Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Особенности иммунитета у недоношенных новорожденных детей с респираторными нарушениями инфекционного и неинфекционного генеза Жукова Анастасия Сергеевна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Жукова Анастасия Сергеевна. Особенности иммунитета у недоношенных новорожденных детей с респираторными нарушениями инфекционного и неинфекционного генеза: диссертация ... кандидата Биологических наук: 14.03.09 / Жукова Анастасия Сергеевна;[Место защиты: ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2018.- 131 с.

Содержание к диссертации

Введение

Глава I. Обзор литературы 12

1.1. Особенности иммунной системы новорожденных детей 12

1.1.1. Характеристика врожденного иммунитета у новорожденных .14

1.1.2. Характеристика адаптивного иммунитета у новорожденных 20

1.2. Постнатальное становление иммунной системы .28

1.3. Особенности иммунной системы у детей с врожденной инфекцией .32

Глава II. Материал и методы исследования 44

Глава III. Результаты собственных исследований 51

3.1. Общая характеристика новорожденных детей .51

3.2. Особенности иммунитета у новорожденных детей различного гестационного возраста 56

3.2.1. Фенотипическая характеристика фагоцитов пуповинной крови 56

3.2.2. Функциональная активность фагоцитов пуповинной крови 60

3.2.3. Субпопуляционный состав лимфоцитов у новорожденных .68

3.2.4. Цитокиновый статус новорожденных детей .74

3.3. Иммунологические особенности недоношенных детей с врожденной пневмонией .76

3.3.1. Фенотипические и функциональные особенности фагоцитов пуповинной и периферической крови недоношенных новорожденных .77

3.3.2. Фенотип лимфоцитов пуповинной и периферической крови недоношенных новорожденных 83

3.3.3. Цитокиновый статус недоношенных детей при рождении и на 3 сутки жизни 86

Глава IV. Обсуждение полученных результатов 93

Заключение .105

Выводы 107

Список сокращений 109

Список литературы .112

Введение к работе

Актуальность темы. Бактериальные и грибковые инфекции в раннем
неонатальном периоде являются одной из основных причин возникновения у детей
серьезных патологий, зачастую не совместимых с жизнью. Преждевременное
рождение ребенка часто сопряжено с наличием у него врожденных инфекционных
заболеваний вследствие повышенной восприимчивости незрелой иммунной
системы к патогенам [Титов Л.П., 2009; Титова Н.Д., 2007]. Морфологическая и
функциональная незрелость дыхательной системы обусловливает развитие у
недоношенных детей дыхательных нарушений инфекционного или

неинфекционного генеза. Пневмония у новорожденных детей, особенно недоношенных, является одной из главных причин неонатальной смертности [Liu L., 2016]. В настоящее время является актуальным поиск диагностических маркеров, позволяющих дифференцировать врожденную пневмонию от дыхательных нарушений неинфекционного генеза сразу после рождения ребенка, а также выявлять его предрасположенность к инфицированию в раннем неонатальном периоде.

При физиологически протекающей беременности внутриутробное развитие
плода происходит в условиях низкой антигенной стимуляции, поэтому иммунная
система здоровых доношенных новорожденных во многом отличается от иммунной
системы взрослых. Ключевую роль в защите организма новорожденного ребенка
при инвазии патогенов играют клетки врожденного иммунитета: нейтрофильные
гранулоциты и моноциты [Levy O., 2007]. Их функциональное состояние во многом
определяет дальнейшее развитие иммунного ответа на бактериальную и грибковую
инвазию. Важной функцией моноцитов и нейтрофилов является их

иммунорегуляторное воздействие на клетки адаптивного иммунитета посредством секреции обширного спектра хемокинов и цитокинов, действие которых направлено на привлечение, активацию, стимуляцию более специфичных иммунных клеток [Нестерова И.В., 2015; Беляева А.С., 2016]. В настоящее время до конца не изучены особенности субпопуляционного состава фагоцитов пуповинной крови, их

фагоцитарной активности, интенсивности окислительного взрыва и содержания цитокинов в пуповинной крови в зависимости от гестационного возраста новорожденных и наличия у них врожденных инфекционных заболеваний.

Активация врожденного иммунитета служит обязательным условием развития антиген-специфического адаптивного иммунного ответа, центральную роль в реакциях которого играют субпопуляции Т- и В-лимфоцитов [Ярилин А.А., 2010]. Имеющиеся в настоящее время данные позволяют судить о разнообразии популяций лимфоидных клеток в периферической крови взрослых доноров, однако остается неизученным вопрос о влиянии недоношенности и врожденных инфекционных заболеваний на их соотношение в пуповинной крови новорожденных.

Доказано, что развитие иммунной системы в течение эмбриогенеза не

завершается к моменту рождения ребенка и продолжается в течение постнатального периода [Blackburn S.T., 2014]. Сразу после рождения ребенка кожа и слизистые его дыхательной, пищеварительной и мочевыделительной систем заселяются микрофлорой, что ведет к активации и дифференцировке иммунных клеток. Адаптация здоровых доношенных новорожденных к условиям внеутробного существования, сопряженная с высокой антигенной нагрузкой на их иммунную систему, характеризуется повышением антиген-распознающего потенциала и функциональной активности иммунных клеток. Однако существует недостаточно данных о постнатальном развитии иммунной системы детей, родившихся преждевременно.

Цель исследования: охарактеризовать состояние врожденного и адаптивного иммунитета у недоношенных детей при рождении и в раннем неонатальном периоде с учетом генеза дыхательных нарушений.

