Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Механизмы активации, характеристика и межклеточные взаимодействия ключевых клеток-эффекторов врожденного иммунитета 19
1.1. Характеристика рецепторов врожденного иммунитета и механизмы проведения сигналов 19
1.2. Характеристика ключевых клеток врожденного иммунитета 27
1.3. Взаимодействие клеток врожденного иммунитета при вирусных инфекциях 36
Глава 2. Структура и физиологический спектр действия сульфатированных полисахаридов бурых водорослей 41
2.1. Структура сульфатированных полисахаридов 41
2.2. Физиологический спектр действия сульфатированных полисахаридов 46
Глава 3. Материалы и методы 68
3.1. Материалы исследования 68
3.2. Методы и объём исследований 73
3.3. Методы оценки взаимодействия сульфатированных полисахаридов с TLRs 76
3.4. Методы оценки функциональной активности ДК 80
3.5. Методы оценки функциональной активности мононуклеарных лейкоцитов мышей и NK-клеток 83
3.6. Методы исследования противовирусного действия сульфатированных полисахаридов бурых водорослей 86
3.7. Статистический анализ 92
Глава 4. Взаимодействие сульфатированных полисахаридов бурых водорослей с Toll-подобными рецепторами 93
4.1. Влияние фукоиданов на экспрессию TLR-2, TLR-4 и TLR-9 дендритными клетками мышей, костномозгового происхождения 93
4.2. Изучение взаимодействия фукоиданов с TLR-2, гетеродимером TLR-2/6, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-7, TLR-8 и TLR-9 человека на клеточных линиях эмбрионального почечного эпителия человека НЕК-293 99
4.3. Изучение токсического действия фукоиданов на клеточные линии эмбрионального почечного эпителия человека НЕК-293 106
4.4. Исследование фукоиданов на содержание липополисахарида грамотрицательных бактерий (ЛАЛ-тест, газожидкостная хроматография и газожидкостная масс спектрометрия) .109
Глава 5. Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на созревание дендритных клеток 113
5.1. Иммунофенотип дендритных клеток, генерированных из костного мозга мышей под действием фукоиданов 113
5.2. Иммунофенотип дендритных клеток, генерированных из моноцитов периферической крови человека под действием фукоиданов 120
5.3. Морфологическая характеристика дендритных клеток, генерированных из моноцитов периферической крови человека под действием фукоиданов 128
Глава 6. Характеристика профиля цитокинов, продуцируемых дендритными клетками, под действием сульфатированных полисахаридов бурых водорослей 137
6.1. Влияние фукоиданов на продукцию цитокинов дендритными клетками, генерированными из костного мозга мышей 137
6.2. Влияние фукоиданов на продукцию цитокинов дендритными клетками, генерированными из моноцитов периферической крови человека 140
Глава 7. Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на клетки-эффекторы врожденного иммунитета и развитие адаптивного иммунного ответа 144
7.1. Характеристика субпопуляционного состава лимфоцитов селезенки мышей, под действием фукоиданов в системе ex vivo 144
7.2. Влияние фукоиданов на морфологическую характеристику лимфоидных органов 148
7.3. Влияние фукоиданов на динамику продукции цитокинов в сыворотке крови мышей в системе ex vivo 154
7.4. Влияние фукоиданов на пролиферативную активность спленоцитов мышей в системах in vitro и ex vivo 162
7.5. Влияние фукоиданов на цитотоксическую активность спленоцитов мышей в системах in vitro и ex vivo 165
Глава 8. Противовирусная активность сульфатированных полисахаридов бурых водорослей 170
8.1. Противовирусная активность фукоидана из бурой водоросли Laminaria japonica в отношении вируса гриппа птиц A/H5N1 in vitro 170
8.1.1. Определение цитотоксического действия фукоидана на культуру клеток СПЭВ 170
8.1.2. Изучение противовирусной активности фукоидана в отношении вируса гриппа птиц A/H5N1 170
8.2. Противовирусная активность сульфатированных полисахаридов бурых водорослей при экспериментальной хантавирусной инфекции 174
8.2.1. Скрининг биополимеров из морских гидробионтов на культуре клеток Vero Е6 174
8.2.2. Изучение противовирусной активности фукоиданов в отношении хантавируса в системе in vitro 176
8.2.3. Изучение противовирусной активности фукоиданов на модели экспериментальной хантавирусной инфекции в системе ex vivo 180
8.3. Противовирусная активность сульфатированных полисахаридов бурых водорослей при экспериментальном клещевом энцефалите 183
8.3.1. Изучение противовирусной активности фукоиданов при экспериментальном клещевом энцефалите в системе in vitro 183
8.3.2. Протективное действие фукоиданов на модели экспериментального клещевого энцефалита у мышей in vivo 186
Заключение 200
Выводы 227
Рекомендации для внедрения в медицинскую науку и практику 230
Список литературы 231
- Характеристика рецепторов врожденного иммунитета и механизмы проведения сигналов
- Методы оценки взаимодействия сульфатированных полисахаридов с TLRs
- Влияние фукоиданов на продукцию цитокинов дендритными клетками, генерированными из моноцитов периферической крови человека
- Протективное действие фукоиданов на модели экспериментального клещевого энцефалита у мышей in vivo
Введение к работе
Актуальность проблемы
Согласно современным представлениям, иммунная система человека, представлена двумя интегрированными между собой компонентами - врожденным и адаптивным иммунитетом, в основе функционирования которых лежат разные механизмы действия, в целом обеспечивающие защиту организма. Активация врожденного иммунитета является обязательным условием для формирования неспецифической резистентности к инфекции и развития адаптивного иммунного ответа [Р. Меджитов, Ч. Джаневей, 2004; F. Blasi, 2005; Б.Ф. Семенов, В.В. Зверев, 2007]
Эффекторные механизмы врожденного иммунитета многофакторны, однако универсальная система их действия была сформулирована лишь в последние десятилетия. Это касается ключевой роли рецепторного аппарата, и прежде всего Toll-like рецепторов (TLRs), которые являются первым звеном взаимодействия с лигандами патогенных микроорганизмов и определяют дальнейшие пути развития иммунного ответа [B. Beutler, 2009; T. , S. , 2010; Л.В. Ковальчук и соавт., 2005 и 2011; H. et al., 2011]. Установлена центральная роль дендритных клеток (ДК), обеспечивающих распознавание, процессинг и презентацию антигенов наивным Т-лимфоцитам. Направленность пути активации ДК является важным элементом, программирующим взаимодействие клеток и развитие иммунного ответа по Th-1 или Th-2 типу [Р. Меджитов, Ч. Джаневей, 2004; М.В. Пащенков, Б.В. Пинегин, 2006]. Важным компонентом врожденного иммунитета являются и NK-клетки (natural killer), основной ключевой функцией которых является киллинг инфицированных, трансформированных и опухолевых клеток организма [K.Takeda, 2004; L.L. Lanier, 2008; М.С. Друцкая и соавт., 2011].
