Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 5
1.1. Неонатальные пневмонии 10
1.2. Изменение иммунной системы женщины при беременности .16
1.3. Взаимосвязь иммунной системы матери и плода .22
1.4. Иммунная система новорожденного и риск развития пневмонии 25
1.5. Роль иммуногенетических факторов в обеспечении иммунного ответа на патоген 27
Глава 2. Материалы и методы 32
2.1. Характеристика клинических групп. 32
2.2. Методы. 34
2.2.1. Выделение ДНК 34
2.2.2. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. 34
2.2.3. Рестрикционный анализ. 40
2.3. Реконструкция генных сетей. 41
2.4. Статистические методы анализа 42
Глава 3. Результаты и обсуждение 44
3.1. Биоинформационный анализ молекулярно-генетических процессов при пневмонии 44
3.2. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров в генах иммунитета с риском развития внутриутробной пневмонии в русской и дагестанской популяциях 48
3.2.1. Поиск ассоциаций полиморфных маркеров G-308A и G4682A в гене TNFA с ВУП в русской и дагестанской популяциях 48
3.2.2. Поиск ассоциаций полиморных маркеров A-1082G и A-592C в гене IL-10 с внутриутробной пневмонией у женщин русской и дагестанской популяций 53
3.2.3. Изучение ассоциации полиморфного маркера G-197A в гене IL-17A и полиморфного маркера C11139G в гене IL-17F с внутриутробной пневмонией в исследуемых популяциях 57
3.2.4. Поиск ассоциаций полиморфных маркеров C774T в гене eNOS, G279A в гене MMP9, VNTR в гене IL-4 и C174G в гене IL6 с внутриутробной пневмонией у женщин (мам) русской и дагестанской популяций 59
3.3. Исследование ассоциации полиморфных маркеров в генах цитокинов и других молекул иммунитета с риском развития РНП и ВУП новорожденных дагестанской популяции .70
3.3.1. Поиск ассоциаций полиморфных маркеров G-308A и G4682A в гене TNFA женщин и детей дагестанской популяции с риском развития РНП и внутриутробной пневмонии у новорожденных 70
3.3.2. Исследование ассоциации ассоциаций полиморфных маркеров A-1082G и A-592C в гене IL-10 женщин и детей дагестанской популяции с риском развития РНП и ВУП .75
3.3.3. Поиск ассоциации полиморфного маркера G-197A в гене IL-17A и полиморфного маркера C11139G в гене IL-17F с риском развития РНП и ВУП в дагестанской популяции .79
3.3.4. Изучение ассоциации полиморфного маркера C774T в гене eNOS женщин и детей дагестанской популяции с риском развития РНП и ВУП. 80
3.3.5. Исследование ассоциации маркера G279A в гене MMP9 женщин и детей дагестанской популяции с риском развития РНП и ВУП 81
3.3.6. Поиск ассоциации полиморфного маркера VNTR в гене IL4 с риском развития РНП и ВУП в дагестанской популяции 83
3.3.7. Поиск ассоциации полиморфного маркера C174G в гене IL6 с риском развития РНП и ВУП в дагестанской популяции .84
Заключение 88
Выводы 94
Список сокращений 96
Список литературы 94
- Изменение иммунной системы женщины при беременности
- Поиск ассоциаций полиморфных маркеров G-308A и G4682A в гене TNFA с ВУП в русской и дагестанской популяциях
- Поиск ассоциаций полиморфных маркеров G-308A и G4682A в гене TNFA женщин и детей дагестанской популяции с риском развития РНП и внутриутробной пневмонии у новорожденных
- Поиск ассоциации полиморфного маркера C174G в гене IL6 с риском развития РНП и ВУП в дагестанской популяции
Введение к работе
Пневмонии, в частности бактериального генеза, являются одной из основных
причин смертности новорожденных. Ежегодно в мире от пневмонии умирают
около полумиллиона детей в возрасте до 1 года (GBD 2015 Mortality and Causesof
Death Collaborators, 2016). В связи с этим, неонатальная пневмония остаётся одной
из актуальных проблем патологии раннего детского возраста. Диагностика
пневмонии новорожденных представляет собой достаточно сложную задачу, так
как обычно у этих больных выявляется меньше клинических признаков легочной
инфекции, чем у детей старшего возраста, а пневмония часто проявляется как
системное ухудшение состояния здоровья с участием нескольких органов. Кроме
того, при подозрении на пневмонию, определение этиологического агента
инфекции может быть технически сложно выполнимым в связи с возрастом,
физическим состоянием пациента, а также трудностями взятия материала. В связи
с этим, поиск новых иммунологических и генетических маркеров риска развития
пневмоний у новорожденных при наличии хронической инфекционной патологии
у беременных женщин, включая инфекции урогенительного тракта,
представляется весьма актуальным [Володин Н. Н., 2009; Дегтярева М. В., 2000].
