Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современные представления о механизмах агрегации тромбоцитов и феномене аспиринорезистентности 13
1.1 Биогенез тромбоцитов и их участие в регуляции свертывания крови 13
1.2 Изменения в системе тромбоцитарного гемостаза при хронических миелопролиферативных опухолях 19
1.3 Применение ацетилсалициловой кислоты при хронических миелопролиферативных опухолях 26
1.4 Современные представления о причинах и механизмах развития резистентности к ацетилсалициловой кислоте 30
1.5 Лабораторная диагностика резистентности к ацетилсалициловой кислоте 33
Глава 2 Материалы и методы 39
2.1. Объект исследования 39
2.2 Методы исследования 41
2.2.1 Исследование агрегации тромбоцитов 41
2.3. Методы статистического анализа данных 44
Глава 3 Результаты исследований 46
3.1 Оптимизация метода импедансной агрегометрии в оценке индивидуальной чувствительности к АСК 46
3.1.1 Выбор оптимальной концентраций АСК для анализа индивидуальной чувствительности 46
3.1.2 Метод импеданс-люминесцентной агрегометрии в определении чувствительности тромбоцитов к ацетилсалициловой кислоте 50
3.1.3 Влияние выбора ингибитора свертывания крови на агрегацию тромбоцитов и эффект АСК in vitro 54
3.1.4 Оценка биологической вариации результатов импедансной агрегометрии тромбоцитов 57
3.2 Особенности влияния АСК на функциональную активность тромбоцитов у больных хроническими миелопролиферативными опухолями 67
3.2.1 Влияние ингибитора JAK на агрегацию тромбоцитов 73
Заключение 76
Выводы 78
Практические рекомендации 78
Перспективы дальнейшей разработки темы 79
Список литературы 80
- Изменения в системе тромбоцитарного гемостаза при хронических миелопролиферативных опухолях
- Лабораторная диагностика резистентности к ацетилсалициловой кислоте
- Оценка биологической вариации результатов импедансной агрегометрии тромбоцитов
- Влияние ингибитора JAK на агрегацию тромбоцитов
Изменения в системе тромбоцитарного гемостаза при хронических миелопролиферативных опухолях
Сосудистый тромбоз и геморрагические осложнения определяют доминирующие симптомы и причины смерти больных при хронических миелопролиферативных опухолях [Manoharan A., Gemmell R., Brighton T. et al., 1999; Шмелева В.М., Абдулкадыров К.М., Бессмельцев С.С., 2012]. В соответствии с обновленными критериями ВОЗ для уточнения вариантов Ph-негативных ХМО рекомендован тест определения мутаций в гене JAK2 и в гене MPL [Tefferi A., Thiele J., Orazi A. et al., 2007]. Мутация V617F в гене JAK2 выявляется в 90–95% случаев истинной полицитемии, 50–70% случаев эссенциальной тромбоцитемии (ЭТ), 40– 50% случаев миелофиброза [Haferlach T., Bacher U., Kern W. et al., 2008]. Ген JAK2 кодирует тирозинкиназу, участвующую в передаче сигнала от рецепторов цитокинов и факторов роста к ядру клетки. Мутация V617F вызывает конститутивную активацию рецептора без участия лиганда, что приводит к активации пролиферации клетки и блокаде процессов апоптоза [Levine R.L., Wadleigh M., Cools J. et al., 2005].
