.7. Выделение дендритных клеток из тимуса 47
2.8. Иммуномагнитная сепарация Т- и В-лимфоцитов 48
2.9. Изучение роли грелина в регуляции формирования миелоидных и плазмоцитоидных дендритных клеток тимуса 49
2.10. Оценка роли грелина в регуляции формирования дендритных клеток, генерируемых из моноцитов периферической крови 50
2.11. Определение роли грелина в индукции регуляторных подтипов В лимфоцитов из CD19+CD25+-клеток 50
2.12. Изучение роли грелина в регуляции экспрессии иммуносупрессорных молекул на CD4+CD25+ Т-лимфоцитах .52
2.13. Экспериментальная модель для оценки роли миелоидных и плазмоцитоидных дендритных клеток в регуляции дифференцировки тимоцитов .53
2.14. Определение роли дендритных клеток в индукции Treg и Th17 из аллогенных лимфоцитов 54
2.15. Экспериментальные подходы для изучения роли дендритных клеток в регуляции толерогенного потенциала CD19+CD25+ В-лимфоцитов 55
2.16. Экспериментальная модель для определения роли CD19+CD25+ В лимфоцитов в индукции формирования Treg и Th17 56
2.17. Определение фенотипа и отдельных поверхностных маркеров клеток периферической крови и тимуса 56
2.18. Оценка продукции цитокинов в супернатантах клеточных культур 63
2.19. Статистический анализ 64
Глава 3. Результаты собственных исследований 65
3.1. Влияние грелина на процессы индукции регуляторных Т- и В-лимфоцитов периферической крови .65
3.1.1. Роль грелина в регуляции функциональной активности CD4+CD25+-клеток 66
3.1.2. Влияние грелина на индукцию толерогенного фенотипа CD19+CD25+-клеток 69
3.1.3. Роль грелина в регуляции количества Treg и Th17 в присутствии CD19+CD25+-клеток 72
3.2. Значение грелина в регуляции созревания дендритных клеток периферической крови и их функциональной активности 74
3.2.1. Влияние грелина на созревание дендритных клеток, генерируемых из моноцитов и продукцию цитокинов 75
3.2.2 Роль прединкубированных с грелином дендритных клеток в регуляции баланса Treg/ Th17 и продукции цитокинов 80
3.2.3. Роль прединкубированных с грелином дендритных клеток в индукции толерогенного потенциала CD19+CD25+ В-лимфоцитов 83
3.3. Влияние грелина на формирование субпопуляций дендритных клеток и Т-лимфоцитов тимуса и их функциональной активности 86
3.3.1. Значение грелина в регуляции фенотипа миелоидных и плазмоцитоидных дендритных клеток тимуса 87
3.3.2. Роль прединкубированных с грелином миелоидных и плазмоцитоидных дендритных клеток тимуса в индукции формирования Treg, Th17 и NKT-клеток 89
Заключение 93
Выводы .101
Практические рекомендации .103
Список сокращений и используемых обозначений .104
Список литературы .108
- Структурная и функциональная характеристика грелина
- Определение фенотипа и отдельных поверхностных маркеров клеток периферической крови и тимуса
- Влияние грелина на созревание дендритных клеток, генерируемых из моноцитов и продукцию цитокинов
- Роль прединкубированных с грелином миелоидных и плазмоцитоидных дендритных клеток тимуса в индукции формирования Treg, Th17 и NKT-клеток
Структурная и функциональная характеристика грелина
Приблизительно 60-70% циркулирующего грелина секретируется энтероэндокринными P/D1-клетками слизистой оболочки дна желудка, а наибольшая часть оставшегося производится клетками тощей, тонкой и двенадцатиперстной кишок: в общей сложности ЖКТ синтезирует около 75-80% циркулирующего грелина [60, 120, 181]. В небольших количествах грелин вырабатывается в других органах и тканях, таких как поджелудочная железа, печень, плацента, яички, головной мозг, гипофиз, гипоталамус, легкие, почки, щитовидная железа, лимфоидные органы и клетки иммунной системы [23, 93, 120, 140; 125, 200, 202]. Кроме этого, в аркуатных ядрах гипоталамуса, которые являются важнейшей структурой в реализации эффектов грелина, также обнаруживается небольшое число грелин-продуцирующих нейронов [54, 82, 174]. У всех позвоночных грелин закодирован в ghrl гене. У человека ген GHRL находится на правом плече третьей хромосомы в регионе 3p26-p25. GHRL имеет длину 511 пар оснований (п.