Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы .12
1.1. Клинические проявления и классификация ретинопатии недоношенных 13
1.2. Эпидемиологические факторы риска ретинопатии недоношенных 15
1.3. Этиология и патогенез ретинопатии недоношенных 17
1.4. Значение иммунолологических факторов в развитии ретинопатии недоношенных 18
1.5. Т-регуляторные клетки и их значение в развитии аутоиммунных реакций 22
1.6. Роль Tрег-клеток при иммунопатологических процессах 29
1.7. Иммунитет недоношенных детей, влияние иммунологических факторов на развитие у них заболеваний на первом году жизни 31
1.8. Исследование T-регуляторных клеток у доношенных и недоношенных детей 36
1.9. Хирургическое лечение ретинопатии недоношенных 40
1.10. Поздние осложнения и зрительные функции у детей, перенесших ретинопатию недоношенных .42
Глава 2. Материалы и методы исследования 45
2.1.Характеристика исследуемой группы .45
2.2 Методы клинического офтальмологического исследования 51
2.3. Иммунологические исследования .52
2.4. Методы математической статистики 54
2.5. Методы хирургического лечения 55
2.5.1. Методика проведения транспупиллярной диод-лазерной коагуляции .55
2.5.2. Методика витреоретинального вмешательства 57
Глава 3. Показатели Т- и В-клеточного иммунитета недоношенных детей первого года жизни с ретинопатией и доношенных соматически здоровых детей .61
3.1. Сравнительная характеристика показателей Т-и В-клеточного иммунитета в группе всех детей и взрослых 63
3.2.Сравнительная характеристика показателей Т-и В-клеточного иммунитета в группе взрослых и соматически здоровых доношенных детей 64
3.3. Сравнительная характеристика показателей Т-и В-клеточного иммунитета в группе детей с ретинопатией недоношенных и группе взрослых .66
3.4. Сравнительная характеристика показателей Т-и В-клеточного иммунитета в группе с ретинопатией недоношенных и группе соматически здоровых детей 68
3.5. Общие данные по сравнительной характеристике показателей Т- и В клеточного иммунитета у взрослых, соматически здоровых доношенных детей и при ретинопатии недоношенных 70
Глава 4. Показатели клеточного иммунитета у больных ретинопатией недоношенных с различными стадиями заболевания 73
4.1. Сравнительная характеристика показателей Т- и В- клеточного иммунитета у детей, страдающих III+стадией ретинопатии недоношенных и доношенных соматически здоровых детей 76
4.2. Сравнительная характеристика показателей Т- и В- клеточного иммунитета у детей, страдающих IVa-b стадией ретинопатии недоношенных и доношенных соматически здоровых детей 78
4.3. Сравнительная характеристика показателей Т- и В- клеточного иммунитета у детей, страдающих V стадией ретинопатии недоношенных и доношенных соматически здоровых детей 80
4.4. Сравнительная характеристика показателей Т- и В- клеточного иммунитета у детей, страдающих задней агрессивной формой ретинопатии недоношенных и доношенных соматически здоровых детей .82
4.5. Сравнительная характеристика Т- и В-клеточного иммунитета у детей с различными стадиями РН .84
4.6. Исследование Т-регуляторных кдеток (CD4+CD25highFoxp3+CD127low) у детей с различными стадиями РН 89
Глава 5. Результаты хирургического лечения детей с тяжелыми прогрессирующими стадиями ретинопатии недоношенных. выявление клинических признаков, подтверждающих значение аутоиммунного синдрома в патогенезе заболевания 94
5.1.Виды хирургического лечения больных с ретинопатией недоношенных .95
5.2. Виды осложнений в послеоперационном периоде 97
5.3. Результаты хирургического лечения РН .100
5.4. Клинические признаки аутоиммунного процесса 102
Заключение 105
Выводы .118
Практические рекомендации 120
Список условных сокращений 121
Список литературы 122
- Т-регуляторные клетки и их значение в развитии аутоиммунных реакций
- Методика витреоретинального вмешательства
- Сравнительная характеристика Т- и В-клеточного иммунитета у детей с различными стадиями РН
- Клинические признаки аутоиммунного процесса
Т-регуляторные клетки и их значение в развитии аутоиммунных реакций
«Т- регуляторные клетки CD4 CD25 +FoxP3 CD 127 (Т-рег) относятся к небольшой субпопуляции CD4 Т-клеток, которые играют критическую роль в поддержании аутотолерантности и иммунного гомеостаза и предотвращении развития аутоиммунных процессов» [12]. Регулирующие функции выполняют, кроме CD4 CD25 Т-клеток: NK-клетки, Т-клетки, CD8 Т-клетки. Регуляторные клетки с фенотипом CD8 CD28 супрессируют аллореактивность Т -+ + +-клеток, а CD8 CD28 клетки супрессируют CD8 CD28 CTL при отторжении трансплантата. NK-клетки являются продуцентами ряда цитокинов, выполняющих иммунорегуляторные функции. (Карр и Bucy 2008; Beissert и др. 2006; Nakamura соавт. 2003) [104,186,224].