Мутация в гене рецептора тромбопоэтина (MPL) встречается всего в 5-10% случаев ЭТ и ПМФ [Tefferi A., 2015]. В конце 2013 года двумя независимыми группами исследователей была открыта мутация в гене кальретикулина (CALR), которая встречается в 20-30% случаев JAK2-отрицательных ЭТ и ПМФ [T. Klampfl, H. Gisslinger, A.S. Harutyunyan et al., 2013; Nangalia J., Massie C.E., Baxter E.J. et al., 2013]. Недавние исследования показали, что клинические проявления у пациентов ЭТ с мутацией в гене JAK2 и в гене CALR отличаются: мутация CALR характеризуется более высоким тромбоцитозом, но при этом значительно меньшим риском возникновения тромботических осложнений [Rumi E., Pietra D., Ferretti V. et al., 2014; Gangat N., Wassie E.A., Lasho T.L. et al., 2015; Al Assaf C., Van Obbergh F., Billiet J. et al., 2015]. В расширенной группе пациентов с ЭТ Rotunno G. et al. обнаружил, что частота тромбозов составляла 13,5% в группе пациентов с мутацией CALR и 30,1% среди пациентов с JAK2V617F (p=0,011) [Rotunno G., Mannarelli C., Guglielmelli P. et al., 2014]. Предполагается, что увеличение активации лейкоцитов и образование тромбоцитарно-лейкоцитарных комплексов может являться дополнительным фактором увеличения риска тромбозов, наряду с увеличением количества тромбоцитов [Arellano-Rodrigo E., Alvarez-Larrn A., Reverter JC et al., 2006].
Качественные дефекты тромбоцитов могут способствовать гемостатическим нарушениям, наряду с увеличением вязкости цельной крови или повышенным количеством тромбоцитов [Landolfi R., Gennaro L., Falanga A., 2008]. Показано, что у 29% больных ИП и у 14% пациентов с диагнозом ЭТ возникают тромбозы различной локализации, а кровотечения наблюдаются в 11% случаев ЭТ, 7% случаев ИП и 17% случаев ПМФ [Duangnapasatit B., Rattarittamrong E., Rattanathammethee T. et al., 2015]. В большом метаанализе 11 ретроспективных исследований, включающих 800 пациентов с ЭТ, установлено, что бессимптомное течение ЭТ характерно лишь для 21,6% пациентов, а наиболее распространены различные микроциркуляторные нарушения [Griesshammer M., Bangerter M., van Vliet H.H. et al., 1997] (таблица 1).
Патогенез микрососудистых нарушений при ЭТ связан с дефектом генерации тромбоксана А2 и взаимодействием тромбоцитов с эндотелием. Патогенез тромбозов и кровотечений при ЭТ не так хорошо изучен. Предполагается, что их основные механизмы могут включать нарушения функций гранулоцитов, тромбоцитов и эндотелиальных клеток. Показано, что при ЭТ и ИП увеличивается экспрессия тканевого фактора нейтрофилами и количество комплексов тромбоцит-нейтрофил, циркулирующих в кровотоке [Maugeri N., Malato S., Femia E.A., 2011]. Тромбоциты при ХМО, как правило, гипогранулярны, гетерогенны по размеру, а иногда могут быть найдены и фрагменты циркулирующих в периферической крови мегакариоцитов. Указывается и на многочисленные нарушения функции тромбоцитов, выявляемые в лабораторном тесте агрегометрии. Нарушения эти, как правило, в разной степени выражены при индукции разными агонистами агрегации и использовании разных методов детекции. Хорошо известно снижение параметров оптической агрегометрии тромбоцитов при индукции агрегации адреналином, которые связанные с дефектом 2-адренорецепторов тромбоцитов. Среди причин нарушения агрегации тромбоцитов при ХМО выделяют следующие: нарушения метаболизма арахидоновой кислоты, дефекты гранул, снижение количества 2-адренэргических рецепторов, нарушения структуры специфических мембранных рецепторных гликопротеинов, таких как ГП IIb/IIIa, ГП Ib, ГП IX, приобретенный синдром Виллебранда [Avram S., Lupu A., Angelescu S. et al., 2001; van Genderen P.J., Leenknegt H., Michiels J.J. et al., 1996]. Также показано, что увеличение экспрессии Р-селектина, тромбоспондина, активированных рецепторов фибриногена на тромбоцитах коррелируют с вероятностью возникновения тромбозов [Vianello F., Battisti A., Cella G. et al., 2011]. Кроме того, отмечается, что тромбоциты при ХМО имеют тенденцию к спонтанной агрегации вследствие повышенной экспрессии гликопротеинов [Jensen M.K., de Nully Brown P., Lund B.V. et al., 2000].