Задачи исследования

1. Определить фенотип фагоцитарных клеток по экспрессии поверхностных рецепторов к ростовым факторам (CD114, CD116) и опсонинам (CD11b, CD16, CD64), патоген-распознающих рецепторов (TLR2, TLR4), антиген-презентирующей молекулы HLA-DR в пуповинной и периферической крови недоношенных детей без

признаков инфекции или с врожденной пневмонией, в сравнении со здоровыми доношенными новорожденными.

  1. Оценить интенсивность фагоцитоза, зимозан-индуцированной и РМА-индуцированной продукции активных форм кислорода клетками цельной крови новорожденных детей с учетом их гестационного возраста и генеза дыхательных нарушений.

  2. Охарактеризовать субпопуляционный состав лимфоцитов в крови новорожденных детей исследуемых групп и определить интенсивность экспрессии рецепторов к ростовым факторам (CD267, CD268) на В-клетках.

  3. Определить содержание иммуноглобулинов классов G и M в плазме крови здоровых доношенных новорожденных, недоношенных детей с врожденной пневмонией и без таковой.

  4. Оценить уровень провоспалительных (IL-6, IFN, TNF и др.), противовоспалительных (IL-4, IL-10 и др.) цитокинов, хемокинов (IL-8, IP-10 и др.) и ростовых факторов (G-CSF, GM-CSF, VEGF и др.) в плазме крови новорожденных исследуемых групп.

  5. Выявить маркеры ранней диагностики внутриутробной пневмонии у недоношенных новорожденных детей.

  6. Сравнить показатели врожденного и адаптивного иммунитета у недоношенных детей с дыхательными нарушениями инфекционного и неинфекционного генеза при рождении и на 3 сутки жизни.

Научная новизна исследования

На основании фенотипического анализа клеток врожденной и адаптивной иммунной системы, определения функциональной активности фагоцитов, секреторной активности продуцирующих цитокины клеток иммунной системы проведена комплексная оценка степени дифференцировки и функциональной активности иммунных клеток у новорожденных в зависимости от гестационного возраста и наличия или отсутствия у них врожденной пневмонии. Охарактеризован фенотип В-лимфоцитов у здоровых доношенных новорожденных и недоношенных

детей с дыхательными нарушениями инфекционного и неинфекционного генеза. Выявлены особенности иммунитета у недоношенных новорожденных: низкая фагоцитарная и бактерицидная активность клеток врожденного иммунитета, повышенное содержание В1 лимфоцитов и незрелых В-клеток на фоне низкого количества В-лимфоцитов памяти, среди которых преобладают клетки, в которых не произошло переключения классов иммуноглобулинов, – что может обусловливать высокий риск развития у них инфекционно-воспалительных заболеваний.

Впервые при сравнительной оценке фенотипа и функциональных свойств фагоцитов и лимфоцитов пуповинной и периферической венозной крови недоношенных новорожденных установлено, что течение процесса ранней неонатальной адаптации у преждевременно родившихся детей без признаков инфекции сопровождается повышением патоген-распознающего потенциала фагоцитов, содержания Т-клеток, в том числе Т-хелперных и Т-регуляторных, и хемокинов IL-8 и IP-10 в плазме крови, снижением количества В-лимфоцитов. У недоношенных детей с врожденной пневмонией к 3 суткам жизни существенно снижается содержание NK-клеток, концентрация провоспалительных (IL-1b, IL-6, IL-12, IFN, TNF), противовоспалительных (IL-4, IL-13) цитокинов и ростовых факторов (GM-CSF, VEGF, FGF-basic, PDGF-bb) в плазме крови, возрастает интенсивность продукции активных форм кислорода фагоцитами, происходит усиление экспрессии рецептора Fas/APO-1 на лимфоцитах, увеличивается содержание «непереключенных» В-клеток памяти.

Практическая значимость

На основании результатов исследования пуповинной крови здоровых доношенных новорожденных определены референсные значения поглотительной способности и интенсивности оксидативного взрыва фагоцитов, содержания субпопуляций клеток врожденного и адаптивного иммунитета и экспрессии на них поверхностных рецепторов.

Показано, что метод одновременного определения интенсивности экспрессии CD64 на нейтрофильных гранулоцитах и зимозан-индуцированной продукции

активных форм кислорода фагоцитами пуповинной крови обладает высокой
чувствительностью (75%), специфичностью (80%), положительной и отрицательной
прогностической значимостью (85,7% и 66,7% соответственно) для

дифференциальной диагностики генеза дыхательных нарушений у недоношенного ребенка при рождении, а значение площади под кривой, равное 0,800, позволяет использовать данный метод в клинической практике.

Положения, выносимые на защиту

  1. У недоношенных новорожденных детей по сравнению со здоровыми доношенными отмечается низкая функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов, недостаточность гуморального звена иммунитета, преобладание незрелых В-клеток и В1 лимфоцитов. Субпопуляционный состав Т-лимфоцитов и содержание плазменных хемокинов, провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в пуповинной крови не зависят от гестационного возраста.

  2. У недоношенных детей с врожденной пневмонией обнаруживаются признаки системной воспалительной реакции, что выражается в активации клеточного звена врожденного иммунитета и более высоком содержании хемокинов, провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в плазме пуповинной крови.