В настоящее время известно множество потенциальных факторов риска развития неонатальных пневмоний. Однако, вне зависимости от числа этих факторов, чрезвычайно важную роль в их развитии играет функциональное состояние иммунной системы, в частности мукозального иммунитета, как новорождённого, так и роженицы [Ганковская Л. В., 2015; Ковальчук Л. В,, 2012]. Известно, что цитокины – это эндогенные медиаторы иммунной системы, которые имеют большое значение в формировании и функционировании системы иммунного надзора. Показано, что провоспалительные цитокины (TNF, IL-1 и IL-6) участвуют в развитии воспалительных реакций и при избыточной активности могут спровоцировать повреждение клеток респираторного тракта [Симбирцев А. С., 2003]. IL-10 и некоторые другие медиаторы, напротив,
обладают противовоспалительными свойствами и могут ограничивать развитие
воспаления в легочной ткани [Макаров О.В., 2008]. Таким образом, соотношение
концентраций провоспалительных и противовоспалительных цитокинов,
несомненно, оказывает влияние на исход заболевания у новорождённого ребенка. В свою очередь, уровень продукции и функциональная полноценность молекул эндогенных медиаторов иммунитета зависят от генетических особенностей индивида. В литературе существует ряд данных об ассоциации полиморфизма генов цитокинов с преждевременными родами (IL-1b, TNFA, IL-1RA, IL-4 и др.), а также ассоциации – с пневмонией у взрослых (IL-6, IL-8, IL-10 и др.) [Varner M. W., 2005; Wunderink R.G., 2003]. Но в то же время очень мало данных об ассоциации генетических маркеров с риском развития неонатальной пневмонии. Поиск новых предиктивных маркеров в генах цитокинов, а также других молекул, участвующих в иммунологических реакциях, может существенно повысить эффективность ранней диагностики неонатальных пневмоний и снизить риск развития пневмоний за счет принятия соответствующих превентивных мер.
Целью настоящего исследования являлось изучение в русской и дагестанской популяциях ассоциации риска развития внутриутробной пневмонии и ранней неонатальной пневмонии с полиморфизмом генов, белковые продукты которых участвуют в реакциях врожденного и адаптивного иммунитета.
Задачи исследования
-
Провести биоинформационный анализ для определения потенциальных генетических маркеров, которые могут быть ассоциированы с развитием инфекционной патологии (пневмонии) плода и новорожденных.
-
Изучить ассоциации внутриутробной пневмонии новорожденных с полиморфными маркерами в генах, кодирующих факторы врожденного и адаптивного иммунитета (TNFA, IL-10, IL-17A, IL-17F, IL-6, IL-4, MMP9 и eNOS), при исследовании беременных женщин русской и дагестанской популяции.
-
Исследовать ассоциации полиморфизмов в генах цитокинов, MMP9, NOS новорожденных с внутриутробной пневмонией и с ранней неонатальной пневмонией.
4. Сформулировать алгоритм прогнозирования риска развития внутриутробной
и ранней неонатальной пневмонии, основанный на оценке маркеров в генах, кодирующих эндогенные медиаторы врожденного и адаптивного иммунитета матерей и новорожденных.
Научная новизна
Впервые с использованием биоинформационного подхода построена схема молекулярных сигнальных путей, отражающая гипотетические механизмы развития иммунных реакций при пневмонии у новорожденных.
Впервые на основании результатов исследований беременных женщин русской и дагестанской популяций дана сравнительная оценка распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров в генах цитокинов (TNFA, IL-10, IL-17A, IL-17F, IL-4) и других эффекторных молекул MMP9 и eNOS, белковые продукты которых потенциально участвуют в патогенетических механизмах развития внутриутробной и ранней неонатальной пневмонии.
Представлены данные об ассоциации гаплотипов в генах TNFА и IL-10 беременных женщин с риском развития внутриутробной и ранней неонатальной пневмонией у новорожденных.
Определены прогностические маркеры в генах эффекторных молекул врожденного иммунитета (TNFА и MMP9), ассоциированные с риском и с отсутствием риска развития внутриутробной и ранней неонатальной пневмоний у новорожденных дагестанской популяции.
Теоретическая и практическая значимость работы
В результате биоинформационного анализа была разработана схема сигнальных путей, отражающая гипотетические молекулярные механизмы патогенеза пневмонии у новорожденных, которая может найти применение при поиске новых предикторов других инфекций у плода и новорожденных.
Полученные данные по ассоциации полиморфизма генов цитокинов (TNFA, IL-10) и MMP9 с риском и с отсутствием риска развития внутриутробной пневмонии в русской популяции, а также развития ВУП и РНП в дагестанской
популяции могут быть использованы в качестве дополнительных
прогностических маркеров риска развития этих заболеваний.
Сведения о влиянии единичных нуклеотидных замен в генах TNFA, IL-10 и MMP9 на риск развития неонатальных пневмоний могут служить теоретической базой для исследований в области фармакогеномики с целью оптимизации разработки и применения средств фармакотерапии в «персонифицированной медицине».
На основе полученных данных были выявлены генетические маркеры, ассоциированные с повышенной восприимчивостью организма матери и плода к инфекциям, что приводит к развитию ВУП и РНП. Исследование данных маркеров позволит врачу-гинекологу обеспечивать проведение своевременных превентивных мер по защите от развития ВУП и РНП новорожденных.