Однако большинство исследователей сосредоточились на изучении регуляторных Т-клеток с маркёрными характеристиками CD4+CD25+FoxP3+CD127low (Т-рег), которые принято считать естественными или профессиональными Т-рег. Естественные Т- регуляторные клетки (Т-рег) были впервые описаны в 1990 г. одновременно двумя группами учёных: С. Сакагучи (S. Sakaguchi) с соавторами и В. Hall c соавторами. [160, 248]. Начиная с 1990 г. появились описания вновь идентифицированных Т-регуляторных клеток (T-рег) в популяции CD4+ Т-клеток, конститутивно экспрессирующих молекулу CD25, которые отличались по продукции цитокинов от клеток Th1 и Th2, были способны супрессировать функции и Th1 и Th2, блокировать аутоиммунную патологию, обеспечивая доминантную иммунологическую толерантность к собственным антигенам. Было показано, что эти клетки поддерживают периферическую аутотолерантность, и супрессируют активацию и экспансию потенциально патогенных аутореактивных Т-клеток, присутствующих в норме в иммуннои системе. Среди поверхностных молекул, наиденных на CD4+ Т- регуляторных клетках (CD5, CD45RB, CD25, CD62L, CD38 и др.), экспрессия CD25 оказалась наиболее постояннои и наиболее характернои для протективнои роли этих клеток при аутоиммунных заболеваниях [17]. На первых этапах изучения Т-рег клеток экспрессия CD25, который представляет собой альфа цепь рецептора Интерлейкина 2, служила отличительным маркером. Однако, маркер CD25 нельзя было считать абсолютным, так как этот рецептор активируется при ответе на инфекционные антигены и при разных воспалительных реакциях, что вызывает экспрессию рецептора CD25. Проведенныи анализ экспрессии генов T-рег показал большое разнообразие маркеров, но ни один из них не был уникальным только для этих клеток. Ответ был получен при изучении дефекта (мутации) гена, кодирующего Foxp3. [149, 231]. Было доказано, что Foxp3 является ведущим геном, регулирующим дифференцировку и функцию Т-рег [146, 174]. Foxp3 принадлежит к большому семеиству функционально различных факторов транскрипции, имеет ДНК-связывающую область. FОХР3 (белок скурфин): содержит 4 домена, из которых С-концевой — forkhead-домен (fork-head box – Fox) — определяет функционирование этого белка в качестве транскрипционного фактора [113]. Была показана высокая экспрессия Foxp3 в T-рег клетках и низкая – в других Т-клетках. Развитие T-рег критически зависит от экспрессии Foxp3. Менее 10% CD4+ Т-клеток экспрессируют Foxp3 и CD25, приобретая активность T-рег-клеток. Таким образом, был открыт специальныи генетическии механизм доминантнои толерантности, опосредованнои экспрессией Foxp3 и защищающеи организм от аутоиммунных заболевании и хронических инфекции. Доказано, что T-рег, это особая субпопуляция Т-клеток, выполняющая жизненно важные функции медиаторов иммунои толерантности, а фактор транскрипции Foxp3 является наиболее характерным и единственным надежным маркером T-рег. Foxp3 является ключевым контрольным геном в развитии и функциях T-рег клеток. Субпопуляция Т-рег CD4+CD25+Foxp3+ активно участвует в негативном контроле разных форм иммунного ответа. Естественные периферические T-рег конститутивно экспрессируют Foxp3 в отличие от других Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, NK и NKT. Этот механизм доминантнои аутотолерантности является физиологическои функциеи. [234, 290, 297, 304].