  3. Течение процесса ранней неонатальной адаптации у недоношенных детей без признаков врожденной инфекции сопровождается повышением патоген-распознающего потенциала фагоцитов, усилением секреторной активности продуцирующих цитокины иммунных клеток и увеличением числа Т-лимфоцитов в крови. У детей с врожденной пневмонией к 3-м суткам жизни снижается содержание цитокинов в плазме крови, возрастает интенсивность продукции активных форм кислорода фагоцитами, повышается содержание В-клеток памяти, в которых не произошло переключения классов иммуноглобулинов.

Апробация работы

Диссертационная работа обсуждена на заседании межотделенческой апробационной комиссии ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Материалы диссертационной работы представлены на 18-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2014), 14th International Symposium for Immunology of Reproduction "Progress In Reproductive Immunology" (Варна, 2015), VIII Всероссийском образовательном конгрессе «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии» (Москва, 2015), XVI Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2017).

Объем и структура диссертации

Текст диссертации изложен на 131 странице печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, полученных результатов, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 160 литературных источников: 44 на русском и 116 на английском языках. Диссертация содержит 9 таблиц и 18 рисунков.

Характеристика врожденного иммунитета у новорожденных

Врожденный иммунитет является самой ранней формой иммунной защиты организма, доказательством чего является наличие генов врожденной защиты у беспозвоночных животных и растений. На фоне выраженной незрелости адаптивного иммунитета новорожденных, ключевую роль в защите их организма от возбудителей инфекционных заболеваний играют факторы врожденного иммунитета. Нейтрофильные гранулоциты и моноциты способны быстро мигрировать к очагу инфекции, распознавать, обезвреживать патогенные микроорганизмы и презентировать антигенные фрагменты Т-лимфоцитам с последующим развитием эффективного антиген-специфического иммунного ответа. Пул нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге новорожденных, особенно недоношенных, существенно меньше, чем у взрослых, что обусловливает быстрое его истощение при генерализованных инфекционно-воспалительных заболеваниях, ведущее к развитию нейтропении [111]. Основным цитокином, поддерживающим жизнеспособность нейтрофилов и моноцитов, является гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), сходную роль на ранних стадиях дифференцировки играет IL-3. Созревание и специализация миелоидных клеток проходят при действии гранулоцитарного (G-CSF) и моноцитарно-макрофагального (М-CSF) колониестимулирующих факторов. Данные цитокины, связываясь с соответствующими поверхностными рецепторами, вызывают пролиферацию, дифференцировку и активацию иммунных клеток. Установлено, что в сыворотке пуповинной крови содержание ростовых факторов выше, чем в периферической крови взрослых. В ответ на инфекционные или воспалительные стимулы секреция G-CSF и GM-CSF увеличивается, результатом чего является повышение содержания циркулирующих фагоцитарных клеток [49,69].

После непродолжительной циркуляции нейтрофильные гранулоциты и моноциты покидают кровоток и под действием хемокиновых сигналов мигрируют в ткани. Тип и интенсивность экспрессии хемокиновых рецепторов на иммунных клетках меняются в зависимости от степени их дифференцировки. Хемокины подразделяются на гомеостатические, регулирующие распределение клеток по лимфоидным органам, и провоспалительные, отвечающие за активацию клеток и привлечение их в очаг воспаления. Несмотря на способность многих клеток, в том числе неиммунных, секретировать провоспалительные хемокины, главными их продуцентами являются нейтрофилы и моноциты. Основными хемотаксическими факторами для нейтрофильных гранулоцитов являются IL-8 и MIP-2, для моноцитов – МСР, MIP-1, MIP-1, RANTES [85,102]. Связывание хемокинов с рецепторами на клетках приводит к активации молекул адгезии на их поверхности (селектинов и интегринов), способствующих прилипанию фагоцитов к эндотелиальным клеткам и последующему их проникновению в ткани через стенку кровеносного сосуда. Член семейства 2 интегринов LFA-1 (CD11b/CD18) спонтанно экспрессируется на фагоцитах и способствует адгезии клеток к фибронектину и продуктам его расщепления. У новорожденных снижена хемотаксическая активность фагоцитов по сравнению с взрослыми, поскольку синтез и секреция хемокинов, а также экспрессия хемокиновых рецепторов и молекул адгезии незрелыми иммунными клетками существенно ниже, чем у взрослых [82,99]. Не существует единого мнения о влиянии типа родоразрешения на хемотаксическую активность нейтрофилов пуповинной крови новорожденных: по данным Birle A. [51], у детей, рожденных через естественные родовые пути, активность спонтанного и индуцированного fMLF хемотаксиса была значимо выше, чем у детей, рожденных путем операции кесарева сечения. Напротив, Makoni M. и соавторами [99] было показано, что тип родоразрешения не влияет на функциональные особенности нейтрофильных гранулоцитов пуповинной крови здоровых доношенных новорожденных.

Достигая очага инфекции, моноциты и нейтрофилы связывают, поглощают и инактивируют патоген. Распознавание чужеродных микроорганизмов фагоцитами осуществляется с помощью патоген-распознающих рецепторов, среди которых ключевую роль играют TLRs, экспрессированные на клетках первой линии иммунной защиты: нейтрофилах, моноцитах/макрофагах, дендритных и естественных киллерных клетках. В формировании иммунного ответа новорожденных имеют важное значение TLR4, взаимодействующий с липополисахаридом стенки грам-отрицательных (Гр–) бактерий и TLR2, распознающий фрагменты клеточной стенки грам-положительных (Гр+) бактерий, микобактерий и грибов. С мембранным рецептором TLR4 функционально связана молекула CD14, которая облегчает взаимодействие TLR4 с бактериальным липополисахаридом. Экспрессия TLR2, TLR4 и CD14 на моноцитах пуповинной крови, а также секреция провоспалительных цитокинов в ответ на стимуляцию бактериальным липополисахаридом (LPS) у новорожденных детей существенно снижены по сравнению с взрослыми донорами и напрямую связаны с гестационным возрастом [91,137]. В то же время, Silveira-Lessa A.L. [142] было показано, что экспрессия TLR2 и TLR4 на моноцитах новорожденных и взрослых не различается.