Основные положения, выносимые на защиту
-
На основе биоинформационного анализа выявлены иммунологические маркеры, которые могут потенциально играть роль в патогенезе неонатальных пневмоний.
-
Для русской и дагестанской популяций характерны межпопуляционные различия в распределении полиморфных маркеров в изучаемых генах. Выявлена статистически значимая ассоциация полиморфизма G(-308)A генa TNFА и A(-1082)G генa IL-10 с частотой развития внутриутробной пневмонии плода.
-
Новорожденные и роженицы дагестанской популяции имеют схожее распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров в генах исследуемых маркеров. Ассоциацию с частотой развития пневмонии имеют гены TNFА и MMP9 у детей и гены TNFА и IL-10 у их матерей.
Личный вклад автора в получение результатов
Диссертант лично участвовал в планировании и организации настоящего исследования, самостоятельно выполнил все лабораторные исследования, осуществил статистическую обработку и анализ экспериментальных и клинических данных с целью обобщения и предоставления полученных результатов.
Внедрение результатов исследования
По результатам исследования подана заявка получение патента
№ 201733564/17(059224) от 26.09.2017 «Способ прогнозирования неонатальных пневмоний».
Материалы исследования внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии МПФ ФГАОУ ВО 1-го МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России и на кафедре иммунологии МБФ ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России в форме лекций и семинарских занятий по иммунологии.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были представлены на конференциях:
на Российском научном форуме на Урале «Актуальные вопросы
фундаментальной медицины» (г. Екатеринбург, 23-25 октября 2014 года); на VII
Всероссийской научной конференции «Иммунология репродукции: теоретические
и клинические аспекты» (г. Ростов-на-Дону, 16-17 апреля 2015 года); на ХIII
Международном Конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии
и иммунофармакологии» (г. Москва, 18-20 февраля 2015 г.); на Первой
междисциплинарной научной конференции "Аутоиммунные и
иммунодефицитные заболевания" (г. Москва, 08-10 декабря 2016 г.); на EAACI Congress 2017 Helsinki (Finland, Helsinki, 17-21 June 2017).
Апробация диссертации состоялась 26 декабря 2017 года на объединенной научной конференции отделов иммунологии, аллергологии и вирусологии ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 5 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации
Изменение иммунной системы женщины при беременности
Врожденная и ранняя пневмония ребенка являются следствием внутриутробного инфицирования. Однако не у каждой беременной женщины, подвергшейся воздействию патогена, развивается внутриутробная инфекция. Центральную роль в защите плода от инфекционных агентов играет иммунная система матери [10-13].
Огромная роль в развитии внутриутробной инфекции плода, пневмонии новорожденного, преждевременных родов и течении беременности в целом принадлежит T-клеткам и продуцируемым ими цитокинам. Т-клетки играют центральную роль в иммунорегуляции и иммуностимуляции. Т-хелперные (Th) клетки могут быть отнесены к клеткам Th1 типа, которые продуцируют интерлейкин IL-2, интерферон (IFN) и др. и участвуют в клеточном иммунитете, и Th2-клетки, которые продуцируют IL-4, IL-5, IL-13 и др. и участвуют в гуморальном иммунитете [18, 128]. В 1980-х - 1990-х годах материнская толерантность к аллоантигенам плода объяснялась преобладающим иммунитетом типа Th2 во время беременности, что перекрывает иммунитет Th1-типа, поэтому защищает плод от материнской Th1-клеточной атаки. Действительно, преобладающий иммунитет типа Th1 наблюдался при привычном невынашивании беременности [141,146] и при преэклампсии. Тем не менее, иногда при привычном невынашивании беременности также наблюдался Th2-доминирующий иммунитет [34,52]. В настоящее время парадигма Th1/Th2 была расширена в парадигму Th1/Th2/Th17 и регуляторных T-клеток (Treg) [139].
Th17-клетки, которые продуцируют провоспалительный цитокин IL-17, играют важную роль в индукции воспалительных процессов [56,139]. Так как в полость матки могут проникать патогенные микроорганизмы, предполагается, что Th17-клетки играют здесь защитную роль и стимулируют иммунный ответ против внеклеточных микробов, а IL-17 является ключевым цитокином, который индуцирует воспаление. Амниотические мезенхимальные клетки экспрессируют рецептор IL-17, и поэтому сигнальный путь IL-17 может регулировать индуцированную TNF-секрецию IL-8 амниотической мезенхимальной клеткой. Таким образом, IL-17 может играть значительную роль в патофизиологии развития внутриутробной инфекции.
Напротив, Treg-клетки играют центральную роль в иммунорегуляции и индукции толерантности. Известно, что клетки Treg ингибируют пролиферацию и продуцирование цитокинов как в CD4+, так и в CD8+ Т-клетках, продуцирование иммуноглобулина В-клетками, цитотоксическую активность клеток естественного киллера (NK) и созревание дендритных клеток (DC), что приводит к развитию толерантности [25,47,156]. Одним из ключевых цитокинов, который регулирует Th17/Treg баланс является трансформирующий фактор роста (TGF-).
