Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы
Глава 1. Грипп как проблема XXI века 13
1. Врожденные механизмы иммунного ответа при гриппозной инфекции .13
2. Адаптивные иммунные механизмы при инфекции, вызванной гриппом 18
2.1. Гуморальный иммунитет 18
2.2. Клеточный иммунитет 20
3. Профилактика гриппа 21
3.1. Несовершенство современных вакцин против вируса гриппа 22
3.2. Типы современных вакцин против вируса гриппа и их воздействие на иммунную систему 23
Часть II. Собственные исследования
Глава 1. Материалы и методы исследования 34
1.1. Характеристика групп пациентов .34
1.2. Правовая основа исследования 34
1.3. Исследуемые вакцины против вируса гриппа .35
1.4. Оценка субпопуляционной структуры лимфоцитов 35
1.5. Характеристика поверхностных и эндоцитозных Толл-подобных рецепторов иммунокомпетентных клеток .36
1.6. Исходный уровень сывороточных антител к штаммам вируса гриппа 36
1.7. Определение уровня цитокинов 36
1.8. Выявление субпопуляций дендритных клеток .37
1.9. Оценка формирования клеток памяти .37
1.10. Статистическая обработка данных .38
Глава 2. Иммунофенотипические характеристики активированных клеток крови здоровых женщин вакцинными препаратами против вируса гриппа 40
2.1. Влияние вакцин против гриппа на субпопуляционную структуру лимфоцитов периферической крови здоровых лиц в системе in vitro .40
2.2. Влияние вакцин против гриппа на содержание TLRs-экспрессирующих клеток у добровольцев в системе in vitro 58
Глава 3. Цитокиный профиль мононуклеарных лейкоцитов периферической крови (МЛПК) добровольцев под воздействием вакцин против вируса гриппа 70
3.1. Индуцированный вакцинами против гриппа цитокиновый профиль (Th1/Th2/Th17/Th9/Th22) лейкоцитов у здоровых женщин 70
Глава 4. Субпопуляции дендритных клеток в крови женщин, вакцинированных против вируса гриппа с использованием различных препаратов 75
4.1. Сравнительный анализ уровней плазмоцитоидных и миелоидных дендритных клеток у здоровых женщин, вакцинированных иммуноадъювантной и безадъювантными вакцинами 75
Глава 5. Формирование иммунологической памяти к вакцинным штаммам вируса гриппа при введении иммуноадъювантной и безадъювантных вакцин 79
5.1. Оценка формирования клеток памяти у добровольцев через 12 мес. после применения различных вакцинных препаратов против вируса гриппа с помощью CD45RO-теста .79
Заключение .81
Выводы .99
Практические рекомендации 100
Список литературы .101
- Врожденные механизмы иммунного ответа при гриппозной инфекции
- Влияние вакцин против гриппа на субпопуляционную структуру лимфоцитов периферической крови здоровых лиц в системе in vitro
- Влияние вакцин против гриппа на содержание TLRs-экспрессирующих клеток у добровольцев в системе in vitro
- Оценка формирования клеток памяти у добровольцев через 12 мес. после применения различных вакцинных препаратов против вируса гриппа с помощью CD45RO-теста
Врожденные механизмы иммунного ответа при гриппозной инфекции
При попадании в организм вируса гриппа на первом этапе происходит его распознавание и включение звена врожденного иммунного ответа. Врожденный иммунитет направлен на предотвращение проникновения и размножения вируса в клетках эпителия дыхательных путей. Первичное распознавание вируса гриппа в инфицированных клетках осуществляется с помощью паттерн-распознающих рецепторов (PRR) (Pattern Recognition Receptors) [237]. Toll-подобные рецепторы (TLR) были первыми идентифицированными PRRs. К настоящему времени известно 10 членов этих рецепторов у человека и 13 у мышей [146, 155]. В общей группе TLRs в зависимости от локализации можно выделить три подгруппы: 1) экспрессия на поверхности клетки (TLR-1, TLR-2, TLR-5, TLR-6, TLR-10); 2) внутриклеточная экспрессия (TLR-3, TLR-7, TLR-8, TLR-9); 3) поверхностная и внутриклеточная экспрессия (TLR-4, TLR-11, TLR-12 и TLR-13) [154, 156, 181, 222, 240, 246].