Распознавание чужеродных структур нейтрофильными гранулоцитами и моноцитами активирует процесс фагоцитоза, опсонизация клеток существенно облегчает данные процессы. В роли опсонинов выступают молекулы иммуноглобулинов и компоненты комплемента. На фагоцитах экспрессированы рецепторы FcRI (CD64), FcRII (CD32), FcRIII (CD16) для связывания с константными участками IgG и CR1, CR3 (CD11b/CD18) для связывания с C3b и C3bi компонентами комплемента. Экспрессия рецепторов к опсонинам на неонатальных клетках соизмерима, а по результатам некоторых исследований выше, чем на фагоцитах взрослых [65,98]. Низкое содержание иммуноглобулинов и ряда компонентов комплемента у новорожденных детей обусловливает низкую опсонизирующую способность сыворотки крови, что ведет к снижению интенсивности фагоцитоза по сравнению с взрослыми. Отмечена прямая корреляционная зависимость между числом нейтрофилов и моноцитов, участвующих в фагоцитозе, и гестационным возрастом новорожденных [64,142]. Напротив, Makoni M. с соавторами [99] установили, что поглотительная способность нейтрофильных гранулоцитов здоровых доношенных новорожденных не отличается от взрослых.

Поглощенные фагоцитами клетки разрушаются под действием бактерицидных ферментов и небелковых молекул. По сравнению с взрослыми, у новорожденных детей значимо снижена секреция лактоферрина и лизоцима, нарушен процесс высвобождения ферментов гранул цитоплазмы [90]. Продукция активных форм кислорода (АФК) является важнейшим механизмом повреждения микроорганизмов клетками врожденного иммунитета в процессе фагоцитоза. В случае невозможности поглощения патогенов, повреждающее воздействие оказывают кислородные радикалы, выделяемые во внеклеточную среду. В группу соединений, названных «активные формы кислорода», включают свободные радикалы (супероксидный анион-радикал, гидроксильный и гидропероксильный радикалы), нейтральные молекулы (пероксид водорода, синглетный кислород), пероксинитрит, озон, гипохлорную кислоту [26].

Продукция АФК реализуется в процессе переноса электронов в митохондриальной дыхательной цепи, в реакциях микросомального окисления при обезвреживании веществ с участием цитохрома Р-450, локализуемой в эндоплазматической сети, в реакциях самопроизвольного окисления веществ (гемоглобина, ферредоксинов, адреналина и др.). Кроме того, в фагоцитирующих клетках процесс генерации АФК идет в мембране фаголизосом и катализируется ферментом NADPH-оксидазой. При ее активации внеклеточный кислород превращается в супероксид-анион радикал (О2-), обладающий мощным окислительным потенциалом [26]. NADPH-оксидаза – комплекс мембранных и цитозольных белков. В покоящейся клетке фермент находится в диссоциированном состоянии. Цитозольные компоненты NADPH-оксидазы представлены белками p47phox, p67phox, p40phox. Ядром фермента является связанный с мембраной цитохром b558, состоящий из белка р22phox и гликопротеина gp91phox. В качестве мембранного компонента также рассматривают малый GTP-связывающий белок Rapla. Основным механизмом активации NADPH-оксидазы является фосфорилирование. Связывание лиганда с рецептором на плазматической мембране фагоцита ведет к активации цитоплазматических тирозиновых и серин/треониновых протеинкиназ. Фосфорилирование p47phox снимает аутоингибирование белка, активирует перемещение комплекса p47phox-p67phox-p40phox в плазматическую мембрану, где происходит его взаимодействие с цитохромом b558 с последующей продукцией АФК. В фосфорилировании p47phox участвуют различные системы клеточных киназ: протеинкиназы С (PKC), митоген-активированные протеинкиназы (MAPK), р21-активированная киназа, Akt (протеинкиназа В), казеин-киназа, киназа, активируемая фосфатидиловой кислотой. Главная роль отводится РКС. В нейтрофилах присутствуют четыре изоформы РКС: , , и , и все они в той или иной мере включаются в фосфорилирование р47phox [20,26]. В результате проведенного Chudgar U.H. [58] количественного анализа было установлено, что содержание цитохрома b558 в мембранах нейтрофильных гранулоцитов пуповинной крови выше, а количество цитозольных белков p47phox, p67phox, p40phox – ниже, чем у взрослых. Полиморфноядерные лейкоциты обладают сформированным цитотоксическим потенциалом.

Особенности иммунной системы у детей с врожденной инфекцией

Защита плода от инфекции обеспечивается несколькими механизмами: плацентарный барьер, плодные оболочки, материнские антитела класса G. Супрессорная направленность механизмов формирования иммунного ответа, низкая функциональная активность иммунокомпетентных клеток крови приводят к повышенной восприимчивости новорожденных, особенно недоношенных, к инфекциям.