Регуляция иммунного ответа осуществляется в основном опосредованно через про- и противовоспалительные цитокины, продуцируемые Т-клетками. Одним из основных провоспалительных цитокинов, продуцируемого Th1-клетками, который играет значительную роль в развитии внутриутробной инфекции, является фактор некроза опухоли (TNF-). TNF- секретируется не только клетками врожденного иммуннитета, но и плацентой. Он проявляет свои биологические свойства при взаимодействии с мембранными рецепторами TNFR1 (TNFRSF1A, CD120a, p55) и TNFR2 (TNFRSF1B, CD120b, p75) [118]. TNFR1 регулярно экспрессируется в большинстве тканей и, по-видимому, является ключевым медиатором передачи сигналов TNF-.
Активация TNFR1 в основном приводит к провоспалительной реакции, а также к запрограммированной гибели клеток, связанной с повреждением ткани. TNFR2 является регулируемым рецептом и преимущественно обнаруживается в иммунных клетках, играя важную роль в лимфоидной системе [85]. Взаимодействие лиганда с TNFR2 может как индуцировать апоптоз, так и способствовать заживлению тканей и ангиогенезу [43]. Внеклеточные домены обоих рецепторов также могут отщепляться от мембраны и формировать растворимые рецепторы TNF-, которые способны нейтрализовать TNF-, хотя их аффинность к лиганду значительно ниже, чем у мембранных рецепторов [190].
TNF- обладает широким спектром биологических эффектов, участвуя как в регенерации, так и разрушении тканей [189]. Большинство клеток организма в той или иной степени обладают чувствительностью к воздействию цитокина. TNF- участвует в процессах иммунной регуляции, клеточного гомеостаза, а также в контроле за выживаемостью клеток, пролиферацией, миграцией и дифференцировкой [172]. В то же время благодаря своей выраженной провоспалительной и иммуностимулирующей активности TNF- ассоциируется с рядом патологических процессов, например, цитокин участвует в прогрессировании многих аутоиммунных заболеваний [39,179]. Окажет ли цитокин положительный или негативный эффект, по-видимому, определяется его концентрацией и микроокружением. Так высокая концентрация растворимого TNF (sTNF - soluble TNF), образующегося при иммунном ответе на липополисахариды и другие бактериальные токсины, играет ключевую роль в развитии септического шока [121]. Низкие концентрации TNF- ассоциированы с кахексией у пациентов с опухолевыми патологиями [36]. Таким образом, концентрацией TNF-, тканевой или клеточный тип реакции, распределение рецепторов TNF- и продолжительность стимуляции TNF- может приводить к определенной физиологической или патологической реакции.
С тех пор, как TNF- был обнаружен в амниотической жидкости и плацентарных супернатантах во время физиологического течения беременности [98], были проведены многочисленные исследования цитокина, а также его рецепторов TNFR1 и TNFR2, в разных гестационных тканях. Было продемонстрировано, что различные клетки эндометрия, децидуальной оболочки и плаценты экспрессируют TNF- и его рецепторы. Эти данные позволяют предположить, что TNF- и его рецепторы играют некоторую роль во множественных аутокринных и паракринных взаимодействиях.
Инфекционные процессы, которые вызывают воспалительные реакции в плацентарной ткани, сопровождаются повышением уровней провоспалительных цитокинов, включая TNF- и INF. Таким образом, TNF- с одной стороны играет защитную роль при инфицировании беременной женщины, с другой стороны он может привести к развитию чрезмерной воспалительной реакции.
Другим важным провоспалительным цитокином, играющим ключевую роль в развитии воспалительных процессов у беременных является IL-6. Микроорганизмы взаимодействуют с семейством Toll-подобных рецепторов, принадлежащих к врожденной иммунной системе, которые вызывают внутриклеточную активацию ядерного фактора каппа B (NF-kB) и различных киназ, что приводит к продуцированию и высвобождению цитокинов [184]. IL-6 продуцируется на ранней стадии инфекционного воспаления моноцитами и макрофагами сразу же после стимуляции TLR различными патогенными молекулярными структурами [99]. При неинфекционных воспалительных состояниях, таких как повреждение ткани, молекулярные структуры поврежденных или умирающих клеток также стимулируют TLR, которые в свою очередь продуцируют IL-6 [123]. Такая быстрая экспрессия IL-6 играет центральную роль в защите организма от инфекции или травмы, стимулируя различные популяции клеток [178]. IL-6 продуцируется различными клетками, такими как Т-клетки, В-клетки, моноциты, фибробласты, кератиноциты, эндотелиальные клетки, мезангиальные клетки, адипоциты и некоторые опухолевые клетки [125]. В сыворотке здорового человека концентрация IL-6 очень мала [104,152], но во время воспалительного процессса происходит активная экспрессия IL-6 и его уровень резко возрастает [100,188]. Следовательно, IL-6 является одним из наиболее выраженных медиаторов воспаления [100]. IL-6 представляет собой многофункциональный цитокин, который также участвует в регуляции иммунного ответа, гематопоэза, острой фазовой реакции и воспаления. Многочисленные исследования показали, что ИЛ-6 является важным прогностическим цитокином для выявления доклинического воспалительного процесса в хориоамнионе [64,89,109,116,183,187]. Повышенные уровни IL-6 в амниотической жидкости во втором триместре были ассоциированы с развитием внутриутробной инфекции и повышенным риском преждевременного родоразрешения (до 32 недель) [80].
