Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Прогностические факторы риска развития рецидива рака шейки и тела матки 10
1.2 Особенности иммунного ответа у больных раком шейки и тела матки 15
Глава 2. Материалы и методы 31
2.1. Клиническая характеристика больных 31
2.2. Методы исследования и лечения 34
Глава 3. Содержание растворимых молекул CD95, растворимых молекул HLA1 класса и HLADR в сыворотке крови больных патологией шейки и тела матки 39
3.1. Содержание растворимых молекул CD95 39
3.2. Содержание растворимых молекул HLA I класса и HLA–DR 47
Глава 4. Сывороточное содержание олигомерной фракции растворимых молекул CD38, CD50 CD54 у больных патологией шейки и тела матки 61
4.1. Сывороточное содержание растворимых молекул CD38 61
4.2 Содержание растворимых молекул CD50, CD54 74
Заключение 90
Выводы 102
Практические рекомендации 104
Список литературы
- Особенности иммунного ответа у больных раком шейки и тела матки
- Методы исследования и лечения
- Содержание растворимых молекул HLA I класса и HLA–DR
- Содержание растворимых молекул CD50, CD54
Особенности иммунного ответа у больных раком шейки и тела матки
Неоплазмы шейки матки, чаще всего являющиеся гистологической манифестацией папилломавирусной инфекции, встречаются преимущественно после полового созревания. Примерно в 90% случаев папилломавирусная инфекция и сопутствующие поражения самопроизвольно разрешаются в течение двух лет с момента инфицирования, но небольшое число женщин остается носителями. Риск развития патологических изменений шейки матки, связанных с папилло-мавирусной инфекцией, прямопропорционально повышается с длительностью статуса носителя, однако, эти изменения способны к самопроизвольной регрессии. M. Stanley [130] высказали предположение о взаимосвязи самопроизвольной регрессии диспластических изменений шейки матки и активности иммунного ответа пациентки. В отечественной науке также поднимались вопросы канцерогенеза генитальной области у женщин. Например, в работах П.М. Шварцбурда [33] описывается взаимосвязь повышенного уровня противовоспалительных цитокинов и возникновения диспластических процессов шейки и тела матки. До настоящего времени механизм элиминации вирусного агента до конца не изучен. Общеизвестно, что в этом процессе принимают участие клетки микроокружения опухоли, представленные макрофагами, дендритными клетками, натуральными киллерами, Т- и В-лимфоцитами, регуляторными Т-лимфоцитами, продуцирующими различные цитокины и хемокины, которые, в свою очередь, индуцируют экспрессию поверхностных рецепторов и молекул адгезии. Процесс регуляции иммунного ответа, вероятнее всего, определяет, отправится ли клетка по пути апоптоза или продолжит деление [125].
Активность иммунного ответа может быть определена в результате измерения плотности клеточной инфильтрации очага поражения. Противоопухолевый иммунный ответ реализуется преимущественно посредством участия Т-лимфоцитов и натуральных киллеров, которые могут оцениваться как прогностические факторы развития заболевания [67;51]. Кроме того, в иммунном ответе играют роль CD57+ T–лимфоциты, но по поводу их прогностической значимости единого мнения среди исследователей нет [63]. В работах S. B. Gusberg (1994) [63] проведено измерение клеточной плотности CD4+, CD8+. Авторы показали, что при предраковых состояниях шейки матки в строме снижается количество CD4+ Т– лимфоцитов. В других исследованиях отмечено, что интенсивная инфильтрация CD8+ лимфоцитами часто сочетается с длительным периодом без метастазирова-ния и более благоприятным прогнозом, а понижение уровня CD8+ лимфоцитов является фактором рецидивирования опухолевого процесса [102; 147; 105; 118]. Однако, наблюдается взаимосвязь между повышением плотности мононуклеар-ной инфильтрации и ухудшением прогноза выживаемости пациенток. Объясняется этот факт тем, что опухолевые клетки активно привлекают к себе мононукле-арные клетки, и, таким образом, плотность инфильтрата характеризует активность диспластического процесса. Данное предположение выносится в работах S.Monnier-Benoit [102], где также отмечается, что повышенная инфильтрация CD8+ лимфоцитами является маркером плохого прогноза заболевания. Представленные различия точек зрения по этой проблеме позволяют сделать вывод о том, что абсолютная плотность инфильтрата не может быть достоверным прогностическим признаком, необходимо качественное определение состава инфильтрата, а также разделение понятия «инфильтрация опухоли» на интраэпителиальный и стромальный компоненты. Характеристикой иммунного ответа организма на опухолевую ткань является преимущественно интраэпителиальная инфильтрация, плотность которой – более достоверный прогностический признак развития заболевания, чем общая плотность инфильтрации исследуемого образца [124]. Например, для рака яичников достоверно установлено, что повышенная интраэпители-альная инфильтрация CD8+ Т-лимфоцитами является благоприятным прогностическим фактором развития заболевания [149].