Одним из перспективных направлений активации системы врожденного иммунитета является использование иммуномодулирующих препаратов – модификаторов эффекторных функций, изучение механизма действия которых на молекулярном и клеточном уровнях позволит определить рациональный спектр их дальнейшего использования при различных заболеваниях, связанных с развитием иммунопатологических состояний [Б.Ф. Семенов, В.В. Зверев, 2007; Н.К. Ахматова, М.В. Киселевский, 2008].
Приоритетным направлением в изучении механизма действия иммунобиологически активных веществ, является исследование их специфических лиганд-рецепторных взаимодействий с TLRs, инициирующих развитие сигнального каскада, активацию ядерных факторов и экспрессию генов иммунного ответа, что позволит использовать их в качестве молекулярных адъювантов для создания противоинфекционной защиты организма [И.О. Чикелева и соавт., 2010; S.K. , B.M. , 2010; G.C. , Z.J , 2012; V.D. , 2012].
Среди большого числа природных и синтетических иммуномодуляторов особый интерес для изучения представляют сульфатированные полисахариды - фукоиданы бурых водорослей. Биологическое разнообразие водорослей в Мировом океане создает неограниченный ресурс для создания новых активных соединений за счет уникальной химической структуры, низкой токсичности и широкого полифункционального спектра действия [T.N. Zvyagintseva et al., 2003; А.И. Усов, М.И. Билан, 2009; M.I. Bilan, 2010].
Установлено, что сульфатированные полисахариды за счет универсальных углеводспецифических взаимодействий с мембранными рецепторами иммунокомпетентных клеток, инициируют развитие различных внутриклеточных биохимических процессов, что приводит к активации, морфологическим, метаболическим и функциональным изменениям нейтрофилов и макрофагов [Т.С. Запорожец 2006; Т.А. Кузнецова, 2009; T. et al., 2010; S.B. Park et al., 2010; Н.Н. Беседнова, Т.С. Запорожец, 2011].
Несмотря на многочисленное количество исследований, имеющих фрагментарный характер, механизм активации системы врожденного иммунитета под действием сульфатированных полисахаридов остается мало изученным. Отсутствуют данные о влиянии фукоиданов на функциональную активность ключевых эффекторов врожденного иммунитета, обеспечивающих неспецифическую резистентность и развитие адаптивного иммунного ответа, активацию транскрипционных ядерных факторов при взаимодействии с TLRs, практически отсутствуют исследования, показывающие связь химической структуры с противовирусным действием фукоиданов.
Настоящая работа раскрывает механизмы активации системы врожденного иммунитета сульфатированными полисахаридами бурых водорослей и является экспериментальным обоснованием возможности конструирования на их основе фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов.
Цель исследования
Исследование молекулярных и клеточных механизмов активации врожденного иммунитета различными по химической структуре фукоиданами из бурых водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides и Laminaria japonica и оценка их влияния на формирование противовирусной защиты.
Задачи исследования
1. Установить влияние фукоиданов из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica на экспрессию TLRs на иммунокомпетентных клетках (ДК и МЛ) и их взаимодействие с TLRs на эукариотических линиях клеток эмбрионального почечного эпителия человека.
2. Определить влияние фукоиданов из F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica на созревание (экспрессия маркеров активации и терминальной дифференцировки, адгезивных, костимулирующих и антигенпредставляющих молекул) морфологию и продукцию цитокинов дендритными клетками.
3. Провести сравнительное изучение влияния фукоиданов из F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica на субпопуляционный состав МЛ, продукцию цитокинов, пролиферативную и цитотоксическую активности спленоцитов мышей в системах in vitro и ex vivo.
4. Исследовать действие сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на морфологическую структуру первичных и вторичных органов иммуногенеза.