Лигандами рецепторов, локализованных на цитоплазматической мембране, являются поверхностные структуры микроорганизмов – липопротеин, липополисахариды, флагеллин, зимозан. Рецепторы, локализованные в мембранах внутриклеточных органелл, распознают молекулы ядерных структур микроорганизмов, но могут быть активированы и поврежденными молекулярными структурами собственного организма. Каждый TLR обнаруживает различные патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs) вирусного, бактериального и другого происхождения. Так, например, липопротеины распознаются различными гетеродимерами из TLR-1, TLR-2 и TLR-6 [116, 252], двухцепочечная РНК (DS) – TLR-3 [81, 117], одноцепочечная РНК (SS) – TLR-7 и TLR-8 [115], флагеллин – TLR-5 [144] , ДНК – TLR-9 [51, 199]. То есть вирус гриппа узнается Толл-подобными рецепторами, TLR-7 и TLR-8.
Известно, что TLRs экспрессируются практически всеми клетками системы иммунитета, а также клетками многих органов и тканей. По всей вероятности, именно это обстоятельство обеспечивает широкий диапазон регуляторной роли TLRs в поддержании физиологического гомеостаза не только системы иммунитета, но и других органов и систем. Процесс эволюции надежно закрепил эту способность TLRs, и она особенно ярко проявляется в регуляции врожденного и приобретенного иммунитета, что осуществляется с участием различных механизмов [83, 183]. Сигнальные каскады, включающиеся после активации рецепторов, стимулируют синтез провоспалительных цитокинов и интерферонов первого типа (IFN I) [85, 169, 171].
Цитокины представляют собой низкомолекулярные белки, которые вырабатываются преимущественно эффекторными клетками крови и являются универсальными регуляторами, контролирующими важнейшие процессы клеточного гомеостаза. В настоящее время открыто более 100 цитокинов. Все они в совокупности образуют цитокиновую сеть, функционирование которой носит универсальный, достаточно стереотипный и врожденный характер. Цитокиновая сеть является одной из важнейших регуляторных систем организма наравне с нервной, кроветворной, эндокринной и другими системами [87,233].
IFN I обладают сильной противовирусной активностью благодаря ингибированию синтеза белка в инфицированных клетках и ограничивают репликацию вируса. IFN I индуцируют экспрессию генов ISGs, продукты которых способны ингибировать репликацию вируса [143, 167, 249]. Кроме того, IFN I стимулируют дендритные клетки (DCs), что в свою очередь усиливает презентацию гриппозных антигенов CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитам и способствует запуску адаптивного иммунного ответа [124, 137, 146, 191].
Белок М2 (ионный канал) активирует рецептор NLRP3, который обеспечивает превращение про-IL-1 в IL-1, участвующий в стимулировании Th17 клеток и пролиферации CD4+ Т-лимфоцитов [141].
В процессе инфицирования клеток альвеол активируются альвеолярные макрофаги, которые фагоцитируют инфицированные гриппом клетки. Кроме того, активированные макрофаги начинают продуцировать фактор некроза опухоли альфа (TNF-), что также способствует ограничению распространения вируса [110, 139]. Известно, что вирусемия вызывает иммунный ответ за счет выработки интерлейкинов: IL-1, IL-6, IL-8, TNF-, иммуноглобулинов [55, 148, 227].
После инокуляции вируса гриппа А в макрофагальные клеточные линии крыс, мышей и человека в культуральной жидкости обнаруживались повышенные концентрации IFN I, TNF-, IL-1, IL-6 и мононуклеарных клеточных аттрактантов-хемокинов (CCL3/MIP-1, CCl4/MIP-1, CCL5/RANTES, CXCL10/IP-10) [91, 250, 266].
Но чрезмерная выработка цитокинов может приводить к нежелательным последствиям, превышение нормальной их концентрации в десятки, сотни и более раз с развитием своеобразной клинической картины, в основе которой лежит системная воспалительная реакция. Данное состояние в литературе получило образное название “цитокиновый шторм” [106, 170, 236, 239, 261].