Врожденными считаются заболевания, клинические проявления которых реализуются в течение первых 72 часов жизни ребенка. Заражение может происходить как внутриутробно, так и во время рождения, в обоих случаях инфекционное заболевание является врожденным. Различают следующие основные пути проникновения возбудителя: восходящий (через родовые пути), трансплацентарный, гематогенный, нисходящий и смешанный [18]. Частота врожденных инфекций (ВИ) в России составляет 25% от числа живорождений, до 50% перинатальных потерь обусловлены ВИ. Высокий риск инвалидизации детей с ВИ и значительный экономический ущерб, связанный с долговременным диспансерным наблюдением за детьми с ВИ, затратами на диагностику и лечение обусловливает актуальность данной проблемы. В зарубежной литературе врожденные инфекционные заболевания объединяют понятием раннего неонатального сепсиса (early-onset neonatal sepsis). Ранний сепсис – системное инфекционно-воспалительное заболевание, характеризующееся наличием бактериемии, пневмонии, признаков сердечно-сосудистой недостаточности, менингита, изменениями в лейкоцитарной формуле, повышением сывороточного уровня маркеров воспаления [143]. О течении инфекционного процесса у ребенка свидетельствует присутствие двух и более клинических и по крайней мере одного лабораторного признака инфекции. Среди клинических признаков обращают внимание на [11]:

1. измененную температуру тела (менее 36С или более 38,5С, нестабильность температуры тела;

2. проявления сердечно-сосудистой недостаточности (брадикардия, тахикардия, артериальная гипотензия, «мраморность» кожных покровов);

3. респираторные нарушения (эпизоды апноэ, эпизоды тахипноэ, нарастание потребности в кислороде, потребность в респираторной поддержке);

4. проявления почечной недостаточности (снижение диуреза);

5. изменения кожи и подкожной клетчатки;

6. проявления со стороны пищеварительной системы (отсутствие усвоения питания, вздутие живота, ослабление или отсутствие перистальтики при аускультации);

7. проявления геморрагического синдрома (сыпь, желудочное, легочное кровотечение, макрогематурия, кровоточивость из мест инъекций);

8. гепатомегалию, спленомегалию.

К лабораторным признакам ВИ относят:

1. изменения в содержании лейкоцитов (лейкопения, лейкоцитоз);

2. изменения в содержании абсолютного количества нейтрофилов (нейтропению, нейтрофилез, высокий нейтрофильный индекс);

3. тромбоцитопению;

4. повышенный уровень С-реактивного белка;

5. эпизоды интолерантности к глюкозе, зарегистрированные как минимум дважды (гипо-, гипергликемия).

Несмотря на значительные успехи современной медицины, диагностика ВИ затруднена, поскольку патология полиэтиологична, отсутствует четкая взаимосвязь между выраженностью клинических проявлений инфекции у матери и степенью поражения плода, отсутствуют патогномоничные признаки. Наряду с острым течением инфекции, у плода и новорожденного может наблюдаться длительная персистенция возбудителя с формированием хронического инфекционного процесса [18]. Иммуногенными факторами патогенных и условно-патогенных микроорганизмов являются белки, пептидогликаны и липиды клеточной стенки, экзо- и эндотоксины, компоненты капсулы, нуклеиновые кислоты вирусов. В настоящее время интенсивно изучаются особенности клеточного и гуморального звеньев врожденного и адаптивного иммунитета при врожденных генерализованных инфекционных заболеваниях у детей [73,153,157].

Бактериальные инфекции занимают ведущее место среди причин неонатального сепсиса [143]. Способность Гр+ и Гр– бактерий индуцировать иммунный ответ различается. Главным иммуногенным фактором Гр– бактерий, к числу которых относится E.coli, является липополисахарид клеточной стенки. LPS обладает свойствами эндотоксина: при размножении или гибели бактериальных клеток он выходит во внеклеточную среду в свободной форме или в комплексе с липидом А и вызывает воспалительный ответ [74]. Иммуногенными факторами Гр+ бактерий являются пептидогликаны, липотейхоевая кислота (LTA) бактериальной стенки и внеклеточные токсины. Особенностью Гр+ микроорганизмов является наличие капсулы, которая препятствует их распознаванию иммунными клетками: опсонины сыворотки крови обладают низкой способностью связываться с антигенами капсулы, что обусловливает низкую поглотительную активность фагоцитов в отношении данных возбудителей. Данные возбудители обладают механизмами расщепления хемокинов, инактивации комплемента, ферментов лизосомальных гранул и АФК, что позволяет им эффективно избегать воздействия клеток врожденного иммунитета и долгое время персистировать в организме. Инфекционные заболевания новорожденных, вызванные Гр+ бактериями, характеризуются тяжелым течением и высокой летальностью [59].

Активация иммунного ответа возбудителями бактериальных инфекций осуществляется при взаимодействии компонентов их клеточной стенки с TLRs на поверхности иммунных клеток: LPS связывается с LPS-связывающим белком и активирует комплекс TLR4/CD14 на поверхности фагоцитов, TLR2 и TLR6 распознают LTA в составе бактериальной стенки Гр+ микроорганизмов [89]. Экспрессия TLRs на фагоцитах изменяется при взаимодействии иммунной системы плода с возбудителями инфекции во внутриутробном периоде развития и прямо коррелирует с тяжестью процесса. При сепсисе у новорожденных экспрессия TLR2 на моноцитах существенно повышается и остается высокой в течение острого периода, у недоношенных детей с бактериемией интенсивность экспрессии TLR2 на моноцитах значимо выше, чем у новорожденных с системным воспалительным ответом на фоне отрицательных результатов микробиологических тестов [101]. В отличие от моноцитов, гранулоциты интенсивно экспрессируют TLR2 в начале заболевания, ко 2-3 дню после манифестации инфекции экспрессия данного рецептора на их поверхности снижается [152].