По данным A. Manoharan около 36% пациентов с ХМО, имеющих нарушенную агрегацию в тесте импеданс-люминесцентной агрегометрии имели также и клинические симптомы, связанные с тромбозами различного генеза [Manoharan A., Gemmell R., Brighton T. et al., 1999]. У пациентов с вторичным тромбоцитозом не был повышен риск как кровотечений, так и тромбозов, что может быть обусловлено тем, что тромбоциты при ХМО имеют внутренние функциональные нарушения: аномальная агрегация, дефекты гранул хранения, аномальная экспрессия поверхностных рецепторов и нарушение метаболизма арахидоновой кислоты. В исследовании H. Chang с соавт. при использовании метода проточной цитометрии было обнаружено нарушение функционирования АДФ-индуцированного сигнального пути у пациентов с ХМО [Chang H., Shih L.Y., Michelson A.D. et al., 2013].
В основе патогенеза кровотечений при ХМО лежат такие факторы, как тромбоцитопения при ПМФ, патологический тромбоцитоз с качественными нарушениями тромбоцитов, приобретенный синдром Виллебранда, прием антикоагулянтов и дезагрегантов [McMahon B., Stein B.L., 2013.].
Распространенность инсультов среди пациентов с ХМО составляет 3-8% [Ong E., Barraco F., Nighoghossian N. et al., 2016]. Показано, что пациенты с ХМО и инсультами имеют повышенную вероятность развития рецидивирующих тромбозов [Martinelli I., De Stefano V, Carobbio A. et al., 2014]. Участие тромбоцитов в развитии центральной ишемии предполагали Denny-Brown, Russell, и Hollenhorst ещё в 1960-х гг. Существует немало доказательств гиперагрегационного состояния тромбоцитов у пациентов с атеросклерозом, ишемической болезнью сердца, сахарным диабетом, гиперхолистеринемией и гипертонией [Willoughby S., Holmes A., Loscalzo J., 2002]. Тромбоциты вовлечены в патогенез и прогрессирование атеросклеротического поражения. Активированные тромбоциты, высвобождая из гранул тромбоцитарный фактор роста, провоспалительные молекулы, обеспечивают миграции и пролиферацию клеток гладких мышц и макрофагов [Badimon J.J., Meyer B., Feigen L.P. et al., 1997], что облегчает окклюзию кровеносного сосуда.
Лабораторная диагностика резистентности к ацетилсалициловой кислоте
Методы оценки агрегации тромбоцитов были разработаны в начале 1960г. Это по-прежнему наиболее широко используемый тест в клинических лабораториях для идентификации и диагностики дефектов тромбоцитов. Вместе с тем, ни один существующий лабораторный метод определения аспиринорезистентности до сих пор не является общепризнанным. Важно отметить, что стимуляция тромбином, АДФ, коллагеном и эпинефрином может активировать тромбоциты в присутствии полной блокады ЦОГ-1. Поэтому методы, в которых используют последние агонисты, не могут служить в качестве оценки степени ингибирования ЦОГ-1 АСК, так называемые: «ЦОГ-1 неспецифические методы». Методы измерения сывороточного ТХВ2 или оценка индуцированной арахидоновой кислотой агрегации тромбоцитов, указывают на активность ЦОГ-1 и определяются как «ЦОГ-1 специфические методы» [Michelson A. D., 2013].
Оптический метод агрегометрии до сих пор рассматривается как «золотой стандарт» тестирования функций тромбоцитов, т.к. он с его помощью можно выявлять широкий спектр наследственных нарушений функции тромбоцитов. При оценке эффективности дезгрегантной терапии преимуществом световой агрегометрии является то, она позволяет проводить оценку непосредственного влияния агонистов и ингибиторов тромбоцитарных рецепторов и исследования их влияния на биохимические процессы в изолированных тромбоцитах. Серьезным недостатком оптического теста является то, что перед проведением тестирования тромбоциты искусственно отделяют от взаимодействия с другими клетками крови также участвующих в процессе тромбообразования, что не позволяет полностью воспроизводить условия in vivo. Кроме того, вещества, которые регулируют функцию тромбоцитов – простациклин, циклический АМФ - могут деградировать до биологически неактивных продуктов во время центрифугирования.