В опытах in vitro реакция цитоксических Т-лимфоцитов способна привести к полной эрадикации опухолевых клеток [70; 53; 73; 123]. Однако, in vivo, полной реакции не наблюдается. Это может быть связано с частичной супрессией ци 17 тотоксического иммунитета, достигаемой благодаря секрецией опухолевыми клетками различных хемокинов, таких как трансформирующий фактор роста бета, а также экспрессией иммуносупрессивных пептидов FoхР3 регуляторных Т-лимфоцитов [120]. Кроме того, к этим механизмам относится каскад реакций системы HLA и MHC класса I на цепь-ассоциированную молекулу А, являющуюся лигандом Т-лимфоцитов [70;140;100]. Однако, согласно данным S. Hazelbag [66] отсутствие экспрессии молекул HLA I типа и снижение экспрессии ингибитора активатора плазминогена 1 клетками рака шейки матки ассоциируется со сниженной выживаемостью данной группы пациенток по сравнению с группой, где снижения экспрессии обнаружено не было.
Степень реакции на опухолеассоциированные антигены, как критерий оценки прогрессии заболевания Неопластический процесс приводит к ряду изменений, делающих малиг-низированную клетку отличной от популяции клеток организма. Один из проявлений атипизма опухолевых клеток – экспрессия опухолеассоциированных антигенов, применяемых в качестве онкомаркеров. К этой группе молекул относятся раково-эмбриональный антиген, хорионический гонадотропин, нейрон-специфическая енолаза, антигены группы СА. Иммунные реакции организма– хозяина возможны благодаря презентации отличных от тканей хозяина опухо-леассоциированных антигенов [5]. На примере пациентов, страдающих фибро-аденоматозом и опухолями молочной железы, показан клеточный иммунный ответ на присутствие опухолевых масс. При инкубации мононуклеаров в присутствии опухолеассоциированных антигенов, пропорционально их концентрации увеличивается количество CD8+ Т-лимфоцитов. Концентрация опухолеас-социированных антигенов зависит от патоморфологической формы опухоли, ее стадии, а также наличия хронических воспалительных процессов [4]. Ответ мо-нонуклеарных клеток у пациенток с опухолями генитальной области носит неоднозначный характер и зависит от морфологического типа новообразования. Более интенсивный ответ мононуклеаров наблюдается в высокодифференциро-ванных опухолях с малым количеством патологических митозов. Кроме того, при позитивной реакции мононуклеаров на опухолевую антигенную нагрузку, отмечалось повышение уровней антител к фактору некроза опухолей (TNF-) и интерферону–гамма (IFN-) по сравнению со здоровыми женщинами. В случае негативной реакции мононуклеаров уровень антител к TNF- оказывался ниже, чем в контрольной группе здоровых женщин. Позитивная реакция моно-нуклеаров отмечается преимущественно при дисплазии II и III степени, при дисплазии I степени наблюдалась отрицательная реакция. Таким образом, позитивная реакция мононуклеаров связана с повышенными уровнями провоспали-тельных цитокинов в периферической крови и высокой степенью дифференци-ровки самой опухоли. Существует гипотеза, что повышенная продукция антител к TNF- является защитным механизмом, направленным на нейтрализацию его действия на высокодифференцированную опухоль и интактные ткани. А.И.Аутеншлюс [5; 4] предполагает, что данное утверждение справедливо для диспластических процессов и раннего этапа развития атипии, когда клетка еще сохраняет относительно высокую дифференцировку. Таким образом, позитивная реакция мононуклеаров, выражающаяся экспрессией CD8 антигена, а также сопряженная с повышением уровней антител к TNF- и IFN-, может расцениваться как новый критерий, характеризующий злокачественную опухоль, а в случае сопряжения только с повышением уровня антител к TNF-, может быть расценено в качестве нового маркера дисплазии шейки матки.