Стадии развития Т- регуляторных клеток
Продукция T-рег была названа третьеи функциеи тимуса. Естественные T- регуляторные клетки возникают в тимусе на ранних стадиях эмбрионального развития человека (14-й неделе гестации) (Cupedo и др. 2005) [128]. «Необычность их дифференцировки состоит в приобретении ими супрессорных свойств, определяемых экспрессией гена FOXP3, а также сохранении способности распознавать аутоантигены с высокой степенью сродства (т.е. эти клетки не проходят отрицательной селекции)» [91].
Стадии развития Т- регуляторных клеток: 1. «Перестройка V-генов Т-клеточного рецептора. В 50–90% регуляторных T клеток экспрессируется две перестроенные -цепи, т.е. есть два отличающихся по специфичности TCR. Спектр семейств -цепей Т клеточного рецептора в CD4+CD25+ и CD4+CD25- Т-клетках в принципе сходен» [91].
2. «Селекция. Положительная селекция клонов регулятрных T-клеток осуществляется с помощью молекул MHC-II, несущих аутологичные пептиды.
При мутациях генов, кодирующих MHC-II и AIRE, содержание Т-регуляторов значительно снижено. Отрицательная селекция регуляторных Т-клеток почти отсутствует: порог сродства T-клеточного рецептора к аутоантигенам, индуцирующего апоптоз этих клеток, значительно выше, чем для других Т клеток» [91].
3. «Адаптивная дифференцировка. T- регуляторные клетки при иммунном ответе дифференцируются под влиянием 3 типов стимулов: стимуляции антигеном (через T-клеточный рецептор), активации толерогенными дендритными клетками и действием TGF» [91].
4. «Факторы дифференцировки. В тимусе: FOXP3, IL-2, IL-2R, STAT5, CD28, Jagged 1/2. На периферии: FOXP3, IL-2, IL-2R, CD28, STAT5, TGF, CTLA-4 Экспрессия FOXP3 делает клетки устойчивыми к апоптозу, в результате чего при контакте с дендритными и эпителиальными клетками медуллярной зоны выживают даже клетки, распознающие аутологичные пептиды с высокой степенью сродства. В этом и состоит главная отличительная особенность селекции клонов регуляторных Т-клеток в тимусе, называемой агонистзависимой селекцией (что подчеркивает участие аутоантигенов в отборе клеток вместо их элиминации). Именно поэтому у зрелых Т- регуляторных клеток сродство TCR к аутологичным антигенам выше, чем у других Т-лимфоцитов. Функциональные особенности этих клеток (супрессорная, а не эффекторная активность) гарантируют подавление активности аутреактивных эффекторных клеток, избежавших негативной селекции при развитии. По завершении дифференцировки Т-регуляторные клетки начинают экспрессировать мембранные молекулы, важные для выполнения их функций (например, CTLA4, PD-1, GITR). Кроме того, регуляторные Т-лимфоциты приобретают способность вырабатывать супрессорные цитокины (IL-10, трансформирующй фактор роста ) » [91].