5. На экспериментальных вирусных моделях в системах in vitro и in vivo изучить антиадсорбционное, вирусингибирующее и протективное действие различных по влияние химической структуры сульфатированных полисахаридов бурых водорослей в отношении вируса гриппа птиц А/H5N1, хантавируса и вируса клещевого энцефалита.
Научная новизна работы
Впервые установлено увеличение экспрессии TLR-2 и TLR-4 на поверхности дендритных клеток и МЛ селезенки мышей, что определяет дальнейшие пути активации проводящих путей для передачи сигналов, индуцирующих экспрессию генов провоспалительных цитокинов и интерферониндуцибельных генов.
Впервые доказано, что различные по химической структуре сульфатированные полисахариды из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica при взаимодействии с ТLR-2, ТLR-2/6 и ТLR-4 на клеточных линиях эмбрионального почечного эпителия человека HEK-293 активируют транскрипционный ядерный фактор NF-kB через MyD88 сигнальный путь, а при взаимодействии с ТLR-4 дополнительно через адаптерную пару TRIF/TRAM. Наибольшим действием обладает частично ацетилированный фукоидан из F. evanescens. Отсутствие токсического действия и содержания ЛПС грамотрицательных бактерий в их структуре исключает возможность неспецифической активации NF-kB, и доказывает, что сульфатированные полисахариды являются лигандами для ТLR-2, ТLR-4 и ТL-R2/6.
Впервые показано, что различные по химической структуре сульфатированные полисахариды бурых водорослей обладают универсальным индуцирующим действием на созревание ДК, о чем свидетельствуют характерные морфологические изменения (клетки округлой неправильной формы с эксцентрично расположенным ядром, вакуолизированной цитоплазмой и многочисленными цитоплазматическими псевдоподиями разнообразной формы) и увеличение экспрессии маркеров связанных с созреванием ДК (CD83, CD38, CD11с, CD40, CD86, MHC II класса). Различие в действии фукоиданов установлено только при исследовании экспрессии молекулы адгезии CD11с, наибольшей активностью по этому показателю обладал полностью сульфатированный фукоидан из L. cichorioides.
Впервые выявлено, что под действием сульфатированных полисахаридов увеличивается продукция иммунорегуляторного (IL-12) и провоспалительных цитокинов (TNF-, IL-6, IL-1) созревшими ДК. Установлено, что в системе ex vivo фукоиданы увеличивают продукцию как Th1-цитокинов (IL-2, IL-12, IFN, TNF,), так и Тh2-цитокинов (IL-6), что способствует дифференцировке активированных Т-клеток в эффекторные Т-клетки адаптивного иммунитета и поляризации развития иммунного ответа по Th-1 типу. Наибольшим цитокининдуцирующим действием на продукцию IFN обладал фукоидан из F. evanescens, а на продукцию IL-12 - фукоидан из L. japonica, которые являются частично ацетилированными сульфатированными полисахаридами, но различаются по типу связи, соотношению моносахаридного состава и молекулярной массе.
Впервые установлено, что под действием фукоиданов происходит изменение морфологической структуры первичных и вторичных органов иммуногенеза (активация гемопоэза, выраженная макрофагальная реакция, и пролиферация лимфоидных клеток).
В системах in vitro и ex vivo установлено, что фукоиданы оказывают стимулирующее влияние на иммунофенотип МЛ селезенки (увеличение экспрессии CD19, NK, NКТ, CD25, MHC II, TCR, TLR-2 и TLR-4), пролиферативный потенциал и цитотоксическую активность спленоцитов мышей по отношению к NK-чувствительной линии клеток эритробластного лейкоза человека K562. Данные цитологического исследования подтверждают, что активированные фукоиданами спленоциты вызывают лизис и деструкцию опухолевых клеток линии К562.
Впервые на моделях трех экспериментальных вирусных инфекциях установлена противовирусная активность фукоиданов из F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica, которая связана с их химической структурой, схемой и дозой введения фукоиданов.
Установлено вирусингибирующее и протективное действие частично ацетилированного сульфатированного полисахарида из L. japonica в отношении высокопатогенного варианта вируса гриппа А/H5N1. Присутствие в структуре фукоидана высокого содержания галактозы обеспечивает конкурентное углеводспецифическое взаимодействие с гликопротеином вируса гриппа птиц, распознающим специфические рецепторы галактозы и сульфатированные рецепторы.
При экспериментальной хантавирусной инфекции на моделях культуры клеток Vero E6 и перитонеальных макрофагов мышей показано, что наибольшим антиадсорбционным и ингибирующим действием на развитие инфекционного процесса обладают сульфатированные полисахариды из L. japonica и L. cichorioides, которые являются 13-a-L-фуканами, но различаются по молекулярной массе, степени сульфатирования и моносахаридному составу.
В системах in vitro и in vivo при экспериментальном клещевом энцефалите установлено, что наибольшей ингибирующей активностью на адсорбцию вируса, и протективным действием обладают частично ацетилированные фукоиданы из F. evanescens и L. japonica.
Практическая значимость работы
Активация клеточных и молекулярных механизмов системы врожденного иммунитета под действием сульфатированных полисахаридов бурых водорослей, с учетом их химической структуры и механизмов действия, является экспериментальным обоснованием целесообразности конструирования на их основе новых фармакологических субстанций и лекарственных препаратов для коррекции различных иммунопатологических процессов, в том числе при вирусных инфекциях.
Алгоритм активации ключевых эффекторов врожденного иммунитета сульфатированными полисахаридами бурых водорослей может быть применен для скрининга новых иммунобиологически активных препаратов, предназначенных для коррекции нарушений иммунной системы и активации неспецифической резистентности к инфекции.