Позже был разработан и ряд альтернативных методов, основанных на измерении агрегации в цельной крови, в их числе импедансный агрегометр и полностью автоматизированный прибор на картриджной основе VerifyNow. Система VerifyNow (ITC, Эдисон, Нью-Джерси, США) состоит из устройства, которое оценивает агрегацию тромбоцитов в цельной крови с помощью турбодиметрического метода с использованием картриджа, содержащего шарики, покрытые фибриногеном и агонистами агрегации тромбоцитов. Метод основан на способности активированных тромбоцитов связываться с фибриногеном: тромбоциты агрегируют на покрытых фибриногеном бусинах пропорционально числу активированных рецепторов гликопротеина IIb/IIIa. Использование этой замкнутой системы не требует никаких манипуляций с кровью и подготовки инструмента: методология используется для мониторинга антиагрегантной терапии в неотложной кардиологии без участия специализированной лаборатории [Paniccia R., 2015]. Вместе с тем, картридж для определения чувствительности агрегации к АСК основан на использовании арахидоновой кислоты в качестве индуктора, что не позволяет делать выводы о ЦОГ-независимых процессах развития резистентности к АСК.
Импедансный метод в цельной крови имеет много существенных преимуществ, в том числе: использование более низких объемов проб и немедленный анализ без манипуляций центрифугирования, исключение потенциальной потери субпопуляции тромбоцитов или активации тромбоцитов во время центрифугирования. Комбинированное измерение в цельной крови с люминесценцией также помогает определить вторичный ответ агрегации или реакцию высвобождения и должен быть теоретически более чувствительным, чем только оптический метод для быстрого обнаружения дефектов хранения или высвобождения и нарушений синтеза тромбоксана. Импедансный метод может также обнаружить антиагрегационную активность различных агентов, не действующих в обогащенной тромбоцитами плазме (например, дипиридамол) [Michelson A.D., 2004].
Наименее специфичным показателем ЦОГ-1 активности является анализатор функции тромбоцитов PFA-100, в котором используется стимуляция с коллагеном и эпинефрином при высокой скорости сдвига. Результат этого теста зависит от уровня фактора Виллебранда, от группы крови АВО, лейкоцитов и тромбоцитов. В ряде исследований было обнаружено, что значительное число как пациентов контрольной группы, так и пациентов, клинически резистентных к АСК, не были таковыми при использовании картриджа, содержащего коллаген и эпинефрин (CEPI), на анализаторе PFA-100 в ответ на АСК [Andersen K., Hurlen M., Arnesen H. et al., 2002; Sambola A., Heras M., Escolar G. et al., 2004; Coakley M., Self R., Marchant W. et al., 2005].
Сравнение оптического теста с VerifyNow-Aspirin и PFA-100, проведенное на 100 пациентах, перенесших инсульт и принимающих низкие дозы АСК показало, что количество неотвечающих на АСК было не только выше в последних двух тестах, но и корреляция между этими тремя тестами была крайне низкой [Harrison P., Segal H., Blasbery K. et al., 2005].
В последние 20 лет анализ тромбоцитов с использованием проточной цитометрии стал мощным и популярным инструментом для изучения многих аспектов биологии и функции тромбоцитов. Действие различных дезагрегантов может быть обнаружено с помощью соответствующих агонистов в сочетании с маркерами активации [Сироткина О.В., Боганькова Н.А., Ласковец А.Б. и др., 2010]. Вместе с тем, в цитометрическом тесте используются пробы предварительно разведенной крови или «богатой тромбоцитами» плазмы, что в определенной степени также снижает идентичной теста условиям in vivo. Высокая стоимость прибора ограничивает доступность теста для пациентов в отдаленных районах. Тромбоэластография позволяет оценивать многие параметры образования и лизиса сгустка. При использовании этого метода в исследовании CABG было выявлено 30% резистентных к АСК [Poston R.S., Gu J., Prastein D. et al., 2004].