«Регуляторные Т-лимфоциты эмигрируют из тимуса в составе популяции зрелых Т-клеток. CD4+CD25hiFoxP3+ Т-лимфоциты составляют около 5% от числа тимоцитов и 3–5% от числа периферических Т лимфоцитов (5–7% от числа CD4+ Т-клеток), т.е. 0,02–0,06109 клеток на 1 литр крови» [91].
Маркеры Т- регуляторных клеток:
Как было сказано выше, характерными маркерами для Т-рег являются CD4+CD25+FOXP3+. Четвертым характерным маркером является негативная экспрессия CD127low (альфа цепь рецептора IL-7). Экспрессия CD127low коррелирует с экспрессией FOXP3 и супрессорными свойствами CD25high Т-рег [165, 201]. Описаны также следующие варианты поверхностных маркёров T-рег: CD45RO, CD45RB, молекулы адгезии CD62L и CD44, интегрины 4, 7, цитотоксический Т-лимфоциты-ассоциированный антиген-4 (CTLA-4), костимуляторные молекулы CD28; рецепторы хемокинов CCR7, CXCR4, CCR9, GITR (глюкокортикоид-индуцированный рецептор TNF), OX40 CD134 и др., (Lim H. W. и др. 2006, Vignali D.A., и др. 2008 и др.) [203, 295].
Среди Т-рег способность к супрессии ассоциирована с экспрессиеи CD25high и коррелирует с экспрессиеи ингибирующих лигандов CTLA-4, PD-1, а также рецептора фактора некроза опухоли (TNFR) [188, 200, 238]. Т-рег секретируют противовоспалительные цитокины IL-10, IL-4, TGF и пролиферируют только в присутствии ИЛ-2 [303].
Методика витреоретинального вмешательства
Данный вид хирургического вмешательства проводился при ретинопатии недоношенных IVа, IVb, V стадиях.
Данное оперативное вмешательство проводилось под контролем стереомикроскопа (стереомикроскоп операционный офтальмологический MOLLER Hi-R 900, ОРMI VISU 200, Leica (Германия) (рис. 13).
Мы проводили витректомию с использованием операционной системы для операций на переднем и заднем отрезке глаза Pentasys IOLTECH (Франция), D.O.R.C (Голландия), Acurus (Alkon, США) с использованием контактных линз для проведения витреальных операций – стеклянные линзы (производство США), широкоугольных хирургических линз (Ocular США) (рис.14).
В зависимости от того, на какой операционной системе мы проводили операции, применялись инструменты различных фирм (витрэкторы для задней витрэктомии 20 Gа, 23 Gа, 25 Gа, эндоосветители 20 Gа, 23 Gа, 25 Gа, троакарные системы 23 Gа, 25 Gа, силиконовые канюли 20 Gа, 23Gа, 25Gа (Фирма RUMEX (США), DORC (Голландия), Acurus (Alkon, США). Мы использовали витреоретинальные инструменты многоразовые и однократного использования (ООО «Алкон Фармацевтика», Мединурал, «Титан» (Россия)).
При ретинопатии недоношенных IVа стадии и в ряде случаев IVb в основном применялись операции с сохранением хрусталика – микроинвазивная ленссберегающая витреошвартэктомия (рис.15). Витрэктомию проводили по стандартной методике с использованием инструментов 23 Gа или 25Gа. Применялись специальные векорасширители для новорожденных. Производился разрез конъюнктивы в области лимба (расположение и величина разреза зависили от преполагаемого расположения портов). С помощью троакаров 23 Gа или 25Gа через плоскую часть цилиарного тела устанавливались порты в трех сегментах. Расположение портов зависело от локализации отслойки сетчатки. Через один из портов осуществлялась подача жидкости с помощью силиконовой канюли соответствующего диаметра. Через другие два порта осуществлялись манипуляции инструментами. Витректомия проводилась с помощью высокочастотного витреотома (частота резов 2500) под контролем световода 23 Gа или 25Gа. С помощью пинцета и ножниц удалялись трас- и эпиретинальные мембраны. При необходимости производилась дополнительная или первичная эндолазеркоагуляция аваскулярных зон (применялись лазерный коагулятор «ЛАХТА-МИЛОН» (производство Россия), установка лазерная офтальмологическая Iumenis (производство Франция), установка лазерная офтальмологическая Supra Quntal Medical (производство Франция). На область пунктур склеры и конъюнктиву накладывали швы 7-0 викрил.
