Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1 Внеклеточные ДНК, свойства, роль 12
1.2 Источники внеклеточных ДНК 18
1.3 Преаналитический этап, методы выделения и количественного определения внеклеточных ДНК 22
1.4 Связь внеклеточных ДНК и онкологических заболеваний 31
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1 Общая характеристика обследованных групп 41
2.2 Описание используемых методов определения уровня вкДНК 44
2.3 Оценка аналитических характеристик и диагностической эффективности теста 46
2.4 Методы статистической обработки данных 51
2.5 Методология проведения метаанализа 52
Результаты собственных исследований и их обсуждение 54
Глава 3. Определение аналитических характеристик процедур сорбционного выделения с последующим флюориметрическим определением уровня вкДНК и прямого флюориметрического определения уровня вкДНК 54
3.1 Аналитическая валидация процедуры сорбционного выделения с последующим флюориметрическим определением уровня вкДНК 54
3.2 Аналитическая валидация процедуры прямого флюориметрического метода оценки уровня вкДНК 59
Глава 4. Оценка региональных референтных пределов методов, параметров биологической вариабельности показателей, диагностической эффективности тестов 65
4.1 Референтный предел методасорбционного выделения вкДНК с последующим флюориметрическим измерением концентрации 65
4.2 Референтный предел метода прямого флюориметрического измерения уровня вкДНК плазмы и сыворотки крови 69
4.3 Оценка параметров биологической вариабельности показателей 73
4.4 Оценка диагностической эффективности тестов 78
4.5 Расчет стоимости анализа определения уровня вкДНК 84
Глава 5. Клинические аспекты содержания вкДНК в плазме и сыворотке крови больных онкологическими заболеваниями 88
5.1 Клиническая характеристика пациентов 88
5.2 Уровень вкДНК в плазме и сыворотке крови больных онкологическими заболеваниями 90
5.2.1 Зависимость уровня вкДНК от локализации и стадии опухолевого процесса 90
5.2.2 Изменение уровня вкДНК в ответ на терапию 97
5.3 Доказательства опухолевого происхождения вкДНК 103
Заключение 110
Выводы 118
Практические рекомендации 120
Список сокращений 123
Список литературы 124
- Преаналитический этап, методы выделения и количественного определения внеклеточных ДНК
- Аналитическая валидация процедуры сорбционного выделения с последующим флюориметрическим определением уровня вкДНК
- Оценка диагностической эффективности тестов
- Доказательства опухолевого происхождения вкДНК
Преаналитический этап, методы выделения и количественного определения внеклеточных ДНК
Выбор оптимального метода, который будет использоваться для анализа уровня внеклеточной ДНК, один из главных спорных вопросов, который необходимо решить для применения данного биомаркера в клинической практике. Стандартных процедур выделения и количественного определения в настоящее время не существует. Параметры преаналитического и аналитического этапа пробоподготовки значительно влияют на концентрацию и фрагментацию вкДНК, начиная от взятия крови, хранения, заканчивая этапом обработки образца [138]. Опубликованные в литературе данные показывают, что в настоящее время активно обсуждается вопрос, что является лучшими источником для анализа вкДНК - плазма или сыворотка. Кроме того, неясно какой метод анализа, какие группы пациентов, типы опухолей, локализация опухолей, стадия влияют на этот феномен [33].
Преаналитический этап пробоподготовки требует стандартизации условий центрифугирования. Например, в процессе центрифугирования происходит лизис клеточных элементов крови, что может быть причиной побочного увеличения уровня вкДНК [107, 200]. В работах исследователей встречаются совершенно разные условия центрифугирования цельной крови для получения плазмы и сыворотки, а именно одноэтапное: 1800 g -10 минут [30], а также двухэтапное: 4000 g -10 минут, затем отбор супернатанта и последующее центрифугирование при 15000 g -30 мин [202] , 800 g – 10 минут, затем 16000 g – 10 минут [138], 1600 g -10 минут, затем 16000 g – 5 минут [32], 800 g -15 минут,1600 g – 15 минут [219]. Однако Arndt Т. в своей работе показал, что нет влияния скорости центрифугирования (400,800,1500,3000,1600 g) на уровень вкДНК. Тем не менее большнство авторов сходятся на мнении, что необходимо двухэтапное центрифугироание, т.е. сначала клетки крови должны быть удалены на первом медленном центрифугировании (чтобы избежать их разрушения и выхода ДНК), а затем остатки будут удалены кратковременным высокоскоростным микроцентрифугированием. J. H. van Ginkel et al. показали, что обнаружено 2-3-х кратное увеличение уровня вкДНК при одноэтапном центрифугировании, а дальнейшее изменение скорости второго центрифугирования давало сопоставимые результаты.