Из всех инфекционных заболеваний наиболее часто наблюдения “цитокинового шторма” встречаются при гриппе. Так, “цитокиновый шторм” нередко развивается у больных птичьим гриппом (H5N1) [78, 150, 208, 243, 257]. Jong M.D. et al. (2006 г.) проводят прямую связь между тяжелым и подчас смертельным течением птичьего гриппа и гиперцитокинемией [150].
В литературе также имеются отдельные наблюдения гиперцитокинемии при свином гриппе (H1N1) сезона 2009–2010 годов, сопровождающейся у всех больных резко выраженной лимфопенией [89, 94].
Клетки врожденной иммунной системы, такие как естественные киллерные клетки (NK), альвеолярные макрофаги и DCs играют решающую роль не только в начальном контроле за вирусной репликацией, но также и в развитии и регулировании вирус-специфического адаптивного иммунитета [146].
При гриппозной инфекции большое значение имеют конвенциональные DCs, расположенные под слоем эпителиальных клеток, над базальной мембраной верхних дыхательных путей. Они способны поглощать и процессировать вирионы вируса гриппа и апоптотические тельца инфицированных клеток. После поглощения вируса, DCs мигрируют в регионарные лимфоузлы, где они презентируют гриппозные антигены наивным Т-клеткам, активируя их [233].
DCs являются специализированными антиген-представляющими клетками (АРС), которые играют ключевую роль в иммунном ответе, являясь связующим звеном между врожденным и адаптивным иммунитетом [263]. Они созревают при распознавании патогенов и сверхрегулируют экспрессию МНС молекул и костимулирующих рецепторов для активации антиген-специфических CD4+ и CD8+ Т-клеток.
В настоящее время установлено, что DCs являются неоднородной популяцией, состоящей из различных субпопуляций со специализированными функциями в иммунном ответе на конкретные патогены. При вирусных инфекциях плазмоцитоидные дендритные клетки (pDCs) быстро продуцируют большое количество IFN-, который обладает мощным противовирусным эффектом и активирует несколько типов других иммунных клеток. Но тем не менее, pDCs могут индуцировать толерогенный цитокин IL-10 CD4+ Т-клетками.
В противоположность им, миелоидные дендритные клетки (mDCs) являются очень мощными АРС и обладают уникальной способностью праймировать наивные Т-клетки и, следовательно, инициировать первичный адаптивный иммунный ответ. Были определены различные субпопуляции mDCs со специализированными функциями. Установлено, что CD8+ mDCs захватывают антигенный материал от некротических клеток, секретируют высокие уровни IL 12, а также праймируют Th1 и цитотоксические Т-клетки для контроля за внутриклеточными патогенами. С другой стороны, CD8- mDCs преимущественно праймируют CD4+ Т-клетки и способствуют Th2 или Th17 дифференциации. BDCA-3+ mDC2 являются человеческим гомологом CD8+ mDCs, так как они разделяют экспрессию нескольких ключевых молекул, способных к кросс-презентации антигенов CD8+ Т-клеткам, и продуцируют IFN- [122]. Показано, что pDCs могут координировать события при вирусной инфекции, атопии, аутоиммунных заболеваниях и раке [164, 223].
NK являются важным компонентом врожденного иммунитета при гриппе. Есть данные о способности NK распознавать инфицированные гриппом клетки через рецепторы NKp44 и NKp46, связывающие гемагглютинин [84]. Также, по некоторым данным, NK стимулируют клеточный иммунный ответ, регулируют созревание эозинофилов и защищают эпителий дыхательных путей [98, 121, 212, 244].
Активация эффекторов врожденного иммунитета является критически важной при распознавании инфекции, а также при поствакцинальном иммунном ответе, что позволяет не только элиминировать патогены и клетки с измененными антигенными свойствами, но и оказывает значительное влияние на формирование адаптивного иммунитета [98, 120].
Влияние вакцин против гриппа на субпопуляционную структуру лимфоцитов периферической крови здоровых лиц в системе in vitro
Первым этапом исследований явилось изучение влияния вакцин на субпопуляционную структуру лимфоцитов в культуре МЛПК.
При подборе активирующей дозы вакцинного препарата в культуру МЛПК (106 кл/мл) вносили вакцины против гриппа в дозе 5, 10, 20 мкл. Вакцины в дозе 5 мкл в недостаточной степени активировали субпопуляции лимфоцитов (p 0,05 по сравнению с контролем) (рис. 1).