Существующие методы оценки чувсвтительности к АСК подвергались многократным сравнительным исследованиям для определения наиболее оптимального метода. Gum с соавт. исследовали аспиринорезистентность по ответу тромбоцитов на разные агонисты агрегации – АДФ, арахидоновая кислота – у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, получающими АСК в дозе 325 мг/сут. При этом 5,5% не отвечали на АСК, 24% имели частичный ответ, в то время как при анализе на PFA-100 было выявлено 9,5% не отвечающих на АСК [Gum P.A., Kottke-Marchant K., Poggio E.D. et al., 2001]. Lordkipanidze с соавт. сравнил 6 методов обнаружения аспиринорезистентности у 201 пациента с ИБС. Наблюдалась очень слабая корреляция между методами и широкий диапазон распространенности, в зависимости от анализа: 4% в оптическом методе при индукции арахидоновой кислотой, 10,3% - 51,7% оптический метод с АДФ, 6,75% в VerifyNow Aspirin, 18,0% в импедансе с цельной кровью и 59,5% с PFA-100 [Lordkipanidz M., Pharand C., Schampaert E. et al., 2007].
Учитывая сложность путей активации тромбоцитов и слабую корреляцию между методами, были разработаны комбинированные критерии резистентности к АСК на основе оценки нескольких параметров. В недавнем исследовании Sane и соавт. [Sane D.C., McKee S.A., Malinin A.I. et al., 2002] резистентность к АСК регистрировалась при условии выполнения 4-х из следующих 5 критериев: коллаген–индуцированная агрегация более 70%; АДФ-индуцированная агрегация более 60%; агрегация в цельной крови более 18 Ом; экспрессия ГП IIa / IIIa более 220 флуоресцентных единиц. Даже с этим весьма строгим критерием, Sane с соавт. обнаружили резистентность к АСК у 55% пациентов с сердечной недостаточностью. Напротив, в другом скрининговом исследовании резистентности к АСК у пациентов, получающих низкие дозы препарата после ТИА или ишемического инсульта установлено, что распространенность резистентности была 17% с использованием VerifyNow, 22% при анализе на PFA-100, 5% по данным оптический агрегометрии, и только 2% при комбинации этих тестов [Harrison P., Segal H., Blasbery K. et al., 2005].
В то же время существуют исследования, результаты которых ставят под сомнение использование арахидоновой кислоты в качестве индуктора, позволяющего выявить ЦОГ-зависимую аспиринорезистентность. Показано, что у многих пациентов активация тромбоцитов может происходить через независимые от ЦОГ-1 пути при использовании индуктора арахидоновой кислоты [Olechowski B., Ashby A., Mariathas M. et al., 2017]. В ходе исследования пациентов с инсультами было показано, что более, чем у половины наблюдалось ингибирование агрегации при индукции арахидоновой кислотой, однако у всех пациентов уровень TXB2 снижался ниже 10 нг/мл, что свидетельствует о полном ингибировании работы ЦОГ-1 [Olechowski B., Ashby A., Mariathas M. et al., 2017].
Особый интерес представляет работа Ivandic BT и соавт., в которой была использована импедансная агрегометрия с инкубацией образцов цельной крови in vitro с АСК. Показано отличие частот встречаемости АР при использовании разных индукторов, а также более высокие значения коллаген-индуцированной агрегации у женщин по сравнению с мужчинами [Ivandic B.T., Giannitsis E., Schlick P. et al., 2007]. В работе Abdullah W.Z. и соавт. обнаружена корреляция методов оптической и импедансной агрегации в обнаружении резистентных, чувствительных и частично резистентных к АСК пациентов [Abdullah W.Z., Bakar S.A., Wan Mohd Zain W.S. et al., 2013].