Методы исследования и лечения
Следует отметить, что у больных аденокарциномами матки концентрация sHLAI молекул достоверно превышала соответствующий показатель в группах с иным гистологическим строением опухоли – в 1,4 и 1,8 раза соответственно.
Развитие высокодифференцированных опухолей тела матки сопровождалось достоверным возрастанием уровня растворимых молекул HLA I класса и молекул HLA–DR (в 2,3 раза по каждому показателю) по сравнению с контролем (рис. 3).
В случаях появления умереннодифференцированных новообразований сохранялись значимые различия с группой здоровых лиц по уровню растворимых молекул HLA I класса (в 1,8 раза), однако концентрация молекул sHLA–DR не отличалась от нормы и была значимо ниже (в 3,4 раза), чем у лиц, страдающих вы-сокодифференцированными опухолями. Концент рация sHLA I и sHLA–DR, U/ml
Содержание растворимых молекул HLA I класса и HLA-DR в сыворотке крови больных аденокарциномами тела матки в зависимости от степени дифференцировки опухоли 1 группа - пациентки с высокодифференцированными аденокарциномами, п=22 2 группа - пациентки с умереннодифференцированными аденокарциномами, п=19 3 группа - пациентки с недифференцированными аденокарциномами, п=14 4 группа - контрольная группа, п=45 - статистически значимые различия в сравнении с контролем (р 0,05), статистически значимые различия в сравнении с группой высокодиффе ренцированных опухолей (р 0,05).
В сыворотке больных опухолями, имеющими низкодифференцированное строение, содержание растворимых молекул HLA I класса и молекул HLA-DR оставалось на уровне показателей здоровых лиц (р 0,05). Однако в условиях роста злокачественного новообразования, отсутствие значимого повышения концентрации sHLAI и sHLA–DR молекул свидетельствовало не о состоянии благополучия организма, а об истощении функциональных возможностей иммунной системы на фоне развития наиболее агрессивно протекающего варианта заболевания.
Индивидуальный анализ не выявил достоверных отличий по числу лиц, имеющих повышение, снижение или нормальный уровень растворимых молекул HLA I класса и молекул HLA–DR в группах с опухолями разной степени дифференцировки. Однако по мере снижения степени дифференцировки новообразования прослеживалась тенденция к уменьшению доли лиц, имеющих повышенный уровень sHLA–DR молекул.
Известно, что продукт главного комплекса гистосовместимости, мембранная молекула HLA I класса, участвует в презентации фрагментирован-ных до пептидов антигенов цитотоксическим Т–лимфоцитам [34]. По данным А.К.Голенкова [11], уровень sHLAI может рассматриваться в качестве интегрального критерия массы опухоли у больных хроническим лимфолей-козом и множественной миеломой, что, по–видимому, указывает на важную роль этой молекулы в канцерогенезе. Функциональная роль мембранной формы молекулы HLA–DR заключается в связывании фрагментов чужеродных клеточных белков, попадающих в клетку в результате эндоцитоза. Она участвует в представлении фрагментов чужеродного антигена CD4+ лимфоцитам с последующей активацией последних [31]. Полагают, что sHLA–DR молекулы также участвуют в защите организма от чужеродного антигена, связь с которым индуцирует трансдукцию сигнала. Возможно, что отсутствие значимого увеличения уровня растворимых молекул HLA I класса и HLA–DR в ответ на формирование бластоматозного зачатка обусловливает формирование более агрессивно протекающей опухоли, имеющей худший прогноз. Напротив, новообразования, характеризующиеся относительно более благоприятным течением, сопровождаются значимым повышением экс 52 прессии мембранных форм молекул HLA I класса и HLA–DR и, соответственно более высокой концентрацией растворимых форм этих белков. Следует отметить, что концентрация молекул sHLAI и sHLA–DR у пациенток с опухолями низкой степени дифференцировки была статистически значимо ниже, чем соответствующие значения у пациенток с высокодифференциро-ванными опухолями (в 1,5 и 3,4 раза). Однако возможна и обратная взаимосвязь – исходно более агрессивно протекающая опухоль оказывает более глубокое дискоординирующее действие на состояние иммунной системы больных, что проявляется, в частности, снижением концентрации в сыворотке крови этих пациенток растворимых молекул HLA I класса и HLA–DR.