Кроме того, немаловажен и выбор антикоагулянта. Это может быть ЭДТА, цитрат, гепарин. J. H. van Ginkel et al. показали, что при использовании в качестве антикоагулянта цитрата и гепарина получаются наименьшие результаты по количеству вкДНК по сравнению с образцами при использовании ЭДТА. Это можно объяснить, по-видимому, тем, что вкДНК более стабильны с течением времени в матрице ЭДТА по сравнению с цитратом или гепарином [114, 156].
Увеличение уровня вкДНК было обнаружено после хранения цельной крови в течение 8 часов, что может быть связано с разрушением ядросодержащих клеток и выходом ДНК в внеклеточное пространство. Однако, предпочтительно обработать образец в течение не более 6 часов после взятия крови [33,34].
Развитие чувствительных и специфических подходов для детекции и количественного определения вкДНК в различных биологических жидкостях может помочь в применении данного теста в клинической практике. Различные методы могут быть использованы для выделения и очистки вкДНК, включая модифицированный метод высаливания, хроматографические смолы, магнитные частицы или гуанидин-тиоционат [35, 48, 182].
В настоящее время вкДНК наиболее часто выделяют с помощью коммерческих наборов, таких как QIAmp 96 spin blood DNA extractions kit (Suppliedby Qiagen), QIAamp DNA Blood MiniKit (supplied by Qiagen) [97, 219] BILATESTDNAKit, Quant-iTTM DNA High-Sensitivity Assay kit. Quant-iTTM DNA High-Sensitivity Assay kit характеризуется наиболее высокой воспроизводимостью и достоверностью результатов [102]. Автоматические системы для изоляции ДНК, такие как MagNaPureLC считаются лучше, чем ручные методы и позволяют получать более чистые образцы ДНК. Так как связь между внеклеточной ДНК и клеточной поверхностью достаточно слабая, внеклеточная ДНК, связанная с клеточной поверхностью может быть выделена из раствора ЭДТА. Другая часть ДНК связана с белками клеточной мембраны, но может быть элюирована обработкой клеток вместе с белками, связанными с ДНК [13], трипсином.
Остановимся более подробно на основных методах выделения и количественного определения уровня вкДНК.
1. QIAamp метод
QIAamp система предназначена для выделения геномной, митохондриальной, бактериальной ДНК, тотальной клеточной РНК, вирусных нуклеиновых кислот из широкого диапазона клинического материала для последующей амплификации нуклеиновых кислот. QIAamp набор представляет собой упрощенную систему для выделения нуклеиновых кислот с использованием спин-колонок или 96-луночных планшетов. Фенол хлороформная экстракция не требуется. Нуклеиновые кислоты связываются специфично с селикагелевыми мембранами, в то время как другие вещества проходят через них. Ингибиторы ПЦР, такие как, бивалентные катионы и белки полностью удаляются двумя эффективными этапами отмывки, оставляя чистые нуклеиновые кислоты, которые элюируются в воде или буфере (http://www.ebiotrade.com/buyf/productsf/qiagen/QIAamp_system).
2. Фенол - хлороформная экстракция
Этот метод основывается на получение двух фаз, в верхней содержится ДНК, в нижней - осажденные белки. Этот метод позволяет получать выделенную ДНК хорошего качества. Образцы крови должны храниться при комнатной температуре (18-22 С) не более чем 2 часа перед двойным центрифугированием. Высокая эффективность, низкая стоимость и хорошее качество получаемого продукта определяют предпочтительность этого метода при многих обстоятельствах для экстракции ДНК. Кроме того, модифицированный фенол-хлороформный метод позволяет экстрагировать больше вкДНК, чем QIAamp метод [218, 219]
3. Nucleospin метод
Основан на лизисе клеток, избирательной сорбции ДНК на колонках и полседующей отмывке ДНК. Это очень быстрая процедура, в результате которой получается ДНК высокой чистоты. Данный метод может использоваться для поиска и выделения небольших фрагментов ДНК [105]. При использовании этого метода в полученной ДНК возможна детекция точечных мутаций, микросателлитных альтераций, хромосомных альтераций (инверсии или делеции), гиперметилирования промоторной области [142].