Оценка биологической вариации результатов импедансной агрегометрии тромбоцитов
Для оценки межиндивидуальной вариации (CVG) параметров агрегометрии, а также для расчёта референсных интервалов в настоящее исследование включены данные обследования 89 клинически здоровых добровольцев (55 женщин и 34 мужчины в возрасте от 18 до 55 лет). Характеристика обследованных групп приведена в таблице 10.
При анализе агрегационной активности в течение 3 часов после взятия крови была установлена вариабельность амплитуды агрегации как без АСК, так и на фоне инкубации с АСК in vitro (рисунок 4). Хотя амплитуда агрегации имела тенденцию к более низким значениям в первые 30 мин после взятия крови, статистически значимых отличий между параметрами агрегации, измеренными через другие интервалы времени, не было выявлено (p 0,05). Поэтому можно утверждать, что в целом в течение времени, рекомендованного для измерения агрегации (3 часа), амплитуда агрегации до и после инкубации с АСК изменялась незначительно, являясь устойчивой характеристикой агрегации в in vitro тесте. Следует отметить, что поскольку АСК в подавляющем большинстве всех случаев полностью ингибировала агрегационный ответ на арахидоновую кислоту, тест инкубации с АСК при использовании индуктора АДФ в наших постановках отражает ЦОГ-независимые механизмы агрегации тромбоцитов. Рисунок 4 – Временная динамика амплитуды агрегации до и после инкубации с АСК
В результате проведенных исследований были обнаружены гендерные различия агрегации тромбоцитов: у женщин все параметры агрегации тромбоцитов значительно выше, а эффект АСК у них был в два раза меньше, чем у мужчин (таблица 11). Статистическая оценка необходимости стратификации референсных интервалов АДФ-индуцированной агрегации проведенная с использованием метода, рекомендованного NCCLS подтвердила необходимость стратификации регистрируемых параметров по полу (Z=3,6; Zкрит=1,3 так как Z Zкрит).
Согласно критерию нормальности Шапиро-Уилка, исследуемая выборка имела нормальное распределение параметров агрегации до инкубации с АСК как для мужчин, так и для женщин, в то время как после инкубации с АСК распределение, не зависимо от пола, отличалось от нормального (рисунок 5). Согласно критерию Граббса выпадающих значений в исследуемой выборке обнаружено не было.
Корреляционный анализ связи параметров агрегации с количеством клеток периферической крови показал присутствие лишь слабой взаимосвязи между этими величинами (r 0,5, p 0,05). Следовательно, у здоровых лиц интенсивность агрегации обусловлена в большей степени качественным состоянием тромбоцитов, а не их количеством. Из результатов оценки внутрииндивидуальной вариации параметров агрегометрии, представленных на рисунке 6, следует, что амплитуда агрегации большинства здоровых лиц изменяется во времени, и лишь в 32% случаев результат полностью совпадал с предыдущим измерением. Также следует отметить, что ни у одного из обследованных разброс значений не покрывает весь референсный интервал, что является важным основанием для ограничения применимости референсных интервалов для разделения нормы и патологии.
Значение эффекта АСК, измеренного в тесте in vitro (рисунок 7), у 25% здоровых лиц не изменилось через 2 недели, однако у 15% обследованных отмечалась достаточно широкая внутрииндивидуальная вариация этого параметра (изменение превышало CVa), что свидетельствует о наличии неучтенных факторов, влияющих на результат измерения чувствительности к АСК в нашей выборке добровольцев. Такие факторы могут быть связаны как с биологическими особенностями тромбоцитарной реактивности (например, смена доминирующих клонов мегакариоцитов костного мозга, доли тромбоцитов, генерируемых в легочной ткани и т.д.), так и с неоднородностью гормонального фона, диеты, физической нагрузки и т.д., что не контролировалось в настоящем исследовании, как требуют строгие рекомендации К. Г. Фрейзер [Фрейзер К.Г., 2010]. Вместе с тем, полученные результаты позволили определить границы возможных индивидуальных отклонений в результатах АСК теста в реальной популяции клинически здоровых людей.