Поиск ассоциаций полиморфных маркеров G-308A и G4682A в гене TNFA с ВУП в русской и дагестанской популяциях
Фактор некроза опухоли является провоспалительным цитокином и участвует в воспалительных, раковых процессах, в апоптозе и др. [143]. Он продуцируется мононуклеарными фагоцитами, природными киллерами (NK-клетками) и антиген-стимулированными Т-клетками [91]. Фактор некроза опухоли ассоциирован с повышенным риском развития неблагоприятного исхода беременности. Как у животных, так и у людей циркулирующие уровни TNF- выше у исследуемых с выкидышем по сравнению с беременными с благоприятным исходом, что указывает на то, что этот цитокин играет при беременности негативную роль [46, 49, 94,110,145]. Ген TNFA человека клонировали в 1984 году [140] и картировали на шестой хромосоме (6p21.33). Он охватывает порядка 3 кб, состоит из 2762 пар нуклеотидов и содержит 4 экзона, последний экзон кодирует более 80% секретируемого белка [132]. Полиморфный маркер G-308A находится в промоторной области гена, а полиморфный маркер G4682A находится в «теле гена».
При исследовании полиморфного маркера G-308A гена TNFA было выявлено, что в русской популяции в группе с внутриутробной инфекцией доля аллеля G составляла 0,762, а в контрольной группе – 0,607. Доля аллеля A была соответственно – 0,238 и 0,393. В дагестанской популяции распределение было следующим: аллель G составил 0,809, а аллель A – 0,191 в группе с внутриутробной пневмонией, и 0,744 и 0,256 в контрольной выборке. Таким образом, анализ аллелей показал отсутствие ассоциации с внутриутробной пневмонией как в русской, так и в дагестанской популяциях. При исследовании генотипов полиморфного маркера G-308A гена TNFA в русской популяции было выявлено, что генотип GG, чья доля составила 0,575 в группе с внутриутробной пневмонией и 0,250 в контрольной группе, ассоциирован с патологией (2=7,06; p 0,01), а генотип GA – наоборот, играет протективную роль. В группе с внутриутробной инфекцией частота генотипа GA составила всего 0,375, в то время как в контрольной группе его частота составила 0,714 (2=7,59; p 0,01). Таким образом, риск развития внутриутробной пневмонии при наличии генотипа GG возрастает в 4,06 раз (OR=4,06; 95%CI=1,41-11,72), и снижается в 4,17 раз при наличии генотипа GA (OR=0,24; CI=0,08-0,68). Распределение частот генотипов в исследуемых группах русской популяции представлены на рисунке 4. Также было проведено исследование ассоциации генотипов полиморфного маркера G-308A гена TNFA с внутриутробной пневмонией плода среди женщин дагестанской популяции. В группе с развившейся патологией частота генотипа GA составила 0,298, GG – 0,660, AA. – 0,042. В группе сравнения распределение генотипов было идентичным: 0,345 – GA, 0,572 – GG и 0,083 – AA, – что свидетельствует об отсутствии ассоциации между генотипами полиморфного маркера G-308A гена TNFA с внутриутробной пневмонией плода (Табл.10).
Согласно проведенному Hui-Hui Li мета-анализу, где проводилась оценка связи между генетическими полиморфизмами TNFA и риском развития преждевременной потери беременности, полиморфизм G-308A в гене TNFA может быть фактором риска для развития патологии [117].
Исследование ассоциации аллелей и генотипов полиморфного маркера G4682A в гене TNFA с внутриутробной пневмонией плода не дало статистически значимых результатов. Доля генотипов GA и GG при внутриутробной инфекции составила 0,184 и 0,816 соответственно в русской популяции, и 0,109 и 0,891 – в дагестанской. Генотип AA в исследуемых выборках не встречался, данные расчётов представлены в таблицах 8 и 10.
Известно, что однонуклеотидные полиморфные маркеры могут оказывать существенное влияние на предрасположенность индивидуума к той или иной патологии, значение также имеет совокупность сцепленных генов на одной хромосоме (т.е. гены, находящиеся в одной группе сцепления). Поэтому, помимо исследования связи между однонуклеотидными полиморфизмами G-308A и G4682A в гене TNFA и внутриутробной пневмонией плода, мы провели анализ гаплотипов. Для дагестанской популяции такое исследование выполнено впервые.
При анализе гаплотипов в гене TNFA для русской популяции в исследуемых выборках из девяти возможных вариантов гаплотипов встречалось только четыре, данные гаплотипы и распределение их частот по группам представлены в таблице 5. Как мы видим из таблицы, сравнительный анализ гаплотипов выявил статистически достоверную ассоциацию GGGG в гене TNFA в группе с внутриутробной инфекцией у плода по сравнению с контрольной выборкой (0,611 и 0,250; OR=4,71, при 95%CI=1,59-13,97; p 0,01) (Рис. 5). Помимо этого была выявлена статистически значимая протективная роль гаплотипа GAGG гена TNFA в развитии внутриутробной инфекции в русской популяции (0,194 и 0,464; OR=0,28, при 95% CI=0,09-0,85; p 0,05) (Рис. 5).