Следующие методы могут быть использованы для детекции и количественного определения вкДНК:
1. Метил-специфичная ПЦР - метод, позволяющий оценить статус метилирования индивидуальных CpG-островков. Процедура состоит в предварительной обработке тестируемых образцов ДНК бисульфитом натрия, что при определенных условиях приводит к дезаминированию цитозина с образованием урацила, тогда как метилированные остатки цитозина остаются неизменными. При последующей ПЦР урацил заменяется на тимин (http://www.findpatent.ru/patent/240/2405837.html, б.д.), обладает 96% чувствительностью и 88% специфичностью [28, 127, 145]. Так, например, при использовании метода метил-специфичной ПЦР рядом авторов показано, что в ДНК плазмы крови метилированная форма хотя бы одного из трех генов опухолевой супрессии RASSF1A, Cyclin D2 и RARb2 встречается у 13% больных фиброаденомой и 60% больных раком молочной железы [13,14,15], у клинически здоровых женщин метилированные маркеры в составе внеклеточной ДНК не выявляются.
2. Количественная ПЦР в реальном времени. Количественное определение циркулирующих нуклеосом может быть осуществлено как с помощью ПЦР в реальном времени, так и с помощью ИФА. Количественная ПЦР - широко распространенная методика для определения уровня вкДНК в плазме. Однако, контаминация образцов ядросодержащими клетками может влиять на истинную концентрацию вкДНК. Плазму отделяют от клеток путем центрифугирования. Chiu и коллеги [43] показали, что двойное центрифугирование (800 g или1,600 g) позволяет получать лучшие результаты, чем центрифугирование на высокой скорости или фильтрация или одноэтапное центрифугирование.
3. Иммунологические методы, например, ИФА. Нуклеосомная ДНК может быть также оценена с помощью методов ИФА [87, 206]. Развиваются методы ИФА с использованием мышиных моноклональных анти-гистон 3 антител и моноклональных мышиных антител, распознающих эпитоп на комплексе гистона Н2А, гистона Н2В и двуцепочечной ДНК, находящейся в нуклеосоме [206]. Эта методика позволяет сделать протокол количественного определения уровня вкДНК более достоверным и воспроизводимым [223].
Аналитическая валидация процедуры сорбционного выделения с последующим флюориметрическим определением уровня вкДНК
Предел обнаружения метода, рассчитанный в соответствии с рекомендациями ГОСТ Р ИСО 11843-2-2007 составил 16,9 нг/мл, в соответствии с ГОСТ Р ИСО 11843-3-2007 составил 11,2 нг/мл (рис.1). Эти величины существенно ниже, чем уровень вкДНК, определенный флуориметрическим методом, приведенный в статьях разных авторов [45, 192].
Результаты оценки влияния матрицы на параметры функции отклика приведены в табл.7.
Вариация значения функции отклика (параметр “а”, табл. 7) при разведении плазмой, очевидно, связана с неодинаковым содержанием аналита в разных биологических образцах. Коэффициент чувствительности (“b”,табл.7) и коэффициент детерминации (R2) при использовании всех трех матриц был близок к 1. Значение параметра b статистически значимо не отличалось при использовании всех трех матриц. Таким образом, существенного влияния матрицы на результаты определения ДНК не выявлено.
Однократное замораживание не влияет на уровень вкДНК (р=0,67). При последующих циклах происходит статистически значимое повышение концентрации ДНК (рис.2).
Относительная ошибка данных ([вкДНК]/[вкДНК]свежей, %) увеличивается после второго размораживания образца до 54 %. Это может являться следствием того, что количество ДНК в ядрах клеток значительно превосходит их уровень во внеклеточном пространстве. Поэтому лизис нескольких оставшихся в супернатанте клеток может значительно увеличить уровень вкДНК.