В среднем, внутрииндивидуальная вариация амплитуды агрегации составила 5,8%, а на фоне инкубации с АСК она увеличилась в 4 раза (таблица 12). В целом, CVI для всех параметров агрегации после инкубации с АСК был значительно выше, чем до инкубации, что может быть связано как с увеличением аналитической ошибки теста in vitro, так и с индивидуальными особенностями (вариабельности) реакции тромбоцитов на АСК. В исследовании Singh S. с соавт. [Singh S., Kothari S.S., Bahl V.K., 2003] отмечается, что ингибирование агрегации представляет собой многогранный процесс, и существуют значительные внутри- и межиндивидуальные вариации в эффекте АСК при приеме per os. Очевидно, что при измерении эффекта АСК in vitro, наблюдается похожий феномен и для оценки эффективности АСК наиболее оптимальным является подход, основанный на измерении эффекта АСК с учетом его индивидуальной вариации. Рисунок 7 – Внутрииндивидуальная вариация эффекта АСК у 20 здоровых добровольцев. Ромбами отмечены совпадающие значения эффекта АСК.
Коэффициент межиндивидуальной вариации параметров агрегации у мужчин был значительно больше, чем у женщин (таблица 12). Кроме того, для мужчин этот параметр на фоне инкубации с АСК увеличивался почти в два раза.
Дисперсионный анализ показал, что пол оказывает статистически значимое влияние на межиндивидуальную дисперсию показателей агрегации как до инкубации с АСК (F=19,4, р 0,001), так и после (F=28,0, p 0,001); в группе мужчин показатель дисперсии был больше, чем в группе женщин.
Аналитическая вариация параметров агрегации была в диапазоне от 12 до 20%, что согласуется с данными, опубликованными для прибора Multiplate [Seyfert U.T., Haubelt H., Vogt A. et al., 2007].
Из таблицы 12 видно, что CVI для всех показателей агрегометрии был значительно меньше, чем CVG. Лабораторные тесты, для которых соблюдается данное условие, характеризуются понятием «высокоиндивидуальные», которое можно оценить количественно с помощью «индекса индивидуальности». В соответствии с данными таблицы 3, ИИ для всех параметров импедансной агрегометрии оказался ниже 0,6, что свидетельствует о высокой индивидуальной вариабельности показателей и теоретически ограничивает применение референсных интервалов в импедансной агрегометрии. Следует отметить, что в доступных базах данных отсутствует универсальные интервалы значения CVI для агрегометрии, а необходимость вычисления этого критерия в каждой лаборатории влечет за собой неточности, связанные с разным уровнем контроля за референсными индивидуумами (контроль за питанием, физической нагрузкой, приемом лекарств и т.д.), что может оказывать значительное влияния на величину CVI и, вследствие этого, могут возникать различия в других расчетных критериях.
Весьма конструктивным представляется подход, предложенный К. Фрейзером, основанный на расчете критической разницы результатов двух повторных измерений лабораторного показателя (RCV), которая является альтернативой референсному интервалу для обеспечения мониторинга состояния пациента [Фрейзер К.Г., 2010]. При расчете RCV для параметров агрегации (таблица 12) было получено, что только при изменении амплитуды агрегации не менее чем на 27% при повторном обследовании можно говорить о действительно значимой динамике. Следует отметить, что относительно высокий уровень RCV для параметров, измеренных на фоне инкубации с АСК in vitro, связан, прежде всего, с их более высокой межиндивидуальной вариацией. Значение RCV для метода определения аспиринорезистентности после инкубации с АСК in vitro означает, что лишь при изменении амплитуды агрегации после инкубации с АСК на 48,2% и более по сравнению с исходным уровнем, можно делать вывод, что тромбоциты исследуемого пациента действительно чувствительны к АСК. Данная граница может быть использована для выявления лиц с лабораторной ЦОГ-независимой резистентностью к АСК in vitro. Этот термин мы предлагаем использовать наряду с другими определениями, характеризующими феномен нечувствительности к АСК [Agayeva N., Gungor L., Topcuoglu M.A. et al., 2015; Abdullah W.Z., Bakar S.A., Wan Mohd Zain W.S. et al., 2013] для оценки патогенетической природы пониженной чувствительности к АСК.