Активация клеток врожденного иммунитета ведет к фагоцитозу патогенов с последующей их инактивацией. При поглощении микроорганизмов происходит распознавание патоген-ассоциированных молекул, не локализованных на поверхности клеток, что служит дополнительным активационным стимулом для иммунных клеток. Поглотительная активность фагоцитов новорожденных, а также интенсивность индуцированной продукции АФК при инкубации моноцитов с инактивированными нагреванием бактериальными клетками гемолитического стрептококка группы В (GBS) и E.coli в экспериментах in vitro была соизмерима и не отличалась от соответствующих показателей у взрослых доноров [71]. В случае реализации врожденной инфекции у новорожденных отмечается снижение интенсивности спонтанной и индуцированной продукции кислородных радикалов фагоцитами пуповинной крови по сравнению со здоровыми новорожденными [32]. У глубоконедоношенных детей с локализованными инфекционно-воспалительными заболеваниями отмечается снижение показателей кислородзависимого метаболизма и микробицидной активности фагоцитов при увеличении количества фагоцитирующих нейтрофилов и моноцитов. При сепсисе, в отличие от локализованных инфекционно-воспалительных заболеваний, наблюдается снижение фагоцитарной активности на фоне активации кислородзависимого метаболизма фагоцитов [14].

Функциональная активность фагоцитов пуповинной крови

Следующим этапом фагоцитоза после распознавания чужеродных структур на поверхности микроорганизмов является активация мембраны фагоцита и поглощение патогена. Методом проточной цитофлуориметрии была оценена поглотительная активность нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов у новорожденных детей и взрослых (рис. 4).

Установлено, что содержание нейтрофилов и моноцитов, участвующих в фагоцитозе, статистически не различалось в группах доношенных (группа 2) и недоношенных (подгруппа 1а) детей. Корреляционная связь фагоцитарной активности клеток пуповинной крови с гестационным возрастом также отсутствовала (Р 0,05). В то же время, интенсивность флуоресценции E.coli, поглощенных нейтрофильными гранулоцитами и моноцитами, значимо ниже в пуповинной крови недоношенных новорожденных по сравнению с детьми, родившимися в срок. Следует отметить, что в группах новорожденных детей обнаружена прямая корреляционная зависимость средней силы между интенсивностью экспрессии CD64 и относительным содержанием фагоцитирующих нейтрофилов (r=0,549 Р=0,02), а также интенсивностью флуоресценции поглощенных бактерий (r=0,60 Р=0,01).

Важнейшим механизмом повреждения микроорганизмов фагоцитами является продукция активных форм кислорода. В результате активации нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов фосфорилируется ферментный комплекс NADPH-оксидаза, что ведет к продукции кислородных радикалов – «респираторному взрыву». В случае невозможности поглощения микроорганизмов, повреждающее воздействие оказывают АФК, выделяемые во внеклеточную среду. Интенсивность продукции внеклеточных кислородных радикалов была оценена по интенсивности свечения изолюминола, который не способен проникать внутрь клетки и окисляется только внеклеточными кислородными радикалами и люминола, способного легко проникать через клеточную мембрану и отражающего окислительные процессы как снаружи, так и внутри клетки.

Оценку вклада распознающих рецепторов на поверхности фагоцитов в процесс генерации АФК проводили с использованием зимозана, опсонизированного нативной и инактивированной сывороткой крови. При опсонизации зимозана нативной сывороткой, содержащей иммуноглобулины и компоненты комплемента, активация фагоцитирующих клеток происходит путем взаимодействия с толл-подобными рецепторами (в частности, TLR2), рецепторами к Fc и рецепторами к C3 компоненту комплемента. При инактивации сыворотки содержащиеся в ней компоненты комплемента меняют свою конформацию и, таким образом, теряют свою опсонизирующую способность (при этом содержание белка остается на прежнем уровне). Таким образом, зимозан, опсонизированный инактивированной сывороткой, взаимодействует с толл-подобными рецепторами и FcRs на поверхности нейтрофилов и моноцитов и не связывается с рецепторами к комплементу.

На рис. 5 представлена оригинальная запись кинетической кривой интенсивности изолюминол- и люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) при активации АФК-продуцирующих клеток цельной крови зимозаном, опсонизированным нативной и инактивированной сывороткой крови. Следует отметить, что максимальная амплитуда изолюминол- и люминол-зависимой ХЛ при действии ОЗ и ОЗинакт не различалась. Это может свидетельствовать о том, что возможные нарушения в процессе распознавания патогенов фагоцитами не приводят к нарушению способности иммунных клеток продуцировать АФК.

Нами была вычислена средняя скорость реакции: отношение максимальной амплитуды ответа (усл.ед.) к времени, за которое реакция достигла плато (с). Установлено, что при действии зимозана, опсонизированного инактивированной сывороткой крови, ответ клеток в обеих группах новорожденных более медленный, чем при действии зимозана, опсонизированного нативной сывороткой (Р 0,0001 в обоих случаях). Скорость реакции (усл.ед./с) как при действии ОЗ, так и при действии ОЗинакт, была ниже в подгруппе 1а по сравнению с группой 2 (рис. 6).