Результаты изучения влияния хранения образца крови при комнатной температуре до центрифугирования представлены на рис.3.
Хранение образца крови до центрифугирования от 1 часа до 4 при комнатной температуре не оказывает существенного влияния на уровень вкДНК (рис.3), при хранении образца более 4 часов происходило статистически значимое повышение уровня вкДНК на 24%, что может быть связано с выходом ДНК из клеток крови. Поэтому образцы плазма должны быть отделены от клеток крови не более чем через 4 часа после венепункции.
При изучении хранении образца плазмы при -20С в течение 2-х месяцев выявлена стабильность получаемых результатов уровня вкДНК (рис.4).
Таким образом хранение образца плазмы при -20С в течение 2-х месяцев не приводит к достоверному изменению уровня внеклеточной ДНК (рис.4).
Согласно рекомендациям ГОСТ Р 53022.3-2008 и ICH определены показатели междневной и внутридневной вариабельности для двух уровней вкДНК плазмы. Результаты оценки сходимости и воспроизводимости представлены в табл.8.
При оценке воспроизводимости процедуры анализа уровня вкДНК в плазме крови для различных концентраций вкДНК - 38,2 нг/мл, 295,7 нг/мл коэффициент вариации составил соответственно 8,1 %, 8,3%. При оценке сходимости результатов коэффициент вариации при уровне вкДНК 54,5 нг/мл составил 5,9%, при уровне 180,5 нг/мл составил 4,8%.
Оценка диагностической эффективности тестов
С помощью ROC-анализа установлено, что для образцов плазмы оптимальное пороговое значение содержания вкДНК составило более 50 нг/мл, в то время как для образцов сыворотки - более 90 нг/мл (рис.19).
Параметр AUC оказался практически равным при использовании сыворотки и плазмы, и составил 0,85 и 0,87 соответственно. Т.е. можно заключить, что выбор биологического материала не оказывает существенного влияния на диагностическую эффективность метода оценки уровня вкДНК крови.
С учетом установленных оптимальных пороговых значений принятия клинического решения параметры диагностической чувствительности и специфичности составили 87,1; 84,3 для плазмы, и 73,5;97,5 для сыворотки соответственно (таблица 15,16).
При исследовании образцов плазмы тест оценки уровня вкДНК обладает чувствительностью 88% и специфичностью 84%, т.е. при выборе порогового значения принятия клинического решения в 50 нг/мл мы правильно идентифицируем 88% больных и 84% здоровых.
При использовании образцов сыворотки метод характеризуется чувствительностью 73,5% и специфичностью 97,5%, т.е. при выборе порогового значения принятия клинического решения в 90 нг/мл мы правильно идентифицируем 73% больных и 97,5% здоровых.
Учитывая прогностическую ценность положительного результата, можно заключить, что при повышении порогового значения вероятность диагностировать заболевание составляет 90,2 % и 98,4% при использовании плазмы и сыворотки соответственно. В то же время вероятность не диагностировать заболевание при отсутствии повышения уровня вкДНК составляет 79,6 % и 63,9% при использовании плазмы и сыворотки соответственно. Согласно показателю RR, вероятность диагностировать онкозаболевание при использовании плазмы возрастает в 4,4 раза, при использовании сыворотки в 2,7 раза. Можно заключить, что вкДНК как биомаркер по диагностической чувствительности и специфичности не уступает показателям эффективности других онкомаркеров. Так, например, чувствительность теста определения уровня онкомаркера СА – 125 составляет 71-78%, а специфичность 75-94%, чувствительность теста определения уровня простатического специфического антигена (ПСА) составляет 73–91%, а специфичность-55–81%. [http://www.biochemmack.ru/][9].
Однако с точки зрения клинической диагностики для практикующего врача более важными и информативными показателями являются прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов.
Учитывая распространённость онкологических заболеваний (0,368% по региону по данным Росстата 2016 г), прогностическая ценность положительного результата составляет всего 2,2%, в то время как прогностическая ценность отрицательного результата - 99,9%. Таким образом, при уровне вкДНК плазмы, не превышающем пороговое значение, можно практически с 100% вероятностью утверждать отсутствие онкологического заболевания у обследуемого. При распространённости заболевания 62%, как в исследуемой нами выборке, прогностическая ценность положительного результата составила 90,2%, прогностическая ценность отрицательного результата - 79,6%. Аналогично в случае с использованием образцов сыворотки. При учёте распространённости онкозаболеваний прогностическая ценность положительного результата составляет 10,2 %, прогностическая ценность отрицательного результата - 99,9%, в то время как в исследуемой выборке прогностическая ценность положительного результата - 98,4%, прогностическая ценность отрицательного результата - 63,9%.