Влияние ингибитора JAK на агрегацию тромбоцитов
Для исследования влияния ингибитора JAK на агрегацию тромбоцитов было сформировано две группы: группа контроля, состоящая из 12 человек и группа пациентов с подозрением на ХМО, состоящая из 41 человека (таблица 18). Из пациентов с подозрением на ХМО 30 пациентов имели соматические мутации, из них 5 человек имели мутацию в гене CALR, у 1 пациента была выявлена мутация в гене MPL, остальные были с мутацией JAK2 V617F.
При сравнении показателей агрегации в исследуемых группах, было обнаружено, что ни у одного из пациентов с мутацией в гене CALR не было значительного снижения агрегации ингибитором JAK, в то время как в остальных исследуемых группах наблюдались пробы, агрегация в которых снижалась при добавлении ингибитора более чем на 45% от исходного уровня. Почти у всех шести пациентов с аллельной нагрузкой JAK2 V617F более 50% наблюдается значительное (более 45% от начального уровня) снижение амплитуды агрегации после добавления ингибитора JAK (рисунок 8). Среди пациентов с аллельной нагрузкой менее 50% такой эффект наблюдался только в 27% проб, что более чем в три раза меньше, чем при аллельной нагрузке менее 50% (2=3,9; р=0,04).
Ингибирование агрегации тромбоцитов после добавления ингибитора JAK свидетельствует об участии сигнального пути JAK в АДФ-индуцированной активации тромбоцитов. Доля этого участия повышается с увеличением количества клональных клеток, несущих соматическую мутацию в гене JAK2, очевидно, вследствие нарушения фосфорилирования и передачи сигнала мутантной формой тирозинкиназы JAK2. Разная степень ингибирования агрегации у пациентов свидетельствует о различии вклада сигнального пути JAK-STAT в активацию тромбоцитов.
Известно, что тромбопоэтин стимулирует мегакариоцитопоэз путем связывания с рецептором MPL на мегакариоцитах, который активирует сигнальный путь JAK-STAT [Kaushansky K., 1995]. Тромбопоэтин также индуцирует фосфорилирование JAK и STAT и активацию тромбоцитов. Было показано, что тромбин стимулирует фосфорилирование тирозина в JAK2, что доказывает существование сигнального механизма фосфорилирования JAK-STAT в тромбоцитах и играет регуляторную роль в их функции [Drachman J.G., Sabath D.F., Fox N.E. et al., 1997]. Lu W-J с соавт. исследовали эффекты JAK2 на тромбоциты с использованием AG490, который является специфическим и мощным ингибитором JAK2 [Lu W.J., Lin K.C., Huang S.Y. et al., 2014]. Было выявлено, что AG490 ингибировал индуцированную коллагеном агрегацию тромбоцитов человека. В присутствии AG490 фосфорилирование PLC2, протеинкиназы C, Akt или JNK в активированной коллагеном агрегации тромбоцитов человека также снижается, что доказывает участие PLC2-PKC и JNK в передаче сигналов JAK2-STAT3 коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов. Таким образом, участие JAK2 тромбоцитов в регуляции как коллаген- так и в АДФ-индуцированной активации тромбоцитов не вызывает сомнения, что в будущем может служить новой мишенью для дезагрегантных препаратов. На сегодняшний день механизмы, лежащие в основе сигнального пути JAK2-STAT3 в тромбоцитах, остаются неизвестными.