По материалам диссертации получен патент РФ № 2304443 от 20.08.2007 «Средство, обладающее противовирусной активностью» Опубл.20.08.2007. Бюлл. № 23.
Материалы диссертации автора включены в научно-экспериментальную работу лаборатории иммунологии ФГБУ «НИИЭМ им. Г.П. Сомова» СО РАМН и лаборатории химии ферментов ФГБУН «ТИБОХ им. Г.Б. Елякова» ДВО РАН, в отчеты по грантам РФФИ 09-04-00761а и программам фундаментальных исследований президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки медицины».
Результаты диссертационной работы использованы при подготовке научно-технической документации (ТИ и ТУ 9284-065-02698170-2005) на БАД “Фуколам” на основе фукоидана из бурой водоросли F.evanescens Охотского моря (свидетельство Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.739.1.06 от 30.01.06.). Материалы диссертации использованы для подготовки научно-технической документации к проекту МНТЦ №4000 от 01.05.2010 г. «Клинико-иммунологическая эффективность нового синбиотического продукта категории функционального питания (кисломолочный напиток с B. bifidum, обогащенный полисахаридами из бурой водоросли Fucus evanescens)».
Основные положения, выносимые на защиту
1. Увеличение экспрессии TLR-2 и TLR-4 под действием сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на поверхности дендритных клеток и активация транскрипционного ядерного фактора NF-kB при взаимодействии фукоиданов из F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica с ТLR-2, гетеродимером ТLR-2/6 и ТLR-4 на клеточных линиях эмбрионального почечного эпителия человека HEK-293 свидетельствуют о том, что фукоиданы являются лигандами и способствуют активации сигнальной передачи для последующей индукции и экспрессии генов иммунного ответа.
2. Фукоиданы из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica являются индукторами созревания ДК, о чем свидетельствуют их иммунофенотипические, морфологические и функциональные (увеличение продукции иммунорегуляторного IL-12 и провоспалительных цитокинов - IL-1, IL-6, TNF-) характеристики, что определяет направленность дифференцировки и активации Т-лимфоцитов и поляризации развития иммунного ответа по Th1 типу.
3. Влияние фукоиданов на субпопуляционный состав МЛ селезенки мышей (экспрессия CD19, NK, NКТ, CD25, MHC II, TCR, TLR-2 и TLR-4), динамику продукции провоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов (увеличение уровня IFN, IL-2, IL-12, TNF-, IL-6), пролиферативную и цитотоксическую активности спленоцитов мышей в системах in vitro и ex vivo свидетельствует об активации механизмов системы врожденного иммунитета и реализации пути развития адаптивного иммунного ответа по Th1 типу.
4. Сульфатированные полисахариды бурых водорослей способствуют активации гемопоэза, выраженной макрофагальной реакции и пролиферации лимфоидных клеток в первичных и вторичных органах иммуногенеза.
5. Сульфатированные полисахариды из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica при экспериментальных вирусных инфекциях обладают антиадсорбционным, вирусингибирующим и протективным действием, в отношении в отношении вируса гриппа птиц A/H5N1, хантавируса и вируса клещевого энцефалита в системах in vitro и in vivo. Установлено, что противовирусная активность фукоиданов при различных вирусных инфекциях связана с особенностями их химического строения.
Личный вклад автора
Автором лично выполнен анализ литературных данных по теме диссертации, проведено исследование влияния сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на экспрессию TLR на ДК, активацию ядерного фактора NF-kB при взаимодействии с TLRs человека, на созревание и функциональные характеристики ДК, субпопуляционный состав МЛ селезенки, морфологические изменения первичных и вторичных органов иммуногенеза, пролиферативную и цитотоксическую активность спленоцитов мышей, продукцию цитокинов и противовирусную активность, выполнена статистическая обработка и анализ результатов диссертационной работы.
Апробация материалов диссертации
Результаты диссертационной работы были представлены на научно–практических конференциях и симпозиумах международного, российского и регионального уровня: International Symposium on Marine Drugs (Qingdao, China, 2004), IV Научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (Владивосток, 2004), 6th International Conference on Hantaviruses (Seoul, Korea, 2004), IV научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (Владивосток, 2004), II Объединенном иммунологическом форуме (IV Съезд иммунологов России, XII Всероссийский форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург, 2008), Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск 2009), XV International Scientific Conference «FAMILY HEALTH IN THE XXI CENTURE» (Torremolinos, Spain, 2011), VI Научно-практической конференции «Фундаментальная наука – медицине» (Владивосток, 2011), X Региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии» (Владивосток, 2012), XIII Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы науки и образования» (Москва, 2012), VII Всероссийской конференции с международным участием «Иммунологические чтения» (Челябинск, 2012).
По материалам диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе 20 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных положений диссертации, и получен 1 патент.
Апробация диссертации состоялась 29 мая 2013 г. на заседании Ученого совета ФГБУ «НИИЭМ имени Г.П. Сомова» и 18 июня 2013 г. на заседании Ученого совета ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.
Объём и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций для внедрения в медицинскую науку и практику, списка литературы и приложений. Диссертация изложена на 278 страницах машинописного текста, иллюстрирована 29 таблицами и 43 рисунками. Список литературы включает 482 источника, из них 107 отечественных и 375 - иностранных.