Риск развития внутриутробной пневмонии при наличии генотипа GG в позиции -308 гена TNFA возрастает в 4,06 раз, в то время как гаплотип GGGG увеличивает риск в 4,7 раз, а генотип GA в позиции -308 гена TNFA и гаплотип GAGG уменьшают риск соответственно в 4,2 и 3,6 раз. Эти данные позволяют сделать вывод, что статистически значимые результаты при оценке гаплотипов обусловлены скорей всего найденными ассоциациями в полиморфном маркере G-308A гена TNFA.
Также мы исследовали ассоциацию гаплотипов в гене TNFA с внутриутробной пневмонией плода у женщин дагестанской популяции. Из девяти возможных вариантов гаплотипов в дагестанской популяции в исследуемых выборках встречалось семь, и только пять в группе с внутриутробной пневмонией плода. Данные распределения частот гаплотипов представлены в таблице 11, статистически значимой ассоциации с внутриутробной пневмонией у женщин дагестанской популяции найдено не было. Полученные в исследовании данные распределения частот аллелей и генотипов в гене TNFA мы сопоставили по популяционному признаку и сравнили их с данными литературы. Полиморфный маркер G-308A гена TNFA исследовали при многих патологиях и его распределение в контрольных выборках описано для различных популяций [168] , в том числе и для русской [6,16]. Гомозигота AA согласно литературе не распространена широко ни в одной национальной группе, наибольший процент обследованных является носителями гомозиготы GG. В нашем исследовании аналогичная ситуация наблюдается в дагестанской популяции, в русской популяции подобное распределение было отмечено в группе с внутриутробной пневмонией, в то время как в контрольной группе доля гетерозигот была значительно выше. Данные по популяционному распределению полиморфного маркера G4682A в гене TNFA в литературе не представлены.
Поиск ассоциаций полиморфных маркеров G-308A и G4682A в гене TNFA женщин и детей дагестанской популяции с риском развития РНП и внутриутробной пневмонии у новорожденных
Далее была исследована ассоциация полиморфного маркера G-308A в гене TNFA женщин дагестанской популяции с ВАП (РНП) и ВУП у их детей. Частота встречаемости аллеля G в группе с ВАП составила 0,691, в группе с ВУП – 0,809, в контрольной группе – 0,744, а частота встречаемости аллеля A составила 0,309, 0,191 и 0,256 соответственно. Анализ генотипов показал отсутствие ассоциации генотипов полиморфного маркера G-308A в гене TNFA женщин дагестанской популяции с ВУП у их детей, и наличие таковой ассоциации группе с ВАП. Гетерозигота достоверно чаще встречалась в группе с ВАП, чем в контрольной группе (частота 0,511 и 0,345; 2=4,94; p 0,05), увеличивая риск развития патологии в 1,98 раз (OR=1,98; 95%CI=1,08-3,62) (Рис. 10).
Также мы изучили ассоциацию полиморфного маркера G-308A в гене TNFA детей дагестанской популяции с ВАП и ВУП. Аллель G встречался с частотой 0,698, 0,848 и 0,816 в группах с ВАП, ВУП и контрольной выборке соответственно, а аллель A встречался с частотой 0,302, 0,152 и 0,184. Таким образом, была найдена протективная роль аллеля A в развитии ВАП (Рис. 11). Наличие аллеля A у ребенка снижало риск развития ВАП в 1,93 раза (OR=0,52; 95%CI=0,31-0,86).
Распределение генотипов в группе с ВАП также значительно отличалось от группы с ВУП и контрольной выборки. Была найдена ассоциация гетерозиготы с ВАП (частота 0,563 и 0,266; 2=15,58; p 0,01), наличие генотипа GA увеличивало риск развития патологии в 3,55 раз (OR=3,55; 95%CI=1,87-6,75). Также была обнаружена протективная роль гомозиготы GG в развитии ВАП (частота 0,417 и 0,684; 2=12,42; p 0,05), которая уменьшала риск развития инфекции в 3,02 раза (OR=0,33; 95%CI=0,18-0,62) (Рис. 12). Распределение генотипов в группе с ВУП достоверно не отличалось от контрольной выборки, данные представлены в таблице 15.