Согласно имеющимся данным, фагоциты распознают не только антигенные структуры на поверхности патогенов, но и опсонины, связанные с ними, поэтому опсонизация существенно повышает интенсивность поглощения микроорганизмов. В качестве опсонинов выступают иммуноглобулины и компоненты комплемента. Нагревание сыворотки крови ведет к предотвращению классического и альтернативного пути активации комплемента. В исследовании Moore M.A. [109] было показано, что инактивация сыворотки крови при 57С в течение 30 минут ведет к снижению связывания комплемента с бактериальными клетками и более низкой интенсивности люминол-зависимой ХЛ нейтрофильных гранулоцитов при активации опсонизированными такой сывороткой бактериями по сравнению с аналогичными показателями при действии бактерий, опсонизированных нативной сывороткой. В другом исследовании [77] выявлен значимо более низкий фагоцитарный индекс макрофагов при опсонизации бактериальных клеток инактивированной сывороткой крови, соизмеримый с соответствующим показателем при поглощении неопсонизированных бактерий.

На рис. 7 представлено сравнение интенсивности внеклеточной и суммарной продукции АФК. Доля внеклеточной (изолюминол-зависимой) продукции АФК от суммарной (люминол-зависимой) составила:

- при активации ОЗ: 29% (25,0%-35,6%) в подгруппе 1а и 32% (28,7%-34,9%) во 2 группе;

- при активации ОЗинакт: 26% (20,9%-27,4%) в подгруппе 1а и 25% (23,2%-28,4%) в группе 2.

Межгрупповых различий выявлено не было (Р 0,05).

Низкая внеклеточная продукция АФК объясняется механизмом действия зимозана: взаимодействуя с TLR2 и рецепторами к опсонинам, он активирует фагоцитоз, поэтому значительная часть АФК образуется в фагосомах, локализованных внутриклеточно.

При оценке интенсивности ОЗ- и ОЗинакт.-индуцированной изолюминол- и люминол-зависимой ХЛ было установлено, что внеклеточная и суммарная продукция кислородных радикалов значимо ниже в пуповинной крови недоношенных детей по сравнению с доношенными (рис. 8).

Следует отметить наличие прямой корреляционной зависимости между интенсивностью внеклеточной (r=0,573 Р=0,0006) и суммарной (r=0,666 Р0,0001) ОЗ-индуцированной продукции АФК клетками пуповинной крови и гестационным возрастом новорожденных , а также с абсолютным содержанием нейтрофильных гранулоцитов (r=0,518 P=0,023 и r=0,770 P=0,0001 соответственно).

Чтобы оценить особенности ферментной системы, участвующей в генерации АФК у новорожденных, нами было проведено исследование продукции кислородных радикалов при действии форбол-12-миристат-13-ацетата (PMA). Форболовые эфиры, к числу которых относится PMA, легко проникают в клетку и взаимодействуют с протеинкиназой С – ключевым ферментом, активирующим NADPH-оксидазу. Результатом данного взаимодействия является индукция «кислородного взрыва» в фагоцитах без вовлечения рецепторного аппарата клеток. Результаты представлены на рис.9.

Продукция кислородных радикалов в ответ на действие РМА была значимо ниже в пуповинной крови недоношенных новорожденных (подгруппа 1а) по сравнению с доношенными (группа 2) и напрямую зависело от гестационного возраста (r=0,667 P=0,001).

Таким образом, низкая поглотительная активность фагоцитов пуповинной крови и экспрессия на них рецепторов, распознающих патоген-ассоциированные молекулы и опсонины на поверхности микроорганизмов, а также незрелость ферментной системы, участвующей в процессе образования кислородных радикалов, обусловливают низкую продукцию активных форм кислорода и, как следствие, недостаточную бактерицидную способность нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов у недоношенных новорожденных. Низкая функциональная активность клеток врожденного иммунитета обусловливает повышенную восприимчивость данной группы детей к возбудителям инфекционно-воспалительных заболеваний.

Цитокиновый статус недоношенных детей при рождении и на 3 сутки жизни

В табл. 9 представлены результаты определения провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в плазме пуповинной и периферической венозной крови недоношенных детей без признаков инфекции и с врожденной пневмонией.

У недоношенных детей с врожденной пневмонией (подгруппа 1б) было достоверно повышено содержание ряда про- и противовоспалительных цитокинов в плазме пуповинной крови по сравнению с соответствующими показателями у детей сходного гестационного возраста без признаков инфекции (подгруппа 1а). Поскольку экспрессия большинства цитокинов начинается в ответ на инфекцию или повреждение тканей, можно предположить, что заражение детей из 1б подгруппы произошло внутриутробно.

Анализ содержания исследуемых цитокинов в пуповинной и периферической крови одних и тех же новорожденных показал, что к 3 суткам жизни в подгруппе недоношенных детей без признаков инфекции повышается содержание IL-1Ra (P=0,03). Данный антагонист рецептора IL-1 блокирует действие провоспалительного цитокина IL-1, результатом чего является уменьшение выраженности воспалительных реакций, опосредованных данным цитокином.

В 1б подгруппе недоношенных детей с врожденной пневмонией содержание IFN, IL-1b, IL-6, TNF, IL-12, IL-13, IL-4 в плазме периферической крови существенно ниже уровня данных цитокинов в пуповинной крови (Р0,01). Отношение TNF к IL-4 (Р0,05) и IFN к IL-4 (Р0,01) у детей из 1б подгруппы достоверно выше на 3 сутки жизни, чем при рождении. Наряду с обнаруженной прямой корреляционной зависимостью средней силы между уровнем С-реактивного белка и содержанием IL-6 в плазме периферической крови детей в этом возрасте (r=0,58 Р=0,036), это может свидетельствовать о наличии воспаления и более выраженном Th1 иммунном ответе недоношенных детей с врожденной пневмонией.