Характеристика рецепторов врожденного иммунитета и механизмы проведения сигналов
В настоящее время доказано, что ключевую роль в механизмах действия врожденного иммунитета, играет универсальная система детекции PAMPs микроорганизмов различных таксономических групп специализированными PRR-рецепторами, экспрессированными в цитоплазме и на мембране клеток-эффекторов [49, 58, 147, 148, 301, 381, 446, 467].
Известно, что по своей структуре PRRs (лектиновые рецепторы С-типа, Toll-, NOD- и RIG-подобные рецепторы, маннозный и scavenger-рецепторы) относятся к нескольким белковым семействам, а по функциональной активности разделяются на три класса: секретируемые, эндоцитозные и сигнальные, в целом обеспечивающие распознавание патогенных микроорганизмов. Взаимодействие лигандов с PRRs инициирует запуск внутриклеточных сигнальных каскадов, приводящих к активации транскрипционных ядерных факторов (NF-kB, АР-1, IRF-3, -5, -7), определяющих развитие реакций врожденного и адаптивного иммунитета [9, 111,123, 164,321,335,456].
Наиболее изученными являются эволюционно закодированные TLRs, которые играют ключевую роль в активации и реализации эффекторных функций врожденного иммунитета [92, 142, 243, 293, 471, 448].
В настоящее время, семейство TLRs человека включает около 23 членов (табл. 1), среди которых полную характеристику имеют только 13 рецепторов [5, 164, 430, 443].
Согласно данным литературы, TLRs принадлежат к семейству трансмембранных рецепторов, характеризующихся внутриклеточным СООН концом и внеклеточным NH2-KOH40M, состоящим из повторов богатых лейцином (LRR - leucine rich repeats) и образующих подковообразную структуру, вогнутая поверхность которой вовлечена в распознавание и взаимодействие с лигандами, а также участвует в демеризации TLRs [44, 91, 122,321,430].
Внутриклеточный цитоплазматический участок TLRs из-за сходства в строении с цитоплазматическим доменом рецептора IL-1, получил название TIR-домен (Toll/interleukin-1 receptor). Через TIR-домен осуществляется взаимодействие между TLRs и адаптерными молекулами, осуществляющими трансдукцию и трансляцию сигнала, активирующего транскрипцию ядерного фактора NF-kB [94, 123, 146, 164]. Активация NF-kB является решающим фактором для формирования адаптивного иммунного ответа [55, 95, 151, 171].
В настоящее время известно, что TLRs в большом количестве экспрессируются на клетках системы врожденного иммунитета (Мф, ДК, моноциты, Нф, NK, В- и Т-лимфоциты, эндотелиальные клетки), на поверхности эпителиальных клеток кишечника, керацитов кожи, клетках микроглии, селезенки, легких и плаценты, при этом TLR-1, TLR-2, TLR-4, TLR- TLR-5, TLR-6 и TLR-11 расположены на поверхности клетки, a TLR-3, TLR-7, TLR-8 и TLR-9 локализованы внутриклеточно [18, 45, 91, 164, 210].
Уровень экспрессии TLRs на мембранах и в цитоплазме клеток зависит от природы и стадии её развития, характеристики действующих цитокинов и свойств распознаваемых лигандов. Лигандами для TLR являются PAMPs микроорганизмов (ЛПС, пептидогликан, липотейхоевые кислоты, маннаны, флагеллин, бактериальная ДНК, вирусные РНК, глюканы, молекулярные карбогидратные и липидные структуры, одно - и двуспиральная РНК, CpG-мотив ДНК, а также эндогенные продукты (белки теплового шока, мочевая кислота, нуклеиновые кислоты, продукты апоптоза и некроза, фибриноген, домен А фибронектина, фрагменты гепарансульфата и гиалуроновой кислоты) [5, 44, 86, 148, 185, 430, 452].
В основном, TLRs функционируют как гомодимеры, однако для того, чтобы TLR1 и TLR6 распознали лиганды и начали транслировать сигналы, требуемые для синтеза цитокинов, необходимо образование гетеродимеров, что способствует расширению диапозона распознаваемых лиганд. Учитывая, что функции и прямые лиганды установлены не у всех TLRs, предполагается, что некоторые из них функционируют как корецепторы [44, 86, 91, 164]. Через узнавание лиганд TLRs индуцируют экспрессию эффекторных механизмов врожденного иммунитета, необходимых для защиты организма от проникновения патогенов и праймирования адаптивного иммунного ответа [78, 116, 171, 293, 360, 429, 467].
Согласно данным литературы, рецепторы семейства NOD функционируют в цитоплазме клеток и состоят из С-концевого лейцин-богатого домена, NB-центрального и N-концевого эффекторного доменов [95, 346, 348]. Взаимодействие NOD с лигандами приводит к образованию и активации в Мф и Нф инфламмасомы - сигнального комплекса, обеспечивающего протеолитическую активацию синтеза провоспалительных цитокинов (IL-ip, IL-18) [187, 274, 316, 385, 445].
NODI распознает диаминопимелиновую кислоту в клеточной стенке пептидогликана грамотрицательных бактерий, тогда как NOD2 распознает мурамилпептидные структуры клеточной стенки всех бактерий, а через взаимодействие с митохондриальным белковым комплексом и сигнальным белком MAVS, участвует в регуляции противовирусной защиты, способствуя продукции IFN I типа [5, 95, 275, 347, 436, 440].