Аллели полиморфного маркера G4682A в гене TNFA у женщин распределились следующим образом: частота аллеля G составляла в группе ВАП 0,938, в группе ВУП 0,946 и в контрольной группе 0,905, а частота аллеля A составляла 0,062, 0,054 и 0,095 соответственно. На долю гомозиготы GG пришлось 0,885 в группе ВАП, 0,891 в группе ВУП и 0,810 в контрольной группе, гетерозигота составляла 0,104, 0,109 и 0,190 соответственно, а гомозигота AA встречалась только в группе с ВАП с частотой 0,011. Аналогичная картина распределения аллелей и генотипов наблюдалась и у детей: частота аллеля G составляла 0,958 в группе с ВАП и 0,985 в контрольной группе, а частота аллеля A составила 0,042 и 0,015 соответственно. Доля генотипа GG составила 0,914 и 0,971, а доля гетерозиготы - 0,086 и 0,029 в группе с ВАП и контрольной выборке соответственно. В группе с ВУП аллель A выявлен не был ни у одного из обследованных, и, следовательно, гетерозиготный генотип также не встречался. Среди детей гомозигота AA не была обнаружена ни в одной из выборок. Таким образом, исследование полиморфного маркера G4682A в гене TNFA женщин и детей дагестанской популяции не выявило ассоциации с риском развития ВУП и РНП (ВАП) у новорожденных.
Выборки женщин и детей дагестанской популяции также были исследованы на ассоциацию гаплотипов в гене TNFA с риском развития РНП (ВАП) и ВУП у новорожденного. В исследуемых выборках встречалось семь вариантов гаплотипов у женщин и четыре варианта гаплотипов у детей, данные распределения их частот по группам представлены в таблице 11, а также для выборок женщин на рисунке 13. Как видно из таблицы, достоверных отличий при сравнительном анализе гаплотипов в группе женщин с ВУП у плода и контрольной выборке найдено не было.
Статистически значимые различия были установлены между группой женщин с РНП (ВАП) у новорожденных и контролем. Так, гаплотип GAGG достоверно чаще встречался при патологии, чем в группе здоровых женщин (0,400 и 0,177; 2=10,02; p0,01), увеличивая риск развития патологии в 3,1 раз (OR=3,10; 95%CI=1,51-6,33) (Рис. 14). Сравнительный анализ распределений гаплотипов в гене TNFA у детей дагестанской популяции не выявил достоверных различий в группах с РНП (ВАП) и ВУП по сравнению с контрольной выборкой, во всех исследуемых группах преимущественно встречался гаплотип GGGG.
Поиск ассоциации полиморфного маркера C174G в гене IL6 с риском развития РНП и ВУП в дагестанской популяции
Исследование полиморфного маркера C174G в гене IL6 женщин дагестанской популяции показало преобладание аллеля G во всех трех выборках. Так его доля в группе женщин с РНП (ВАП) у новорождённого составила 0,790, а аллеля C – 0,210. В группе с ВУП частота аллеля G составила 0,875, аллеля C – 0,125, а в контрольной выборке частоты составляли 0,750 и 0,250 соответственно. Гомозигота CC встречалась только в группе женщин с РНП (ВАП) у новорожденного, и ее доля составила 0,065. Гомозигота GG встречалась с частотой 0,645 в группе с РНП (ВАП) и 0,750 в группе с ВУП, а гетерозигота – 0,290 и 0,250 соответственно. В контрольной выборке частоты гетерозиготы и гомозиготы GG распределились равномерно и составили по 0,500 каждая. Таким образом, ассоциации полиморфного маркера C174G в гене IL6 женщин дагестанской популяции с риском развития РНП (ВАП) и ВУП у их детей найдено не было.
Пневмонии у новорожденных, как правило, характеризуются системным ухудшением состояния здоровья и представляют сложность как для диагностики, так и для лечения. Назначение своевременной и корректной терапии может помочь значительно снизить показатели младенческой смертности и развития осложнений. В связи с этим актуальной представляется задача поиска ранних предиктивных маркеров развития неонатальной пневмонии. Ключевым фактором в развитии инфекционного процесса, приводящему к неонатальной пневмонии, является функциональное состояние иммунной системы матери и плода. Оценить продукцию и функциональную полноценность молекул иммунитета до развития патологии возможно, изучая генетические особенности индивида.
Таким образом, целью настоящего исследования являлось изучение ассоциации полиморфных маркеров в генах, белковые продукты которых участвуют в реакциях врожденного и адаптивного иммунитета, с развитием внутриутробного инфицирования плода (ВУИ или ВУП – внутриутробная пневмония) и неонатальной пневмонии (ВАП или РНП – ранняя неонатальная пневмония). Для решения поставленной цели и задач нами было собрано 566 образцов клинического материала от женщин и детей дагестанской и русской (московская область) популяций, которые были исследованы современными молекулярно-генетическими и иммунологическими методами.
На первом этапе нашего исследования был проведен биоинформационный анализ при помощи программы Pathway Studio и реферативной базы данных ResNet компании Ariadne Genomics (США). В ходе биоинформационного анализа молекулярно-генетических процессов были выявлены маркеры иммунитета, которые играют значительную роль в патогенезе неонатальных пневмоний, а также построены схемы молекулярных сигнальных путей, описывающие гипотетические механизмы патогенеза пневмонии новорожденных. Полученные данные были использованы в ходе дальнейшего исследования, однако представленные в работе схемы молекулярных сигнальных путей могут быть использованы также для поиска других предиктивных маркеров пневмонии новорожденных. Также, учитывая возможность регуляции экспрессии и активности большинства представленных в сигнальных путях цитокинов, можно рассматривать их как потенциальные терапевтические мишени для биоинженерных препаратов.