При введении в культуру МЛПК вакцин в дозе 20 мкл изменение субпопуляционной структуры было сопоставимо по сравнению с дозой 10 мкл (p 0,05) (рис. 3).
Таким образом, была подобрана активирующая доза каждого вакцинного препарата в 10 мкл. Рис. 3. Изменение субпопуляционной структуры лимфоцитов под воздействием вакцин против гриппа в дозе 20 мкл. Достоверность различий: p 0,05.
Добровольцы были разделены на 3 группы, в зависимости от исходного значения титров антител (АТ) к гемагглютинину вируса гриппа A/H1N1, A/H3N2 и В. Первая группа – низкий уровень АТ (титр 1:20-1:40), вторая группа – средний уровень АТ (1:80-1:160), третья группа – высокий уровень АТ (1:320 и ).
Наличие высокого титра антител свидетельствует о том, что непривитые добровольцы могли переносить гриппозную инфекцию под видом другой инфекции, хотя никто из них не подтверждал заболевание гриппом.
Результаты иммунофенотипирования показали изменение числа Т-лимфоцитов (СD45+/СD3+), NK(CD16+/56+), NKT (CD3+CD16/56+) клеток, В-лимфоцитов (СD45+/CD20+), а также активированных клеток (табл. 1).
Выявлены статистически значимые различия (F=8,00, p 0,001, q=0,001) распределения количества Т-лимфоцитов (CD45/СD3+) после инкубации в зависимости от типа вакцины (без учета уровня АТ) (табл. 1, рис. 4).
Следует отметить, что в группах в целом вакцины не оказывали существенного влияния на содержание Т-лимфоцитов, за исключением субъединичной вакцины, которая приводила к снижению числа Т-лимфоцитов (%) относительно контроля (культура без вакцины), но при этом абсолютное содержание их не менялось, что может свидетельствовать о смещении численности пула клеток за счет увеличения числа других популяций.
Сравнительная оценка содержания T-лимфоцитов в группах с вакцинами показала, что статистически значимое снижение численности клеток выявлялось только между контролем (79,8%) и субъединичной вакциной (71,2%) (p=0,008) (табл. 1, рис. 4). При этом различия по содержанию Т-лимфоцитов (СD3+) после инкубации в зависимости от типа вакцины наблюдались только у женщин со средним уровнем АТ (F=6,40, p=0,004, q=0,007). В этой группе выявлены статистически значимые различия между контролем (82,6%) и субъединичной вакциной (72%), p=0,022; контролем (82,6%) и сплит-вакциной (74,8%), p=0,022 (рис. 5).
Анализ также выявил существенную разницу (F=180,28, p 0,001, q 0,001) распределения процента естественных киллеров (NK, CD16/56+) после инкубации клеток в зависимости от типа вакцины (без учета уровня АТ) (табл.1, рис.4). В целом по группам отмечалось повышение содержания численности NK-клеток с 4,8% (контроль) под воздействием субъединичной (до 13,2%), иммуноадъювантной (до 17,2%), сплит (до 15%) вакцин. Выявлены статистически значимые различия между контролем (4,8%) и субъединичной вакциной (13,2%) (p 0,001), контролем (4,8%) и иммуноадьювантной вакциной (17,2%) (p 0,001), контролем (13,2%) и сплит-вакциной (15%) (p 0,001), субъединичной (13,2%) и иммуноадьювантной (17,2%) вакцинами (p 0,001), субъединичной (13,2%) и сплит-вакциной (15%) (p=0,003), иммуноадьювантной (17,2%) и сплит-вакциной (15%) - (p 0,001). То есть во всех культурах отмечалось повышение численности NK-клеток при культивировании их с вакцинами против гриппа.