Семейство RIG-подобных рецепторов (RIG-I, MDA5 и LGP-2) является цитоплазматическими белковыми сенсорами, которые, взаимодействуя с адаптерным белком MAVS через ТВК1- и ІККє-киназьі, спсобствуют опосредованной активации IRF3, -7 и NF-kB - основных регуляторов транскрипции генов провоспалительных цитокинов и IFN [154, 307, 308, 384, 390]. Кроме того, RIG-I обладает MAVS-независимой противовирусной активностью через прямую активацию молекулярного механизма запуска воспалительного процесса - инфламмасому [445]. Среди рецепторов семейства RLRs, наиболее изученным является RIG I, ключевой медиатор противовирусного иммунитета, участвующий во внутриклеточном распознавании вирусной РНК ортомиксо- и парамиксовирусов, вирусов гепатита С и японского энцефалита [308, 364, 390, 398]. Вопрос об участии RLRs в распознавании ДНК-содержащих вирусов и внутриклеточных бактерий до сих пор остается открытым [24, 45].
Лектиновые рецепторы С-типа, способствующие пути активации системы комплемента, являются PRR микробных углеводов. Лектин, связывающий маннозу, ассоциирован с сериновыми протеазами маннансвязывающими лектин-ассоциированными протеазами 1 и 2 (MASP1 и MASP2). Взаимодействие лектина с микробным лигандом приводит к активации MASP1 и MASP2, которые расщепляют С2 и С4 компоненты системы комплемента. Продукты расщепления С2а и С4Ь образуют СЗ конвертазу, которая инициируют каскад реакций за счет расщепления СЗ. Комплекс лектина, связывающего маннозу, и его протеаз, функционирует так же, как С1 комплекс классического пути активации комплемента. Следует отметить, что сериновые протеиназы С1г и Cls активируются при связывании Clq с комплексом антиген-антитело, в то время как маннансвязывающие лектин-ассоциированные протеазы активируются при распознавании микроорганизма независимо от адаптивной иммунной системы [58, 102, 107].
Методы оценки взаимодействия сульфатированных полисахаридов с TLRs
Изучение способности фукоиданов в условиях in vitro специфически взаимодействовать с TLRs проведено на линии эукариотических клеток эмбрионального почечного эпителия человека (НЕК293), в геном которых генно-инженерным методом введены гены различных TLRs человека (TLR-2, TLR-2/6, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-7, TLR-8, TLR-9) ген фермента р-галактозидазы (HEK293LR2/CD14, -hTLR2/6, -hTLR4/CD14-MD2 и -hTLR5) или секретируемой во внеклеточное пространство репортерный ген щелочной фосфатазы (HEK293-hTLR3, -hTLR7, -hTLR8 и -hTLR9) под контролем NF-kB зависимого промотера для детекции взаимодействия лиганда с соответствующим TLRs. При связывании лиганда с TLRs происходит инициация внутриклеточного сигнального каскада, приводящая к активации транскрипционного фактора NF-kB, который транслоцируется в ядро и связывается с собственным промотерным участком, инициируя экспрессию репортерного гена р-галактозидазы или щелочной фосфатазы (SEAP).
В качестве отрицательного контроля (К-), подтверждающего специфичность взаимодействия фукоиданов с TLRs, использовали линии клеток не экспрессирующие TLR - HEK293-null, содержащие в своем геноме репортерный ген [3-галактозидазы и HEK293LRnulllK, содержащие репортерный ген SEAP под контролем NF-kB зависимого промотера. В качестве положительного контроля, подтверждающего функциональную активность репортерной системы и действия рецепторов использовали классические лиганды (Invivogen, США) для соответствующих TLRs: синтетический липопептид (10 нг/мл) для TLR2 и гетеродимера TLR2/TLR6, липополисахарид (ЛПС) Escherichia coli (10 нг/мл) - TLR4, флагелин (50 нг/мл) - TLR5, полиинозитол-цитидиновую кислоту (100 мкг/мл) - polyI:C LR3, синтетические производные тиазохинолина (Thiazoquinoline) и имидазохинолина (Imidazoquinoline) - CL097 и CL075 (10 мкг/мл) - TLR7 и TLR8, синтетический аналог неметилированной двухцепочечной ДНК -ODN2009 (100 мкг/мл) - TLR9 и TNF-a (10 нг/мл) для клеток HEK293-null и hTLRnulllK. Для проведения эксперимента клетки НЕК293 рассеивали в 96 луночный планшет по 100 мкл (2 х 10 клеток на лунку) и инкубировали при 37С в 5% С02 в течение 24 часов. Фукой даны, в исследуемых концентрациях (от 10 нг/мл до 1мг/мл), вносили в лунки в объеме 10 мкл. Через 24 часа после инкубирования с фукоиданами, путем центрифугирования при 14000g отбирали аликвоты культуральной среды (30 мкл) и переносили в лунки нового планшета.
Для определения уровня экспрессии репортерных генов в лунки добавляли 170 мкл буфера ONPG с субстратом для Р-галактозидазы (1 мМ MgCl2; 0,25 М трис-HCl, рН 7,4; 0,02% NP40; 2 г/л о-нитрофенил-Р-Д-галактопиранозид) и SEAP буфер с субстратом для щелочной фосфатазы (0,5М NaHC03, 0,5mM MgCl2 рН=9.8, содержащий бОмМ субстрата р-нитрофенилфосфата). Для проведения ферментативной реакции планшет инкубировали при 37С в течение 20-30 мин до достижения характерной желтой окраски раствора, соответствующей оптической плотности -1-2 ОЕ. Данный метод позволяет определить взаимодействие лиганда с соответствующим TLR и активацию NF-kB по характерной цветовой окраске, возникающей при конверсии субстратов о-нитрофенил-3-Д-галактопиранозида и р-нитрофенилфосфата (активация Р-галактозидазы и SEAP под контролем транскрипционного фактора NF-kB).