В ходе межпопуляционного исследования представлена сравнительная характеристика распределения частот аллелей и генотипов в генах TNFA, IL-10, IL-17A, IL-17F, IL-4, MMP9 и eNOS русской популяции московской области и дагестанской популяции (на контрольных выборках). Также нами были выявлены существенные различия в распределении аллелей и генотипов полиморфных маркеров G-308A в гене TNFA, A-1082G в гене IL-10, VNTR в гене IL-4 и G279A в гене MMP9 как контрольной группы, так и группы с ВУП между дагестанской и русской (московской) популяциями. Эти данные могут быть использованы в исследованиях «Генетического разнообразия человека», а также в работах по разделам экологическая, эволюционная и инфекционная иммуногенетика.
При изучении полиморфных маркеров в генах TNFA, IL-10, IL-17A, IL-17F, IL-4, MMP9 и eNOS женщин русской популяции московской области было выявлено, что ассоциацию с развитием ВУП у плода играют только полиморфные маркеры в генах TNFA и IL-10. Так риск развития ВУП у плода повышался в 4,5 раза при наличии у матери генотипов GG в полиморфных маркерах G(-308)A гена TNFA (2=7,06; p 0,01) и A-1082G в гене IL-10 (2=4,08; p 0,05). Гетерозиготные генотипы в тех же полиморфных маркерах у матерей играли, напротив, протективную роль в развитии ВУП. Так при наличии гетерозиготы у матери в полиморфном маркере G(-308)A гена TNFA (2=7,59; p 0,01) риск развития патологии у плода снижался в 4 раза, а при наличии гетерозиготы в полиморфном маркере A-1082G гена IL-10 (2=6,08; p 0,05) риск развития патологии у плода снижался в 6 раз. Снижение риска развития ВУП также отмечалось при наличии аллеля A в полиморфном маркере A-592C гена IL-10 (2=3,90; p 0,05). Помимо исследования связи между однонуклеотидными полиморфизмами в генах TNFA, IL-10 и IL-17 и внутриутробной пневмонией плода, был также проведен анализ гаплотипов. Было выявлено повышение риска развития ВУП почти в 5 раз при наличии у матери в гене TNFA гаплотипа GGGG и снижение риска в 3 раза при наличии у матери гаплотипа GAGG.
Исследование полиморфных маркеров в генах TNFA, IL-10, IL-17A, IL-17F, IL-4, MMP9 и eNOS дагестанской популяции выявило прогностические маркеры развития ВУП в генах MMP9 и eNOS детей. Так гетерозиготный генотип у ребенка в полиморфном маркере G(279)A гена MMP9 (2=4,19; p 0,05) повышает риск развития патологии почти в 4 раза, а в полиморфном маркере C774T гена eNOS (2=4,05; p 0,05) – в 3 раза.
Женщины дагестанской популяции также были исследованы на наличие ассоциации полиморфных маркеров в генах TNFA, IL-10, IL-6, IL-17A, IL-17F, IL-4, MMP9 и eNOS с развитием РНП у их ребенка. Прогностическое значение было выявлено в генах TNFA и IL-10. С риском развития РНП у ребенка было ассоциировано наличие у матери гетерозиготного генотипа в позиции G(-308)A гена TNFA (2=4,94; p 0,05; OR=1,98; 95%CI=1,08-3,62), гетерозиготного генотипа в позиции A-1082G гена IL-10 (2=6,11; p 0,05; OR=3,98; 95%CI=1,43-11,00) и гомозиготы CC в позиции A-592C гена IL-10 (2=3,91; p 0,05; OR=1,84; 95%CI=1,00-3,76). Наличие гомозиготы AA в позиции A-1082G гена IL-10 (2=4,01; p 0,05) у матери снижало риск развития РНП у ребенка в 4 раза, а наличие гетерозиготы в позиции A-592C гена IL-10 (2=6,16; p 0,05) – в 2 раза. Также при анализе гаплотипов в генах матери была выявлена ассоциация GAGG в гене TNFA (2=10,02; p 0,01) и GACC в гене IL-10 (2=4,21; p 0,05) с развитием РНП у новорожденного, данные гаплотипы повышали риск развития патологии в 3 раза.
Изучение ассоциации полиморфных маркеров в генах TNFA, IL-10, IL-17A, IL-17F, IL-4, MMP9 и eNOS детей дагестанской популяции с развитием РНП показало наличие прогностических маркеров в генах TNFA и MMP9. Так гетерозиготный генотип полиморфного маркера G(-308)A гена TNFA (2=15,58; p 0,01) увеличивает риск развития РНП в 3,5 раза, а полиморфного маркера G(279)A гена MMP9 (2=14,25; p 0,05) в 8,5 раз. Протективную роль при развитии РНП играют гомозигота GG полиморфного маркера G(-308)A гена TNFA (2=12,42; p 0,01), уменьшая риск развития патологии в 3 раза, и гомозигота AA полиморфного маркера G(279)A гена MMP9 (2=8,38; p 0,01), уменьшая риск развития патологии в 5,5 раз.
Основные ассоциации представлены на рисунках 21 (для русской популяции) и 22 (для дагестанской популяции).