При этом различия в содержании NK-клеток (CD16/56+) после инкубации МЛПК в присутствии вакцин наблюдались во всех группах добровольцев, независимо от изначальной концентрации АТ к вирусу гриппа в сыворотке крови (F=48,88, p 0,001, q 0,001 – низкий уровень АТ, F=103,04, p 0,001, q 0,001 – средний уровень АТ, F=89,09, p 0,001, q 0,001 – высокий уровень АТ) (рис. 5) У женщин с низким уровнем АТ к вирусу гриппа процент естественных киллеров (CD16/56+) после инкубации был статистически значимо выше в группе субъединичной (11%) (p=0,045), иммуноадьювантной (16,5%) вакцин (p=0,001) и сплит-вакцины (14,2%) (p=0,01) по сравнению с контролем (5%).
Иммуноадъювантная вакцина обладала более высоким потенциалом в отношении стимуляции численности NK-клеток (повышение в 3,3 раза) по сравнению с субъединичной вакциной (повышение в 2,2 раза) (p=0,017).
У женщин со средним уровнем АТ к вирусу гриппа в сыворотках крови процент естественных киллеров (CD16/56+) после инкубации крови с вакцинами статистически значимо повышался в группе субъединичной вакцины (до 12,8%) (p=0,001), иммуноадьювантной вакцины (до 17,5%) (p 0,001) и сплит-вакцины (до 15,3%) (p 0,001) по сравнению с контролем (4,8%). Соответственно, отмечалось повышение в 2,6 – 3,6 раз. Под воздействием иммуноадьювантной вакцины (17,5%) данный показатель повышался более значительно, чем под влиянием субъединичной вакцины (12,8%) (p=0,029) и сплит-вакцины (15,3%) (p=0,011), а в группе со сплит-вакциной (15,3%) NK клеток было больше, чем в группе с субъединичной вакциной (12,8%) (p=0,029).
У женщин с высоким уровнем АТ к вирусу гриппа в сыворотках крови содержание NK-клеток после инкубации статистически значимо повышались в группе субъединичной (14,8%, p=0,023), иммуноадьювантной (18,2%, p=0,046) вакцин и сплит-вакцины (16,1%, p=0,035) (соответственно, повышение в 3,3, 4,1 и 3,6 раз), по сравнению с контролем (4,4%). Между собой экспериментальные группы статистически значимо не различались.
В отношении содержания NKT-клеток (естественные киллерные Т лимфоциты, (CD3+CD16/56+) наблюдалась следующая картина. Выявлены статистически значимые различия (F=57,52, p 0,001, q 0,001) распределения NKT-клеток после инкубации в зависимости от типа вакцины (без учета уровня АТ): между контролем (1,6%) и субъединичной вакциной (3,6%) (p=0,006), контролем (1,6%) и иммуноадьювантной вакциной (7,5%) (p 0,001), контролем (1,6%) и сплит-вакциной (5%) (p 0,001), субъединичной (3,6%) и иммуноадьювантной (7,5%) вакцинами (p 0,001), субъединичной (3,6%) и сплит-(5%) вакцинами (p=0,007), иммуноадьювантной (7,5%) и сплит- (5%) вакцинами (p=0,006). Таким образом, субъединичная вакцина повышала численность NKT клеток 2,2 раза, иммуноадъювантная в 4,6 раз, а сплит-вакцина в 3,1 раз по сравнению с контролем (табл. 1, рис. 4).
Во всех культурах клеток с исследованными вакцинами увеличивалось содержание NKT-клеток (CD3+CD16/56+) в зависимости от изначального содержания АТ к вирусу гриппа у обследуемых женщин (F=22,08, p 0,001, q 0,001 – низкий уровень, F=20,02, p 0,001, q 0,001 – средний уровень, F=65,92, p 0,001, q 0,001 – высокий уровень) (рис. 5). У женщин с низким уровнем АТ к вирусу гриппа наблюдалось достоверное повышение численности NKТ-клеток (CD3+CD16/56+) in vitro под воздействием субъединичной вакцины (7%) (p=0,033), иммуноадьювантной вакцины (8,1%) (p=0,007), сплит-вакцины (5%) (p=0,005) по сравнению с контролем (1,6%). Между собой экспериментальные группы статистически значимо не различались.
У лиц со средним уровнем АТ к вирусу гриппа число NKТ-клеток в культуре МЛПК в присутствии иммуноадьювантной вакцины (7,4%) статистически значимо увеличивалось по сравнению с контролем (1,3%) (p 0,001) и субъединичной вакциной (3%) (p 0,001) (соответственно, повышение в 5,7 и в 2,5 раз) и в культуре со сплит-вакциной (4,4%) по сравнению с контролем (1,3%) (p 0,001) и субъединичной вакциной (3%) (p=0,009) (соответственно, повышение в 3,4 и в 1,5 раз).