Анализ активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках проводили на спектрофотометре iEMS Reader MF (Thermolabsystems, США) при длине волны 414 нм [55, 95].
Влияние фукоиданов на продукцию цитокинов дендритными клетками, генерированными из моноцитов периферической крови человека
Изучение продукции цитокинов позволяет получить как информацию о функциональной активности различных типов ИКК, так и соотношении процессов активации Th-І и -2 типов, что имеет важное значение при дифференциальной диагностике инфекционных и иммунопатологических процессах [5, 41, 88, 92, 100].
Поэтому, следующим этапом исследований было изучение влияния фукоиданов из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica на продукцию цитокинов ДК, генерированных из моноцитов периферической крови человека in vitro.
Результаты исследования показали (табл. 8), что внесение в среду культивирования сульфатированных полисахаридов в качестве индукторов созревания ДК, способствует увеличению уровня цитокинов, продуцируемых как ТЫ, так и Th2 типа, что. обеспечивает взаимосвязь между врожденным и адаптивным иммунитетом.
При изучении продукции IL-ip ДК, установлено, что только TNF-a и фукоидан из L. japonica способствуют незначительному увеличению уровня IL-ip в 1,48 и 1,32 раза (1,94 и 1,73 пкг/мл) по сравнению с показателями в контроле - незрелыми ДК (1,31 пкг/мл).
Результаты исследования IL-12, играющего важную связующую роль между врожденным и адаптивным иммунитетом демонстрируют, что все исследуемые полисахариды обладают выраженным цитокининдуцирующим действием. Установлено, что фукоиданы из F. evanescens и L. cichorioides увеличивают продукцию IL-12 дендритными клетками в 2,83 и 2,76 раз (49,91 и 48,71 пкг/мл) по сравнению с показателями в контроле (17,65 пкг/мл), а фукоидан из L. japonica - в 3 раза (54,73 пкг/мл).
Стимулирующее действие сульфатированных полисахаридов установлено и при исследовании продукции TNF-a дендритными клетками. Так, фукоиданы из F. evanescens и L. japonica увеличивали продукцию TNF-a в 1,75 и 1,67 раза (36,19 и 34,33 пкг/мл) по сравнению с незрелыми ДК (20,59 пкг/мл), а фукоидан из L. cichorioides - в 2 раза (42,72 пкг/мл). Однако самый высокий уровень TNF-a был установлен при добавлении в среду культивирования классического индуктора созревания ДК - TNF-a (59,72 пкг/мл).
При исследовании Th-2 цитокинов, установлено, что все исследуемые фукоиданы не оказывают стимулирующего влияния на продукцию IL-4 ДК, тогда как TNF-a способствовал его снижению.
Результаты, полученные при исследовании IL-6, свидетельствуют о выраженном индуцирующем действии фукоиданов. Установлено, что наибольшим действием обладают фукоиданы из F. evanescens и L japonica, которые способствовали увеличению продукции IL-6 дендритными клетками в 2,36 и 2 раза (39,82 и 35,21 пкг/мл) по сравнению с незрелыми ДК (16,84 пкг/мл). Исследование фукоидана из L. cichorioides показало, что полисахарид способствует увеличению концентрации IL-6 в 1,58 раза (26,64 пкг/мл).
При изучении продукции IL-10 дендритными клетками установлено, что наибольшим действием обладают фукоиданы из F. evanescens и L. cichorioides, которые увеличивают уровень IL-10 в 2,84 и 2,98 раза (7,47 и 7,83 пкг/мл) по сравнению с контролем (2,63 пкг/мл), тогда как фукоидан из L. japonica способствует увеличению уровня IL-10 в 2,2 раза (5,81 пкг/мл).
Таким образом, результаты исследования демонстрируют, что фукоиданы из бурых водорослей F. evanescens, L. cichorioides и L. japonica обладают индуцирующим действием на продукцию ДК регуляторного (IL-12) и провоспалительных (IL-6, TNF-a) цитокинов, что может являться механизмом, обеспечивающим развитие адаптивного иммунного ответа по ТЫ типу.
Протективное действие фукоиданов на модели экспериментального клещевого энцефалита у мышей in vivo
Целью следующего раздела исследований было изучение противовирусной активности сульфатированных полисахаридов при экспериментальном клещевом энцефалите у мышей. Результаты исследования показали, что летальность мышей в контрольной группе зараженной вирусом КЭ (10 LD5o), составила 100% на 11 день эксперимента, аСПЖ -9,98 дней.
Изучение противовирусной активности показало, что при лечебной схеме (введение полисахаридов через 1 час после инфицирования животных) применения фукоидана из L. japonica (табл. 23) наиболее эффективным было многократное внутримышечное введение полисахарида в дозе 20 мг/кг. Статистически достоверное протективное действие установлено при 3-х и 5-кратном введении фукоидана через час после инфицирования, что способствовало 40-50%) защите животных на 11 день наблюдения по сравнению со 100% гибелью в контроле. На 21 день выживаемость животных в этих группах составила 20 и 30% (а=0,045 и 0,041 соответственно), медиана средних значений СПЖ - 12,16 и 12,24 дней и увеличение СПЖ (УСПЖ) -20,83%. Однократное внутримышечное введение полисахарида было не эффективным.