о.), содержит 5 экзонов и 4 интрона [172-173]. Механизм образования молекулы грелина представлен на рисунке 1.2. GHRL несет 2 транскрипционных старт-сайта (зрелая молекула грелина кодируется экзонами 1 и 2), что приводит к экспрессии двух различных транскриптов: грелина и обестатина [114, 188]. Образование грелина происходит в несколько этапов: на первом транслируется последовательность для препро-гормона (препрогрелина), состоящего из 117 аминокислот (ак). Препрогрелин содержит сигнальный пептид (23 ак) и прогормон (прогрелин, 94 ак) [123, 126, 216]. На втором этапе прогрелин претерпевает ряд последовательных стадий, в ходе которых происходит его модификация – сначала в энтнроэндокринных клетках происходит процесс ограниченного протеолиза (протеазой PC1/3 в позиции Arg28/Ala29) с образованием N-концевой молекулы грелина [121, 220], а затем, при участии фермента грелин-О-ацилтрансферазы (ГОАТ; англ. Ghrelin O-acyltransferase, GOAT), катализируется связь одного n-октаноил радикала [94, 131, 216], что приводит образованию ацилированного грелина, состоящего из 28 ак (с Arg на С-конце) и содержащего n-октановый сложный эфир на 3 сериновом остатке (Ser3) [101] с молекулярной массой 3,314 кДа. Кроме того, из препрогрелина в результате альтернативного сплайсинга может образовываться деацилгрелин, состоящий из 27 ак (с Pro на С-конце) [60, 103] и обестатин (23 ак) [220]. Механизм образования ацилированной и деацилированной изоформ грелина представлен на рисунке 1.3.
Обе существующие изоформы грелина имеют широкий спектр эффектов и играют фундаментальную роль при различных физиологических процессах в организме млекопитающих, хотя в некоторых случаях могут перекрывать или оказывать противоположные друг другу эффекты [180], а биологические свойства ацилгрелина, по всей видимости, определяются именно уникальной посттрансляционной модификацией [102], благодаря которой становится возможным его взаимодействие со своим основным рецептором (GHS-R1a) [60, 79, 120, 121, 202]
Первый сиротский (орфанный) рецептор для молекул, стимулирующих периодическую секрецию ГР (GHSs) в гипофизе и гипоталамусе, был открыт в 1996 году, и получил название – GHS-R [104]. Затем в 1999 году Kojima M. с коллегами обнаружил эндогенный лиганд для этого рецептора – пептидный гормон грелин [120].
Рецептор грелина относится к суперсемейству рецепторов, сопряженных с G-белком (англ. G-protein coupled receptors, GPCRs). GPCRs вовлечены в распознавание и трансдукцию разнообразных сигналов, таких как: свет, ионы Ca2+, ароматических веществ, и, небольших молекул, включая остатки аминокислот, нуклеотиды, пептиды, а также белки. Существует несколько механизмов, которые позволяют различным лигандам взаимодействующим с GPCRs активировать ядро домена, индуцируя изменение его конформации [104].
Рецепторы семейства GPCRs контролируют активность ферментов, ионных каналов и транспортных везикул посредством катализа ГДФ до ГТФ на гетеродимерных G--белках [37, 209]. Существуют 5 семейств GPCRs, при этом некоторые семейства GPCRs содержат по несколько подтипов. Представители разных семейств GPCRs имеют общий план строения их центральной части – трансмембранных спиралей [37]. Рецепторы данного типа начинаются с внеклеточного N-концевого домена и заканчиваются внутриклеточным С-концевым доменом [25].