У женщин с высоким уровнем АТ к вирусу гриппа процент естественных киллерных Т-лимфоцитов (CD3+CD16/56+) после инкубации статистически значимо был выше (в 4,6 раз) в группе иммуноадьювантной вакцины (7,4%) по сравнению с контролем (1,6%) (p=0,043).
Влияние вакцин против гриппа на содержание TLRs-экспрессирующих клеток у добровольцев в системе in vitro
Следующим этапом наших исследований явилась оценка содержания TLRs-экспрессирующих гранулоцитов добровольцев при инкубации клеток с вакцинами против гриппа.
Данные таблицы 5 демонстрируют, что все изучаемые вакцины оказывали иммуностимулирующее влияние на TLRs-экспрессирующие клетки, увеличивая содержание гранулоцитов с экспрессией TLR 2,3,4,6,8,9.
Нами выявлены статистически значимые различия (F=270,16, p 0,001, q 0,001) количества гранулоцитов (%), экспрессирующих TLR-2 (табл. 5, рис. 6) после инкубации клеток в зависимости от типа вакцины против гриппа (без учета уровня АТ к вирусу гриппа A/H1N1 и A/H3N2 и В в сыворотке крови): субъединичная вакцина повышала число TLR-2+ клеток в культуре МЛПК с 16,6% (контроль) до 38,2% (p 0,001), иммуноадъювантная – до 39,3% (p 0,001) и сплит-вакцина – до 37,5% (p 0,001). В то время как по влиянию на экспрессию TLR-2 клеток вакцины между собой существенно не отличались.
Добавление в культуру клеток вакцин против гриппа индуцировало повышение содержания TLR-2+ гранулоцитов независимо от изначального содержания АТ к вирусу гриппа в сыворотках крови у обследуемых лиц (F=53,25, p 0,001, q 0,001 – для низкого уровня АТ, F=169,63, p 0,001, q 0,001 – для среднего уровня АТ, F=103,89, p 0,001, q 0,001 – для высокого уровня АТ) (рис. 7).
У женщин с низким уровнем АТ к вирусу гриппа содержание гранулоцитов, экспрессирующих TLR-2, повышалось после инкубации их с субъединичной вакциной в 2,4 раза (ph=0,019), иммуноадьювантной – 2,3 раз (ph=0,019), сплит-вакциной – 2,2 раза (ph=0,003) по сравнению с контролем.
У женщин со средним уровнем АТ число данных клеток повышалось идентично под влиянием вакцин разного типа: субъединичной вакцины и сплит-вакцины в 2,3 раза (ph 0,001), иммуноадьювантной – 2,4 раза (ph=0,001) по сравнению с контролем.
У женщин с высоким уровнем АТ к вирусу гриппа численность гранулоцитов с экспрессией TLR-2 повышалось после инкубации с субъединичной вакциной в 2,6 раза (ph=0,031), иммуноадьювантной – 2,8 раз (ph=0,029), сплит-вакциной - 2,7 раза (ph=0,029) по сравнению с контролем.
Исследования выявили статистически значимые различия (F=10,62, p 0,001, q 0,001) в численности гранулоцитов, экспрессирующих TLR-4, после инкубации в зависимости от типа вакцины (без учета уровня АТ к вирусу гриппа в сыворотке крови добровольцев) (табл. 2, рис. 6): субъединичная вакцина индуцировала число клеток данного типа в 1,2 раз по сравнению с контролем (p 0,001) и в 1,1 раз – со сплит-вакциной (p 0,001).
Статистически значимые различия в численности гранулоцитов с TLR-4 (рис. 7) в зависимости от типа введенной в культуру вакцины наблюдались только у лиц со средним уровнем АТ к вирусу гриппа (F=5,24, p=0,008, q=0,010): численность гранулоцитов с экспрессией TLR-4 повышалась после инкубации с субъединичной вакциной в 1,1 раз по сравнению с контролем (ph=0,047) и 1,2 раза по сравнению со сплит-вакциной (p=0,007).