Независимо от степени инвазии аденокарцином в окружающие ткани, уровень растворимых молекул HLA I класса и HLA–DR достоверно отличался от соответствующего показателя контрольной группы (таблица 6).
Содержание растворимых молекул HLA I класса и HLA–DR
В группе женщин, страдающих злокачественными опухолями тела матки, уровни sСD50, ol.sСD54, sСD54 не отличались от нормы, но были достоверно ниже (р 0,05), чем у больных раком шейки матки – в 4,2; 2,9 и 2,4 раза соответственно.
Развитие миомы матки и аденомиоза сопровождалось повышением концентрации растворимых CD50 молекул по сравнению с контролем – в 1,5 (р 0,05) и 1,2 раза (р 0,05) соответственно. Уровни этих молекул в обеих группах статистически значимо превышали соответствующий показатель больных злокачественными опухолями тела матки – в 1,8 и 1,5 раза, но оставались достоверно ниже, чем у женщин, страдающих раком шейки матки – в 2,2 и 2,8 раза соответственно. Значения молекул ol.sСD54 в обеих группах достоверно не отличались от уровня показателя здоровых лиц, но были ниже (р 0,05), чем у больных раком шейки матки – в 3,2 раза. Содержание sСD54 у больных миомой матки и больных аденомиозом оставалось на уровне показателей здоровых лиц и было в обеих группах достоверно ниже, чем у больных РШМ – в 4,1 и 5,1 раза, и ниже (р 0,05), чем у пациенток со злокачественными опухолями тела матки – в 1,7 и 2,1 раза соответственно.
Представленные данные свидетельствуют о том, что изменения уровней sСD50, ol.sСD54, sСD54 молекул у больных различной гинекологической патологией носят разнонаправленный характер. При РШМ имеет место возрастание концентраций всех трех антигенов, у больных злокачественными опухолями тела матки содержание данных молекул остается на уровне показателей здоровых лиц, а у больных миомами наблюдается преимущественное повышение содержания растворимых CD50 молекул. Подобные изменения могут отражать особенности функционирования иммунной системы больных и быть взаимосвязанными с развитием того или иного заболевания. Растворимые CD50 молекулы характеризуются конститутивной экспрессией [25] и уровень экспрессии этого антигена не чувствителен к медиаторам воспаления. Можно предположить, что достоверное повышение сывороточного уровня растворимых CD50 молекул при гинекологической патологии может являться результатом ускоренного шеддинга молекулы СD50 с мембраны мононуклеарных клеток – лимфоцитов, макрофагов или нейтрофилов. Следствием таких изменений является торможение адгезионных процессов, участвующих в формировании механизмов цитотоксических реакций.
Неоспаримым этиопатогенетическим фактором развития РШМ является персистирующая инфекция, вызванная вирусом папилломы человека. В ряде исследований [26] показана высокая значимость растворимых молекул адгезии в защите от вирусных агентов. Вероятно, повышенный уровень sCD50, ol.sСD54 и sСD54 молекул, тормозя процессы адгезии, вносит свой вклад в формирование медленно развивающегося иммунного ответа на вирус папилломы человека.