На сегодняшний день известны две изоформы рецептора грелина – GHS-R типа 1a (GHS-R1a) и GHS-R типа 1b (GHS-R1b), которые экспрессируются в виде сплайс-вариантов [104] и широко представлены в различных органах и тканях [218]. Строение GHS-R1a и GHS-R1b схематично представлено на рисунке 1.4. GHS-R1a состоит из 366 ак и имеет молекулярную массу 41 кДа. GHS-R1a содержит 7 трансмембранных -спиральных гидрофобных домена, соединенных 3-мя внутриклеточными и 3-мя внеклеточными петлями [25]. GHS-R1a связывает лиганд, в полости, формируемой III-VI трансмембранными доменами [37]. GHS-R1a имеет конститутивную активность [104], кроме того, большинство изученных эффектов грелина осуществляется при взаимодействии именно с этим рецептором [50].
Другой рецептор грелина – GHS-R1b состоит из 289 ак, и активируется, преимущественно, короткими пептидами, которые взаимодействуют с внеклеточными петлями и N-концевым доменом [196] (рисунок 1.4.). В состав GHS-R1b входит 5 трансмембранных доменов, его мРНК имеет широкое представление в различных тканях, но его физиологическая роль в организме изучена недостаточно [125, 202].
GHS-R1a совместно с GHS-R1b могут образовывать гетеродимеры, что, предположительно, позволяет им действовать как доминантно-негативной мутаген полнометражного рецептора грелина [130].
В периферических тканях рецепторы грелина представлены в желудке, тонком кишечнике, поджелудочной железе, а также в легких, почках и сердце. В ЦНС рецепторы грелина представлены в гипоталамических структурах (аркуатных и вентромедиальных ядрах), в гиппокампе, передней доле гипофиза, черной субстанции, ядрах медиального шва. Самым важным, в контексте данного исследования, является присутствие рецепторов к грелину на клетках иммунной системы: моноцитах, макрофагах, дендритных клетках, Т-, В-, и NK- клетках [98, 125, 202, 208].
Физиологические эффекты грелина
Широкое представление рецепторов грелина в организме, говорит о способности данного гормона оказывать на организм разнообразные воздействия. Как уже упоминалось ранее, основная роль грелина – регуляция энергетического гомеостаза и стимуляция аппетита [144, 202]. Также грелин играет важную роль в регуляции функций пищеварительной, сердечно-сосудистой, репродуктивной, нервной и иммунной систем [126, 202, 189-193, 200], а данные о существенной экспрессии гена грелина и мРНК GHS-R1a в эмбриональной поджелудочной железе и легких свидетельствует о важной роли грелина в клеточном развитии [50].
Определение фенотипа и отдельных поверхностных маркеров клеток периферической крови и тимуса
Определение экспрессии исследуемых молекул проводили на проточном цитометре «FACS Calibur» (Becton Dickinson, США) и «CytoFlex S» (Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител. Для контроля неспецифического связывания использовали соответствующие негативные и изотипические контроли. При анализе минорных субпопуляций учитывалось не менее 10000 событий, при исследовании остальных типов клеток учитывалось от 20000-100000 событий. Лимфоцитарный и моноцитарный гейты определяли по параметрам прямого и бокового светорассеивания (рисунок 2.2.). Пример цитофлуориметрического анализа выделенных методом иммуномагнитной сепарации клеток по параметрам прямого (FSC-H) и бокового (SSC-H) светорассеивания представлен на рисунке 2.3.