Оценка содержания TLR-3-экспрессирующих гранулоцитов (табл. 5, рис. 6), в индуцированной вакцинами культуре показала статистически значимые различия (F=6,90, p 0,001, q 0,001) между опытными группами, то есть активация эффекторов врожденного иммунитета определялась типом вакцины против гриппа (без учета уровня АТ). Были выявлены статистически значимые различия между контролем и сплит-вакциной (повышение в 1,2 раза, p=0,001); субъединичной и сплит-вакциной (повышение в 1,2 раза, p=0,008). Было выявлено, что активность сплит-вакцины была выше.
У лиц с низкими и высокими концентрациями АТ к вирусу гриппа в сыворотке крови отмечались статистически значимые различия в содержании TLR-3-экспрессирующих клеток (рис. 7). Значимость различий для низкого уровня АТ составила (F=6,05, p=0,025, q=0,030) и высокого уровня АТ (F=6,45, p=0,008, q=0,010). У женщин с низким и высоким уровнем АТ к вирусу гриппа процент гранулоцитов, экспрессирующих TLR-3, после инкубации существенно повышался под воздействием сплит-вакцины (в 1,3 раза, соответственно, ph=0,042; ph=0,050) по сравнению с контролем.
Исследования также показали (табл.5, рис.6), что вакцины разного типа оказывали влияние (F=86,57, p 0,001, q 0,001) на содержание TLR-9 позитивных клеток (без учета уровня АТ в сыворотках крови обследуемых). Все изучаемые вакцины при добавлении их в культуру МЛПК повышали число TLR-9 позитивных гранулоцитов. Активность субъединичной вакцины была выше контроля в 1,6 раз (p 0,001), иммуноадьювантной вакцины – в 2,1 раз (p 0,001), сплит-вакцины – в 2,2 раза (p 0,001). Активность субъединичной вакцины уступала активности иммуноадьювантной вакцины в 1,2 раза (p=0,012) и сплит-вакцины – в 1,3 раза (p=0,003).
Нами было установлено, что у лиц с разным уровнем АТ (рис. 7) содержание TLR-9 позитивных клеток отличалось в зависимости от типа введенной в культуру вакцины (F=26,93, p 0,001, q 0,001 – для низкого уровня АТ; F=39,81, p 0,001, q 0,001 – для среднего уровня АТ; F=29,41, p 0,001, q 0,001 – для высокого уровня АТ). Сплит-вакцина в 3 раза активней индуцировала повышение численности TLR-9+ гранулоцитов по сравнению с нестимулированной культурой (ph=0,002) в группе лиц с низким уровнем АТ. В то время как остальные вакцины у женщин со средним и высоким уровнем АТ также проявляли стимулирующее воздействие на TLR-9+ гранулоциты. Эти различия распределялись следующим образом: активность субъединичной вакцины в 1,6 раз была выше контрольных значений (ph=0,017, ph=0,050), иммуноадьювантной вакцины – в 2 раза и в 1,8 раз (ph 0,001, ph=0,040), а сплит-вакцины – в 2,3 раза и в 1,8 раз (ph 0,001, ph=0,050), соответственно, у лиц со средним и высоким титром АТ.
Интересные данные были получены в отношении TLR-8-экспрессирующих клеток (табл. 5, рис. 6). Этот рецептор играет важную роль в распознавании одноцепочечной РНК вирусов. Исследования выявили существенное нарастание численности этих клеток в культуре МЛПК в зависимости от типа внесенной вакцины против гриппа (F=138,59, p 0,001, q 0,001). Все вакцины индуцировали нарастание численности TLR-8-позитивных гранулоцитов. Количество этих клеток при введении субъединичной вакцины возрастало в 1,6 раз (p 0,001), иммуноадьювантной вакцины в 2 раза (p 0,001), сплит-вакцины в 1,7 раз (p 0,001) по сравнению с контрольными образцами. Активность иммуноадъювантной вакцины была выше активности субъединичной в 1,3 раза (p 0,001), и сплит-вакцины в 1,2 раза (p 0,001).