Проведено исследование содержания sCD50, ol.sСD54 и sСD54 молекул в зависимости от типа гистологического строения опухоли у больных злокачественными опухолями тела матки (рис.9). боо - Концентрация SCD50, ol.sCD54 и sCD54, U/ml 500 - 488-8 400 473,5 300 200 100 353, 178,3"139,7 \i\ 1 162,5 69,51 т 114,7 109,7 94,01 I 131,4 65,3 1 2 3 4Обследованные группы – содержание растворимых CD50 молекул, – олигомерной фракции растворимых молекул CD54, – содержание суммарной фракции растворимых молекул CD54 Рисунок 9 – Содержание растворимых молекул CD50, CD54 в зависимости от типа гистологического строения опухоли 1 группа – аденокарцинома, n=55, 2 группа – железисто-плоскоклеточный рак, n=4, 3 группа – саркома матки, n=6, 4 группа – контрольная, n=45 – статистически значимые различия в сравнении с контролем, (р 0,05), – статистически значимые различия в сравнении с показателями больных саркомой матки, (р 0,05) У больных аденокарциномой уровень растворимых CD50 молекул (488,8+21,0 U/ml) превышал (р 0,05) показатели контрольной группы в 1,4 раза, концентрация ol.sСD54 (178,3+23,0 U/ml) достоверно не отличалась от нормы, а содержание sСD54 (139,7+28,2 U/ml) было выше (р 0,05) показателя здоровых лиц в 2,1 раза. В случае развития железисто–плоскоклеточного рака концентрация sCD50 молекул (473,5±32,5 U/ml) достоверно возрастала относительно контроля в 1,3 раза, но величины показателей ol.sСD54 (162,5±15,8 U/ml) и sСD54 (69,5±10,7 U/ml) не отличались от их значений в группе здоровых лиц. У больных саркомой матки содержание растворимых CD50 молекул (114,7±28,6 U/ml) было статистически значимо ниже, чем в контрольной группе – в 3 раза, концентрация ol.sСD54 (94,0±18,1 U/ml) не отличалась от нормы, уровень sСD54 (109,7±14,5 U/ml) был выше нормы в 1,6 раза (р 0,05).
Следует отметить, что в этой группе больных уровень растворимых CD50 и sCD54 молекул был достоверно ниже, чем у больных аденокарциномой – в 4,2 и 1,8 раза или железисто–плоскоклеточным раком матки – в 4,1 и 1,7 раза. Саркома матки характеризуется высоко агрессивным течением опухолевого процесса. Низкое содержание растворимых CD50 и sCD54 молекул у этой группы больных может свидетельствовать о снижении экспрессии CD50 и sCD54 молекул на моно-нукларных клетках и выраженных нарушениях процессов инициации иммунного ответа при данном заболевании.
Концентрации исследуемых белков были взаимосвязаны со степенью дифференцировки опухолевого процесса (таблица 13). У больных высокодиф-ференцированными аденокарциномами концентрация растворимых CD50 молекул в сыворотке крови превышала нормальный уровень в 1,3 раза (р 0,05), содержание ol.sСD54 было выше уровня нормы в 1,6 раза (р 0,05), а sСD54 – в 2,5 раза (р 0,05).
Содержание растворимых молекул CD50, CD54
По-видимому, выявленные изменения сывороточного содержания тестированных белков отражали особенности иммунных реакций на разных этапах течения бластоматозного процесса. Рост доброкачественного новообразования сопровождался количественной модификацией их содержания, особенно значимой на этапе формирования 4-6 миоматозных узлов. Возможно, более низкие концентрации тестируемых белков в сыворотке крови данной группы больных являются одним из факторов, определяющих вероятность мультицентричности очагов поражения.