Количество Treg (Т-FOXP3 подтипа) определяли как процент CD4+-клеток в гейте лимфоцитов, экспрессирующих CD25 и транскрипционный фактор FOXP3 (рисунок 2.4.) (Human CD4 FITC, сlone 11830, «R&D», США либо Human CD4 PE, colne RPA4, «BioLegend», США; Human CD25 PE, clone 24212, «R&D», США; Anti-Human FoxP3 PerCy5, clone PGH101, «eBioscience»). Время инкубации для определения влияния гормона в регуляции количества Treg составляло 3 сут, на основании анализа литературных данных. В тимусе количество CD4+ клеток экспрессирующих CD25 составляет 5-10% от общего количества тимоцитов Известно, что активация клетки через СD4 запускает экспрессию большого числа генов, самыми важными из которых являются активаторы продукции IL-2 и его рецептора IL-2R, обеспечивающих поддержание аутотолерантности [168, 169]. В периферической крови экспрессия CD25 отличает Т-FOXP3-клетки от активированных Т-лимфоцитов, несущих меньшее число IL-2R [214]. Максимум экспрессии -цепи IL-2R (CD25) приходится на 2-3 сутки, и продолжается до 5 суток [43, 74]. Кроме того, идентификация Т-FOXP3 подтипа Treg основана на выделении CD4+CD25 Т-лимфоцитов экспрессирующих транскрипционный фактор FOXP3 (часть белка скурфина, содержащего 4 домена, из которых С-концевой-forkhead-домен – FOXP3 – определяет функционирование данного белка в качестве транскрипционного фактора) [80]. Приобретение супрессорных свойств Т-FOXP3 связывают именно с экспрессией гена FOXP3, т.к. мутации этих генов сопровождаются у человека развитием аутоиммунной агрессии, гиперпродукцией провоспалительных цитокинов и общей дисрегуляцией иммунной системы [76, 80, 100, 139].
Количество Th17 определяли как процент CD4+-клеток в гейте лимфоцитов, экспрессирующих транскрипционный фактор ROR-С и внутриклеточный IL-17A (Human CD4 FITC, сlone 11830, «R&D», США либо Human CD4 PE, colne RPA4, «BioLegend», США; IL-17A FITC BL168, «BioLegend», США; Anti-human/mouse ROR/RORc2 PerCP, clone 600380, «R&D», США) (рисунок 2.4.).
Количество iNKT-клеток оценивали как процент CD3hl клеток, экспрессирующих Va24Jal8 TCR [31, 129] в гейте лимфоцитов (Anti-Human CD3 РЕ-Су5, clone UCHT1, «eBioscience», США; Anti-Human Va24Jal8 TCR РЕ, clone 6B11, «eBioscience», США)
При оценке влияния грелина в регуляции экспрессии иммуносупрессорных молекул на CD4+CD25+-клетках, выделенных методом иммуномагнитной сепарации, после 72 ч инкубации с гормоном, оценивали экспрессию CTLA-4, GITR и GARP (Anti-Human CD152 (CTLA-4) PE, clone 14D3, «eBioscience», США; Anti-Human CD357 (GITR) PE, clone 621, «BioLegend», США; Anti-Human GARP PE, clone G14D9, «eBioscience», США) (рисунок 2.5.).
Для определения роли грелина в процессах индукции регуляторных подтипов В-лимфоцитов, CD19+ CD25+-клетки сепарировали иммуномагнитным способом и после 72 ч инкубации с грелином, оценивали экспрессию транскрипционного фактора FOXP3 и внутриклеточного IL-10, а также CD86 и CD274 (PD-L1) (Anti-Human CD19 FITC, clone CatNFAB486F, «R&D», США; Anti-Human CD25 PE, clone BC96, «eBioscience», США; Anti-Human IL-10 AlexaFluor 488, clone JES3-9D7, «eBioscience», США; Mouse Anti-Human FoxP3 PerCP Cy5.5, clone 236A/Е7, «BD Pharmingen», США; Anti-Human CD86 (B7-2) PE, clone IT2.2, «eBioscience», США; Anti-Human CD274 (B7-H1) PE, clone MIH1, «eBioscience», США) (рисунок 2.6.) [22, 117].
Оценку роли грелина в регуляции созревания ДК изучали по окончании 5-и суточной инкубации моноцитов периферической крови в присутствии факторов роста и грелина. В моноцитарном гейте определяли экспрессию моноцитарного маркера CD14, и маркеров зрелых ДК – HLA-DR, CD86 и CD83 (Anti-Human CD14 FITC, clone 61D3, «eBioscience», США; Anti-Human HLA-DR PE, clone L243, «Bioscience», США; Anti-Human CD83 PE, clone HB15e, «eBioscience», США; Anti-Human CD86 (B7-2) PE, clone IT2.2, «eBioscience», США) (рисунок 2.7).