Оценка формирования клеток памяти у добровольцев через 12 мес. после применения различных вакцинных препаратов против вируса гриппа с помощью CD45RO-теста
Как видно из рисунка 12, лица до вакцинации имели приблизительно одинаковые значения коэффициента активации (0,049-0,058) при инкубации с исследуемыми вакцинами.
Через 12 месяцев в группе вакцинированных субъединичной вакциной коэффициент активации CD45RO-клеток при инкубации с разными вакцинами был ниже порога значимости, что свидетельствует о недостаточном формировании клеток памяти у данных лиц.
Показатели в группе лиц, иммунизированных сплит-вакциной, преодолевали порог значимости (0,2 у.е.) при инкубации лимфоцитов в присутствии иммуноадъювантной вакциной (0,222) и сплит-вакциной (0,234).
Наиболее высокие показатели были отмечены у лиц, вакцинированных иммуноадъювантной вакциной. Индекс активации составил 0,212; 0,347; 0,267 у.е., соответственно, при инкубации клеток с субъедничной, иммуноадъювантной, сплит-вакциной. Это свидетельствует о формировании иммунологической памяти у лиц, вакцинированных данными вакцинами. При этом самый высокий показатель отмечен в группе лиц, вакцинированных иммуноадъювантной вакциной при инкубации лимфоцитов в присутствии одноименной вакцины (0,347 у.е.).
Таким образом, иммунизация добровольцев иммуноадъювантной и сплит-вакциной индуцирует формирование клеток иммунологической памяти.
Вакцинация против гриппа является единственным доказанным безопасным методом профилактики данной инфекции у людей. Учитывая, что инактивированные вакцины против гриппа обладают рядом недостатков, например, сниженная эффективность для определенных категорий пациентов [111, 192, 206], низкая кросс-протективность [101, 163], возникает необходимость усовершенствования технологии производства вакцин. Разработка новых вакцин требует детального изучения клинической безопасности и иммунологической эффективности. До настоящего времени иммуногенность вакцин против гриппа оценивалась в основном по параметрам гуморального иммунитета без должного внимания относительно оценки клеточных механизмов иммунного ответа.
В НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (г. Москва) ведутся исследования по поиску адъювантнов для улучшения свойств вакцин против гриппа с оценкой их влияния на ключевые эффекторы врожденного и адаптивного иммунитета у мышей [76]. В литературе также имеются данные, где показано влияние адъювантов на активацию маркеров клеточного звена иммунитета [118, 187, 196].
В России, в отличие от зарубежных производителей, разработана и давно применяется на практике полимер-субъединичная вакцина против гриппа, в которой в качестве адъюванта используется Азоксимера бромид. До настоящего времени все исследования, касающиеся применения данного вакцинного препарата касались в основном изучения клинической безопасности, влияния на формирование протективных антител у здоровых и пациентов с различными отклонениями в состоянии здоровья [29, 45, 70].
Показано отсутствие отрицательного влияния вакцинации против гриппа на течение хронических заболеваний, а также формирование полноценного поствакцинального иммунитета при введении данной вакцины в сочетании с другими вакцинными препаратами [2, 23, 30, 31, 32, 33 ,34 ,38, 53, 50]. Однако комплексных иммунологических исследований по изучению действия иммуноадъювантной вакцины на эффекторы врожденного и адаптивного иммунитета не проводилось. К тому же, данные по изучению этих механизмов при использовании безадъювантных вакцин носят фрагментарный характер.
Одно из первых исследований в этом направлении изложено в работе Соколовой Т.М., где показано разнонаправленное действие инактивированных вакцин против гриппа на активность генов врожденного и адаптивного иммунитета in vitro [59]. Так же in vitro в крови человека изучено влияние иммуномодулятора Рибонуклеат Натрия в сочетании с вакцинами против гриппа, при котором отмечена стимуляция генов-рецепторов врожденного и адаптивного иммунитета и основных иммунорегуляторных факторов [60]. Но оценка влияния на эффекторы врожденного и адаптивного иммунитета, в особенности с акцентом их действия на клеточные реакции иммунного ответа, осталась неизученной.
В качестве объекта исследования были отобраны вакцины против гриппа разного типа: инактивированная субъединичная, инактивированная полимер-субъединичная иммуноадъювантная и инактивированная сплит-вакцина.