Таким образом, учитывая распространённость онкозаболеваний, при низкой прогностической ценности положительного результата и очень высокой прогностической ценности отрицательного результата тест определения уровня вкДНК крови может быть перспективным для диспансерного обследования населения с целью выявить отсутствие онкозаболеваний различных локализаций. Однако, для практического применения данного биомаркера в лабораториях онкологических диспансеров, где распространённость новообразований примерно, как в исследуемой нами выборке, тест может быть многообещающим для мониторинга течения и выявления возможных рецидивов при онкологических заболеваниях.
Доказательства опухолевого происхождения вкДНК
В 1988 г. в Стокгольме на 5-й Международной конференции по ОМ человека было использовано следующее определение: «Биохимические опухолевые маркеры – это вещества, образуемые опухолевыми клетками и секретируемые в биологические жидкости, в которых они могут быть количественно определены неинвазивными методами». Т.е. для использования какого-либо биомаркера в качестве онкомаркера необходимо, прежде всего, четкое понимание природы его происхождения. Наличие мутаций, обнаруженных и в опухолевой ткани и в вкДНК, может служить доказательством опухолевого происхождения вкДНК. В связи с небольшим числом исследуемых выборок больных НМРЛ в работах, для адекватной статистической оценки соответствия мутационного статуса опухоли и вкДНК мы сочли необходимым провести мета-анализ. Кроме того, новым этапом развития лекарственного лечения злокачественных новообразований должно стать внедрение в клиническую практику методов молекулярно-генетической диагностики. В частности, получение информации о наличии мутации в гене EGFR (мутация L858R в 21 экзоне и микроделеции в экзоне 19 (747 - 750 нуклеотиды) гена EGFR) при НМРЛ может дать информацию о целесообразности назначения дорогостоящих химиопрепаратов - ингибиторов тирозинкиназы. Достаточно остро стоит проблема получения качественных образцов опухоли, что связано с инвазивностью данной процедуры. Поэтому актуальным является исследование присутствия активирующих мутаций в гене EGFR в вкДНК крови.
Количество публикаций в поисковых системах PubMed, MEDLINE по ключевым словам cell free DNA, EGFR, circulating DNA, NMCL, Non-Small Cell Lung Cancer, circulating tumor DNA, free DNA увеличивается с каждым годом (рис. 32), что указывает на возрастающий интерес к данной проблеме.
Для проведения метаанализа был выполнен поиск по ключевым словам. Было найдено 588 публикаций, 381 работа была удалена после прочтения названия и резюме. Более тщательной оценке подвергнуто 207 статей, из них только 91 работа подошла под критерии включения в обзор. Т.к. главным параметром для анализа были данные о сопоставимости встречаемости мутации гена EGFR (19,21 экзон), то для анализа использовались 28 работ (рис.33)
При выполнении анализа показано отсутствие гетерогенности между исследованиями (Q=0,001699, I2=0), средневзвешенный процент совпадения мутационного статуса опухоли и вкДНК крови составил 88,1 %(95%-ДИ 86,96-89,18) (табл. 23).
Нами исследован мутационный статуса вкДНК плазмы и ткани опухоли, детектирована микроделеция в 19 экзоне гена EGFR у пациентки с положительным мутационным статусом опухоли, все остальные образцы вкДНК были с диким типом гена EGFR (табл.24).
Т.е. процент совпадения мутационного статуса опухоли и вкДНК крови (конкорданс) составил 92,3% (95-%ДИ 63,9-99,8%).
Исходя из проведенного метаанализа видно, что даже несмотря на небольшой объем выборки нами получены сходные с средневзвешенными показателями данные.
Можно заключить, что полученные результаты могут говорить о возможном опухолевом происхождении вкДНК, что открывает новые возможности для понимания биологической роли вкДНК плазмы крови.