Оценку роли грелина в регуляции количества мДК и пДК тимуса проводили после 72 ч инкубации клеток тимуса с гормоном. Число мДК оценивали как процент клеток экспрессирующих молекулы CD11c, количество пДК определяли как процент клеток несущих CD303 (Anti-Human CD11с FITC, clone 3.9, «BioLegend», США; Anti-Human CD303 (BDCA-2) FITC, clone 201A, «BioLegend», США). Пример оценки фенотипа мДК и пДК тимуса методом проточной цитометрии представлен на рисунке 2.8.
Влияние грелина на созревание дендритных клеток, генерируемых из моноцитов и продукцию цитокинов
Для изучения роли грелина, в концентрации отражающей его уровень в периферической крови при беременности, в регуляции созревания ДК, к моноцитам в 0-е и 3-и сутки совместно с факторами дифференцировки ДК (GM CSF и IL-4) вносили грелин в концентрации 1,25 нг/мл, что соответствует его уровню в периферической крови в I-II триместре беременности. Использование моноцитов для генерации ДК обусловлено тем, что незрелые ДК составляют примерно 0,5% от лейкоцитов периферической крови, а зрелые ДК, как правило, имеют тканевую локализацию, поэтому ДК генерировали in vitro из моноцитов периферической крови, численность которых заметно выше и составляет от 3 до 11% от общего количества лейкоцитов, с использованием стандартной методики [14]. Помимо факторов дифференцировки ДК, в культуру моноцитов на 3-и сутки вносили ЛПС E.coli для индукции TLR-опосредованного дозревания ДК. По окончании 5 суток инкубации в одной части проб проводили анализ фенотипа клеток с использованием моноклональных антител к CD14, CD83, CD86, HLA DR, характеризующих степень зрелости ДК, методом проточной цитофлуориметрии. В супернатантах культур по продукции цитокинов IL-12(р70), IL-12(р40), IL-10 и TGF-1оценивали функциональную активность ДК. К другой части проб на 5-е сутки вносили аллогенные CD4+-лимфоциты, для оценки способности прединкубированных с грелином ДК к индукции Treg (результаты представлены в разделе 4.5.)
Поскольку ДК получали путем генерации из моноцитов, в первую очередь оценивали эффективность используемой модели. Установлено, что моноциты, культивируемые без факторов дифференцировки ДК – IL-4 и GM-CSF, не смотря на полученный сигнал через TLR, характеризуются высокой экспрессией моноцитарного маркера CD14, экспрессия которого должна ослабевать на созревающих и зрелых ДК [14] (Моноциты – 65,7 ± 6,4; Контроль – 35,4 ± 14,6, p 0,05 по парному t-критерию критерию Стьюдента). Вместе с этим, моноциты, генерируемые в отсутствии факторов дифференцировки ДК, отличались низким уровнем экспрессии маркеров зрелых ДК – CD83 и CD86. При добавлении в культуры моноцитов IL-4, GM-CSF происходит утрата молекулы CD14, и повышается уровень экспрессии маркеров зрелости ДК CD83 и CD86 (CD83: Моноциты – 7,6 ± 0,1; Контроль – 37,5 ± 19,9, p 0,05 по парному t-критерию критерию Стьюдента; CD86: Моноциты – 29,1 ± 1,9; Контроль – 76,5 ± 11,9, p 0,05 по парному t-критерию критерию Стьюдента), но не оказывает эффектов на экспрессию HLA-DR. В целом, фенотип клеток, полученных в присутствии факторов роста ДК, практически соответствует фенотипу зрелых ДК и свидетельствует об успешной генерации ДК из моноцитов периферической крови (рисунок 3.5.). При оценке влияния грелина в регуляции созревания ДК установлено, что гормон не влияет на данный процесс (рисунок 3.6.)
Поскольку спектр вырабатываемых ДК цитокинов определяет направленность дифференцировки Т-клеток и развитие иммунного ответа в целом, важно было оценить влияние грелина на продукцию ключевых поляризующих цитокинов ДК - IL-12(р70), IL-12(p40), IL-10 и TGF-1.