При ретинопатии недоношенных IVb и V стадиях применялись операции с удалением хрусталика – микроинвазивная ленсвитреошвартэктомия. (рис.1415). При данных стадиях заболевания использовались преимущественно инструменты 23 Ga и 20 Ga, в некоторых случаях 25 Ga. Этапы операции были аналогичные описанными выше. Добавлялся этап операции по удалению хрусталика с помощью витреотома.
Сравнительная характеристика Т- и В-клеточного иммунитета у детей с различными стадиями РН
В таблице 16 и на рисунках 25-27 представлена сравнительная характеристика показателей Т- и В-клеточного иммунитета у детей с различными стадиями РН. Существует достоверное различие (р 0,05-0,01) между III+, IV и V стадиями РН по показателям: CD3+CD8+, CD3-/CD16+CD56+, Т- регуляторных клеток CD4+CD25highFoxp3+CD127low, между ЗАРН И III+, IV, Vстадиями РН по показателям Т-регуляторных клеток CD4+CD25highFoxp3+-СD127low (%).
При прогрессировании процесса от III к V стадии РН при сниженных показателях общего количества Т-клеток СD3+, Т-клеток CD3+CD4+, Т-рег CD4+CD25highFoxp3+CD127low отмечается постепенное увеличение показателей Т-клеток CD3+CD8+ и В-клеток CD19+. Обнаружено достоверное снижение уровня клеток – натуральных киллеров от более легких к более тяжелым стадиям РН (p 0,01-0,05).
На рисунке 25 представлены линии тренда всех изучаемых показателей Т- и В-клеточного иммунитета у контрольной группы и группы с РН в зависимости от степени тяжести заболевания. Выстроены линии тренда показателей CD3+, CD3+CD4+ и CD3-CD16+CD56+, при которых коэффициент R2 превысил 0,74. Все остальные линии тренда имеют низкую степень достоверности отражения зависимости от степени тяжести заболевания. Линии тренда, построенные только для диагнозов РН III+, IV и V (рис. 26) отражают реальную зависимость изучаемых показателей от степени тяжести (R2=1).
На рис.27 показаны в сравнении иммунофенотипы клеток крови больных с различными стадиями РН.
Клинические признаки аутоиммунного процесса
Учитывая особенности возникновения и прогрессирования РН, клинические проявления, результаты хирургического лечения различных стадий, особенности послеоперационного периода в зависимости от стадии процесса, высокую вероятность прогрессирования процесса в течение всей жизни, нами были выявлены основные клинические признаки, свидетельствующие о роли аутоиммунного синдрома в возникновении и прогрессировании ретинопатии недоношенных.
Клинические признаки аутоиммунного процесса:
1. Факт повреждения сетчатки (ее ишемия, предшествующая развитию любой из форм ретинопатии недоношенных, появление отграничивающей линии – разной в зависимости от степени повреждения)
2. Изменение ее сосудистого русла (расширение и неравномерный калибр сосудов, появление анастомозов, шунтов и новообразованных сосудов перед зоной ишемического повреждения)
3. Появление транссудации и экссудации, фибринообразования, кровоизлияний в сетчатку и стекловидное тело с последующим агрессивным развитием пролиферации и тяжелых осложнений со стороны глаза со снижением зрительных функций вплоть до полной слепоты,
4. Неэффективность медикаментозной терапии вследствие молниеносности и агрессивности процесса
5. Большая частота неблагоприятных анатомических исходов при проведении лечения на поздних стадиях
6. Прогрессирование заболевания в течение всей жизни