Определенное взаимосвязанное влияние оказывало на содержание растворимых белков и расположение миоматозного узла. В случаях преимущественной интерстициальной, интерстициально–субсерозной или интерстици-ально–субмукозной локализации миоматозных узлов уровень растворимого CD95, растворимых молекул HLA I класса превышал соответствующее значение в контрольной группе. При интерстициальном или интерстициально– субмукозном расположении узлов сывороточное содержание растворимых молекул HLA–DR, CD38, CD50 достоверно превышало норму, а при интер-стициально–субсерозной локализации – не отличалось от нормы. Для последней локализации на уровне нормы находилось и содержание растворимых молекул СD54. Кроме того, у больных с интерстициальной локализацией узлов наблюдалось достоверное возрастание уровня растворимых молекул СD54, а при интерстициально–субмукозном расположении узлов содержание растворимых молекул СD54 не отличалось от соответствующих значений здоровых лиц.
У больных с преимущественной субсерозной локализацией миома-тозных узлов содержание растворимых молекул HLA I класса, CD38, CD50, СD54, CD95 не отличалось от нормы. Содержание растворимых молекул HLA–DR достоверно снижалось по сравнению с контролем. Необходимо отметить, что у больных с преимущественно субсерозной локализацией новообразований наблюдался наиболее низкий уровень в сыворотке крови и растворимых молекул HLA I класса и HLA–DR.
Преимущественная субмукозная локализация миоматозных узлов сопровождалась достоверным возрастанием сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса, HLA–DR, CD38, CD50, СD54 и CD95 по сравнению с контролем. Уровень растворимых молекул CD38, CD50, СD54, CD95 у больных с субмукозной локализацией миоматозных узлов был статистически значимо выше, чем во всех других сравниваемых группах.
По–видимому, выявленные отличия уровня белков являются одним из факторов, определяющих особенности клинического течения того или иного варианта заболевания, поскольку они выступают в роли эндогенных имму-номодуляторов, принимая непосредственное участие в реализации иммунного ответа, отличающегося у больных с различными локализациями миоматозных узлов.
Индивидуальный анализ изменения концентраций тестируемых растворимых белков в сыворотке крови больных миомами также позволил выделить факторы благоприятного и неблагоприятного прогноза заболевания. К факторам хорошего прогноза относятся: – исходно повышенное содержание растворимых молекул CD95, – повышенный уровень олигомерной фракции растворимых молекул CD54 К факторам плохого прогноза относятся: – исходно низкий уровень растворимых молекул CD95, – пониженный уровень олигомерной фракции растворимых молекул CD54, У больных раком шейки матки проведение хирургического вмешательства сопровождалось достоверным снижением уровней растворимых молекул HLA–DR, CD50, CD38, СD54, CD95. Однако содержание растворимого CD95,
CD38 и СD54 после выполнения операции по-прежнему превышало соответствующий уровень белка в контрольной группе. Сывороточные уровни растворимых молекул HLA–DR и CD50, повышенные по сравнению с контролем в предоперационном периоде, после выполнения оперативного вмешательства не отличались от нормы.
В группе больных злокачественными опухолями тела матки изменения уровней всех тестируемых белков в послеоперационном периоде были недостоверны. У больных эндометриозом в сыворотке крови зарегистрирована нормализация уровня олигомерной фракции растворимых CD38 молекул.
В группе женщин с миомами матки, перенесших в последующем различные виды оперативного вмешательства, были выявлены в предоперационном периоде значимые различия по уровню тестируемых белков. В случаях выполнения в последующем надвлагалищной ампутации матки с придатками в предоперационном периоде содержание всех тестируемых белков значимо превышало нормальный уровень. В группе, с выполненной в последующем консервативной миомэктомией, уровень растворимых молекул CD50, СD54, CD95 до операции не отличался от нормы, а содержание растворимых молекул HLA I класса и HLA–DR, CD38 превышало норму. У лиц, которым была выполнена надвлагалищная ампутация матки без придатков в предоперационном периоде, уровень растворимых молекул HLA I класса, CD38, CD50, CD95 достоверно превышал норму, содержание растворимых молекул HLA– DR, СD54 не отличалось от нормы.
Представленные данные свидетельствуют о том, что сывороточное содержание исследованных растворимых дифференцировочных молекул и растворимых молекул главного комплекса гистосовместимости в предоперационном периоде могут являться дополнительными критериями для отбора больных с целью последующего выполнения того или иного вида оперативного вмешательства.