При оценке грелина на продукцию провоспалительных цитокинов ДК, было установлено, что грелин, в концентрации 1,25 нг/мл, соответствующей его уровню в I-II триместре беременности, не влияет на IL-12(р70), но снижает количество IL-12 (р40) в супернатантах ДК. При оценке продукции толерогенных и противовоспалительных цитокинов, отмечается статистически значимое повышение уровня TGF-D1 и двукратное увеличение IL-10 в супернатантах культур ДК (данные представлены на рисунке 3.7.)
IL-12 - плюрипотентный активатор клеточного звена иммунитета, который образуется в ответ на антигенную стимуляцию, и активирует формирование и поддерживает Th1 и цитотоксический иммунный ответ. В то же время IL-12 может стимулировать В-лимфоциты к выработке аутоантител и снижать продукцию IgE. IL-12(p40) - общая субъединица для IL-12 и IL-23 - является продуктом активированных ДК и обладает перекрестным с IL-12 действием, стимулируя пролиферацию NK-клеток, цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), а также IL-17-продуцирующих Т-хелперов (ТЫ7) [141, 221]. Известно, что IL-12 (р40) способствует поляризации наивных CD4+ Т-лимфоцитов по Th1-типу и стимуляции NKT-клеток [67, 141]. Таким образом, снижение уровня IL-12 (р40) под действием грелина будет способствовать подавлению ТЫ/ТЫ7 иммунного ответа, а также снижению активности цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) и NKT-клеток, способствуя, тем самым, сохранению беременности.
Представители семейства TGF- - плюрипотентные цитокины, обладающие как про-, так и противовоспалительной активностью [124]. TGF-1 рассматривается как важнейший фактор предотвращения системной аутоагрессии. Он может стимулировать как формирование Treg, так и в сочетании с IL-6 - ТЫ7 [124]. Исследования, проведенные в 2017-2018 гг показали, что при беременности (I-II триместр), у женщин с повторяющимися спонтанными абортами неясного генеза, значительно понижены уровни IL-10 и TGF-C1 и повышены уровни IL-2, IL-6, IL-23, IFND и TNFD в децидуальной оболочке [157, 213]. Таким образом, повышение уровня IL-10 и TGF-D1 на 30-40% в указанные сроки играет решающую роль благоприятного исхода беременности, способствуя развитию Th2/Treg иммунного ответа, который блокирует ТЫ/ТЫ7-иммунный ответ и создает условия иммунной толерантности по отношению к фетоплацентарной структуре. IL-10 - цитокин с многочисленными плейотропными эффектами - противоспалительными и регуляторными. IL-10 продуцируется преимущественно клетками моноцитарного ряда, Breg и в меньшей степени тучными клетками, Тп2-клетками и Treg. Как уже упоминалось ранее, IL-10 способствует формированию T-FOXP3 и Tr1 подтипам Treg [113, 148]
Таким образом, снижение уровня IL-12 (р40) в совокупности с повышением уровней TGF- и IL-10 под действием грелина будет в способствовать сохранению беременности и может свидетельствовать о значимой роли грелина в поддержании беременности.
Вывод по разделу 3.2.1. – грелин, в концентрации 1,25 нг/мл, соответствующей его уровню в I-II триместре беременности, не оказывает влияния на регуляцию дифференцировки и созревания ДК, оцениваемую по экспрессии молекул CD14, HLA-DR, CD83 и CD86, но контролирует их функциональную активность ДК, снижая продукцию IL-12(p40), и повышая продукцию TGF- и IL-10 ДК.
Роль прединкубированных с грелином миелоидных и плазмоцитоидных дендритных клеток тимуса в индукции формирования Treg, Th17 и NKT-клеток
В продолжении исследования влияния грелина в регуляции активности мДК и пДК тимуса, данные типы ДК выделяли методом иммуномагнитной сепарации (методика описана в разделе 2.7.), инкубировали с грелином 24 ч, а затем к мДК и пДК вносили аутологичные тимоциты и инкубировали совместно еще 72 ч, для оценки роли прединкубированных с грелином мДК и пДК в регуляции тимического этапа дифференцировки T-FOXP3, Th17 и iNKT-клеток (экспериментальная модель описана в разделе 2.13.). Грелин вносили к ДК в 0-е сутки в концентрации 1,25 нг/мл, что соответствует его уровню в периферической крови в I-II триместре беременности. По окончании совместного культивирования оценивали количество T-FOXP3, ТЫ7 и iNKT методом проточной цитометрии.