При исследовании профилактической схемы применения фукоидана из L. japonica за 24 часа до инфицирования вирусом КЭ установлено, что при внутримышечном введении наибольший протективный эффект наблюдался при применении полисахарида в дозе 5 мг/кг. Однократное введение фукоидана способствовало 40% защите на 11 день развития заболевания по сравнению с полной летальностью в контрольной группе и 20% (а=0,044) выживаемости животных, СПЖ составила 12,7 дней, а УСПЖ - 27,25%. При введении фукоидана в течение 5 дней достоверная выживаемость животных составила 30% (а=0,038), СПЖ - 12,6 дней, а УСПЖ - 26,2%. Внутримышечное введение фукоидана в дозе 20 мг/кг не оказывало защитного действия.
Исследование противовирусной активности фукоидана из F. evanescens показало (табл. 24), что многократное введение полисахарида (5 и 20 мг/кг) по лечебной схеме способствовало статистически достоверной защите и выживаемости животных на протяжении всего эксперимента. Так, 3-кратное внутримышечное введение полисахарида (20 мг/кг) через час после инфицировании вирусом КЭ, обеспечивало 60% защиту животных на 11 день наблюдения и 40 % выживаемость (а=0,032), СПЖ составила 13,34 дней, а УСПЖ - 33,67%. При ежедневном введении фукоидана в течение 5 дней установлено, что полисахарид в дозе 5 и 20 мг/кг способствует 50% защите животных на 11 день эксперимента при полной гибели в контроле и 30% выживаемости (а=0,041 и 0,048), СПЖ составила 12,86 и 12,44 дней, а УСПЖ - 28,86 и 24,65%) соответственно. Внутримышечное введение фукоидана в течение 10 дней было менее эффективным.
Профилактическая схема исследования противовирусного действия фукоидана из F. evanescens показала, что внутримышечное введение полисахарида обеспечивало достоверную 40 - 50% защиту животных на 11 день развития инфекционного процесса, по сравнению со 100%) летальностью в контроле. Установлено, что как однократное, так и многократное введение полисахарида в дозе 5 мг/кг за 24 часа до инфицирования вирусом КЭ способствовало 40 и 30%) выживаемости животных (а=0,025 и 0,049 соответственно), СПЖ составила 13,16 и 12,33 дней, а УСПЖ - 31,86 и 23,55%. Тогда как только многократное введение фукоидана в дозе 20 мг/кг способствовало 20%) выживаемости животных, при СПЖ - 12,16 дней и УСПЖ=21,84%.
При исследовании противовирусной активности фукоидана из L. cichorioides установлено (табл. 25), что как при лечебной, так и профилактической схеме введения полисахарид не защищает инфицированных животных от цитодеструктивного действия высокопатогенного штамма вируса клещевого энцефалита.
Следует отметить, что противовирусная активность сульфатированного полисахарида из F. evanescens была сопоставима с действием циклоферона. Установлено, что внутримышечное введение препарата (табл.26) в концентрации 6 и 60 мг/кг по лечебной схеме в течение 5 дней, способствовало достоверной 50 и 60% защите на 11 день развития заболевания, 30 и 40%) выживаемости животных (а=0,039 и 0,012) по сравнению с контролем. К окончанию эксперимента СПЖ составила 12,53 и 14,34 дней, а УСПЖ - 27,45 и 43,69%. Профилактическая схема исследования циклоферона показала, что только внутримышечное введение препарата в концентрации 60,0 мг/кг в течение 5 дней способствовало достоверной 50% защите и 30 % (а=0,031) выживаемости животных, СПЖ составила 12,23 дня, а УСПЖ - 22,45%.
Учитывая полученные результаты, представляло интерес исследовать действие сульфатированных полисахаридов бурых водорослей при инфицировании животных меньшей дозой вируса КЭ. Результаты исследования показали, что все сульфатированные полисахариды обладали протективным действием, но наибольшей активностью обладал фукоидан из F. evanescens. Установлено, что летальность мышей в контрольной группе зараженной вирусом КЭ (5 LD5o) к окончанию эксперимента составила 60%, а медиана значений СПЖ -13,07 дней.
При изучении протективного действия фукоидана из L. japonica (табл. 27) установлено, что как при лечебной, так и при профилактической схеме эффективным было многократное внутримышечное введение обеих концентраций полисахарида, что способствовало в среднем 80% выживаемости животных. На 21 день эксперимента медиана СПЖ в среднем составила 18,4±0,27 и 18,3±0,32 дней соответственно, а УСПЖ - 40,81±2,06 и 40,0±2,46%. Однократное внутримышечное введение полисахарида было не эффективным.
Исследование противовирусной активности фукоидана из F. evanescens показало (табл. 28), что многократное введение обеих концентраций полисахарида по лечебной и профилактической схемам в основном способствует 90% статистически достоверной выживаемости животных. Медиана значений СПЖ у животных в среднем составила 18,9±3,07 и 19,05±0,22 дней соответственно, а УСПЖ - 44,61±3,87 и 45,75±1,73%.
Похожие диссертации на Молекулярно-клеточные механизмы активации врожденного иммунитета сульфатированными полисахаридами бурых водорослей