При сравнении содержания цитокинов в плазме периферической крови детей в возрасте 3 суток было выявлено, что в 1б подгруппе уровень IFN, IL-1b, IL-12, IL-2, IL-9, IL-4, IL-5 значимо ниже по сравнению с соответствующими показателями у недоношенных новорожденных с дыхательными нарушениями неинфекционного генеза (подгруппа 1а). В регуляции воспалительного ответа принимают участие хемокины, контролирующие миграцию различных типов клеток в воспалительный очаг. Действие хемокинов является избирательным. Нами было оценено содержание IL-8, MIP-1a, MIP-1b, MCP, IP-10 и Eotaxin в плазме крови недоношенных детей при рождении и в возрасте 3 суток (рис. 17).

В пуповинной крови недоношенных детей с пневмонией содержание IL-8, MCP-1, MIP-1a и Eotaxin выше, чем у детей с дыхательными нарушениями неинфекционного генеза. Не обнаружено значимых различий в содержании исследуемых хемокинов в периферической крови детей на 3 сутки жизни (Р 0,05).

В периферической венозной крови недоношенных новорожденных без признаков инфекции содержание хемокинов IL-8 и IP-10 значимо выше, чем в пуповинной (Р 0,05). В процессе и сразу после рождения ребенка устанавливается тесный контакт стерильного организма новорожденного с экзогенными антигенами. Взаимодействие микроорганизмов со слизистыми оболочками приводит к активации эпителиальных, иммунных и других клеток, повышению миграционной активности лейкоцитов, что связано с заселением ими барьерных тканей. Данные процессы сопровождаются усилением синтеза и секреции цитокинов и хемокинов. Уровень исследуемых хемокинов при рождении и на 3 сутки жизни детей с врожденной пневмонией значимо не различался (Р 0,05).

Анализ содержания (пг/мл) ростовых факторов в плазме крови недоношенных детей выявил существенно более высокий уровень FGF-basic, GM-CSF, IL-7 и PDGF-bb в пуповинной крови детей с врожденной пневмонией по сравнению с новорожденными без признаков инфекции (рис. 18).

Высокая концентрация тромбоцитарного фактора роста (PDGF) в крови новорожденных из 1б подгруппы может быть обусловлена тем, что течение врожденной пневмонии у детей сопровождается проявлением признаков воспалительной реакции, а PDGF участвует в регуляции процессов острого воспаления.

Обращает на себя внимание тот факт, что уровень VEGF в плазме пуповинной крови детей с врожденной пневмонией (подгруппа 1б) был более, чем в 60 раз, выше, чем у новорожденных без признаков инфекции (P=0,025). Синтез и секреция данного цитокина, обладающего мощным ангиогенным действием, во многом регулируется гипоксией. Поскольку новорожденные из подгруппы 1б имели более выраженную степень асфиксии при рождении, можно предположить, что высокая концентрация VEGF в их пуповинной крови является компенсаторным механизмом для увеличения оксигенации тканей за счет формирования новых сосудов. По данным ряда авторов, VEGF и PDGF являются маркерами сепсиса у взрослых доноров [120].

При сравнении содержания FGF-basic, GM-CSF, PDGF-bb и VEGF в плазме пуповинной и периферической венозной крови недоношенных детей было определено, что у детей с врожденной пневмонией содержание данных ростовых факторов существенно ниже на 3 сутки жизни, чем при рождении (Р 0,05 во всех случаях). Содержание исследуемых ростовых факторов в плазме пуповинной и периферической крови новорожденных без признаков инфекции значимо не различалось (Р 0,05).

Таким образом, у недоношенных детей с пневмонией при рождении отмечаются признаки активации иммунной системы: повышенное содержание CD16+ моноцитов и NKT-клеток, высокая экспрессия высокоаффинного FcRI на нейтрофильных гранулоцитах, существенно более высокое содержание ростовых факторов, хемокинов, провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в плазме пуповинной крови. С другой стороны, малый гестационный возраст детей из данной подгруппы обусловливает низкое содержание иммуноглобулинов класса G в сыворотке пуповинной крови, недостаточную продукцию кислородных радикалов фагоцитами, отражающую низкую бактерицидную активность, что может быть причиной затяжного течения воспалительного процесса.

В течение первых дней после рождения у новорожденных без признаков инфекции повышается антиген-распознающий потенциал, поглотительная активность клеток врожденного иммунитета, увеличивается содержание Т-регуляторных и Т-хелперных клеток и ряда хемокинов, что может быть связано с активным заселением барьерных тканей иммунными клетками. Изменения иммунной системы недоношенных детей с врожденной пневмонией в это время носят противоположный характер: снижается содержание патоген-распознающих нейтрофилов и антиген-презентирующих моноцитов, CD16+ и NK-клеток. Значительно возрастает функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов, выражающаяся в усилении продукции активных форм кислорода. На Т-клетках повышается экспрессия рецептора к ростовому фактору IL-2. Усиление экспрессии CD95 на лимфоцитах наряду с нарастанием содержания В-лимфоцитов памяти может быть признаком дифференцировки и «обучения» иммунной системы, однако преобладание клеток памяти, в которых не произошло переключения классов иммуноглобулинов, может свидетельствовать о низкой эффективности гуморального ответа при повторном инфицировании. Существенное снижение концентрации провоспалительных, противовоспалительных цитокинов и ростовых факторов в крови недоношенных детей с врожденной пневмонией может служить признаком истощения секреторного потенциала клеток иммунной системы.