Установлено, что прединкубированные с грелином мДК и пДК не влияют на дифференцировку T-FOXP3 (CD4+CD25+FOXP3+) и TЫ7 (CD4+IL-17A+ROR-С+) в культуре клеток тимуса, но разнонаправленно регулируют формирование субпопуляции iNKT-клеток (CD3hlVD24JD18+), достоверно увеличивая их количество в культуре с мДК, и уменьшая их количество при совместном культивировании с пДК. Результаты эксперимента представлены на рисунках 3.12 и 3.13, соответственно.
NKT-клетки - уникальная популяция аутореактивных Т-лимфоцитов, распознающих гликолипидный антиген, в составе молекул МНС-1-подобных молекул CD Id. NKT-клетки принимают участие защите организма от внутриклеточных патогенов и регуляции иммунного ответа, при этом NKT-клетки быстро реагируют на активацию продукцией цитокинов, которые способны как усиливать, так и подавлять иммунный ответ. Поэтому NKT-клетки, как и Treg, рассматриваются в качестве объекта воздействия при аутоиммунных и онкологических заболеваниях [85, 128]. Развитие NKT-клеток в тимусе имеет свои особенности: более 75% NKT-клеток тимуса имеют зрелый NK1.1+ фенотип, экспрессируя TCR совместно с маркером зрелых NK - CD161, но парадоксально, что на периферию мигрируют в основном незрелые NKT-клетки, где они как в тимусе созревают CD Id-зависимым образом [32, 138, 152].
Количество NKT-клеток в периферической крови и децидуальной оболочке играет существенную роль для нормального протекания беременности. Так, значительное увеличение числа классических NKT-клеток, сопровождающееся экспрессией IFN, при одновременном снижении экспрессии IL-4 и IL-10, наблюдаемое у пациентов с периодическими спонтанными абортами неясного генеза [219]. Это связано с тем, что клетки ворсинчатого и экстраворсинчатого трофобласта могут экспрессировать молекулы CD Id [40]. Другая группа исследователей показала, что у пациентов с периодическими спонтанными абортами неясного генеза, резко возрастает вероятность выкидыша при снижении уровня грелина на 30-40% и более от физиологической нормы [17].
Исходя из результатов данной экспериментальной серии, можно предположить, что снижение уровня грелина при беременности будет приводить к расширению пула NKT-клеток в периферической крови и децидуальной оболочке, что в свою очередь повлечет снижение уровня IL-10, и усиление экспрессии IFN, создавая условия, благоприятствующие развитию провоспалительного ТЫ иммунного ответа, повышая тем самым вероятность неблагоприятного исхода беременности. Опираясь на данные настоящего эксперимента, предварительная инкубация мДК и пДК с грелином может оказывать оппозитные эффекты на количество iNKT в тимусе, но их общее в целом остается постоянным. При этом, пДК уменьшают пул iNKT-клеток, а мДК напротив - увеличивают пул iNKT. Судя по всему, для формирования окончательных выводов при оценке влияния премированных грелином мДК и пДК в регуляции дифференцировки тимоцитов требуются дополнительные исследования.
Вывод по разделу 3.3.2. - грелин, в концентрации 1,25 нг/мл, соответствующей его уровню в I-II триместре беременности, не влияет на способность прединкубированных с гормоном мДК и пДК тимуса в регуляции формирования T-FOXP3 (CD4+CD25+FOXP3+) и Th17 (CD4+IL-17A+ROR-C+) из тимоцитов, но предварительная инкубация мДК и пДК тимуса с грелином разнонаправленно регулирует их способность к регуляции количества iNKT-клеток (CD3hlVD24JD18+): мДК способствуют расширению пула NKT-клеток, а пДК напротив, способствуют снижению количества iNKT-клеток.