Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Регуляция реакций врождённого иммунитета при действии вирусов гриппа и противовирусных иммуномодулирующих препаратов Полосков Владислав Васильевич

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Полосков Владислав Васильевич. Регуляция реакций врождённого иммунитета при действии вирусов гриппа и противовирусных иммуномодулирующих препаратов: диссертация ... кандидата Медицинских наук: 14.03.09 / Полосков Владислав Васильевич;[Место защиты: ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2018

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 12

1.1. Активация, дифференцировка и свойства моноцитов и макрофагов (Мф) 12

1.2. TLR/RLR-рецепторы и их сигнальные реакции 25

1.3 Антивирусные препараты с иммуномодулирующей активностью 31

1.4 Гриппозная инфекция в иммунокомпетентных клетках 42

1.5 Иммунное узнавание вирусов гриппа А TLR/RLR-рецепторами 51

1.6 Противогриппозные вакцины – активаторы сигнальных реакций врождённого иммунитета 59

1.7 Заключение к обзору 62

Глава 2. Материалы и методы исследования 64

Материалы 64

2.1. Препараты и TLR-агонисты 64

2.2 Факторы клеточной пролиферации и дифференцировки 65

2.3 Гриппозные вакцины 65

2.4 Вирусы гриппа А 66

2.5 Клетки крови и клеточные культуры 67

2.6 Химические реактивы 68

2.7 Олигонуклеотидные ПЦР-праймеры 69

Методы исследования 69

2.8 Дифференцировка моноцитов в макрофаги (Мф) in vitro 69

2.9 Обработка ТНР-макрофагов TLR –агонистами 70

2.10 Постановка опытов с противогриппозными вакцинами на клетках крови и ТНР-1. 70

2.11 Заражение клеток вирусами гриппа А 71

2.12 Титрование инфекционности вирусов гриппа А 71

2.13 Количественное определение экспрессии генов 72

2.14 Методы количественной иммунометрии 74

2.15 Лабораторное оборудование 76

Глава 3. Результаты исследований 77

3.1. Стимуляция интерферонами (ИФН), ИФН-индукторами и иммуномодуляторами сигнальных TLR/RLR-реакций в клетках человека 77

3.1.1 Сравнение уровней экспрессии TLR/RLR-генов в клетках моноцитарной лейкемии ТНР-1 и аденокарциномы толстого кишечника 77

3.1.2 Сигнальные механизмы действия Ридостина в опухолевых клетках 80

3.1.3 Влияние препаратов на СD-фенотипы клеток ТНР-1 81

3.1.4 Сигнальные механизмы иммуномодулирующего и антивирусного действия препаратов Ингавирин и Тимоген в клетках крови и ТНР-1 82

3.2. TLR/RLR-механизмы дифференцировки моноцитов в макрофаг-подобные клетки in vitro 87

3.2.1. Индукция дифференцировки ТНР-1 моноцитов комплексом митогенов 87

3.2.2 Активность и дифференцировка ТНР-1 моноцитов обработкой форбол-миристат-ацетатом (РМА) 92

3.2.3 Действие TLR/RLR-агонистов на ТНР-РМА дифференцированные макрофаги 94

3.2.4 Индивидуальные TLR/RLR-реакции моноцитов крови доноров на гранулоцитмакрофаг-колониестимулирующий фактор (GM-CSF) 98

3.3. Взаимодействие вирусов гриппа А с иммунокомпетентными клетками 100

3.3.1 Инфекция лимфоцитов крови доноров рекомбинантным вирусом гриппа A/PR8 H1N1/ H5N1 и его «эскейп» мутантом m13(13) 101

3.3.2. Инфекция пандемическим «свиным» вируса гриппа А H1N1 (Москва, 2009) моноцитарных GM-макрофагов 108

3.3.3 Чувствительность ТНР-1 моноцитов к пандемическому «свиному» вирусу H1N1 (Москва, 2009) 114

3.3.4 Абортивная инфекция ТНР-РМА макрофагов вирусами гриппа подтипов Н1, Н5 и Н9 115

3.4. Иммунные сигнальные механизмы действия противогриппозных вакцин «Гриппол», « Инфлювак» и «Ваксигрип» 124

3.4.1. Стимуляция экспрессии генов врождённого и адаптивного иммунитета вакцинами 125

3.4.2. Цитокиновый ответ клеток крови на вакцины 128

Глава 4. Обсуждение 131

Выводы 150

Приложение 150

Список литературы 155

Активация, дифференцировка и свойства моноцитов и макрофагов (Мф)

Мононуклеарная фагоцитирующая система (mononuclear phagocyte system - MPS) состоит из клеток, которые имеют плейотропные биологические свойства ответственные за фагоцитоз, продукцию цитокинов и антигенную презентацию [Wynn et al., 2013; Juhas et al., 2015]. MPS включает миелоидные предшественники, моноциты циркулирующие в крови, тканевые макрофаги (Мф) и дендритные клетки (Дк) моноцитарного происхождения. Эта система обеспечивает специфические воспалительные реакции, приводящие к активации моноцитов периферической крови и поступлению их в ткани, где они дифференцируются в зрелые Мф и Дк (рис.1).

Моноциты образуются из клеток общего миелоидного предшественника костного мозга (common bone marrow myeloid progenitor cells - CMPs). Они могут трансформироваться в две отдельные клеточные линии – Мф и Дк. Процесс дифференцировки индуцируется цитокинами IL-3 (interleukin 3), GM-CSF (granulocyte–macrophage colony stimulating factor) и M-CSF (macrophage colony stimulating factor). Комбинация GM-CSF и IL-4 индуцируют дифференцировку моноцитов в Дк. Активность Мф зависит от их локализации и сигналов микроокружения [Glass, Natoli, 2016].

Моноциты короткоживущие клетки, которые подвергаются спонтанному апоптозу ежедневно [Fahy et al.,1999]. Воспалительные ответы повышают выживаемость моноцитов и вызывают их дифференцировку. Эти реакции определяют гетерогенный популяционный состав клеток крови и тканей. Отсутствие адекватных стимулов приводит к спонтанному апоптозу моноцитов. Когда воспаление отсутствует, то в крови может повышаться содержание моноцитарных предшественников и снижается необходимое количество нормальных тканевых Мф. Мф образуются из циркулирующих в крови или тканевых воспалительных моноцитов. В ответ на инфекцию или воспаление моноциты мигрируют в ткани, где они формируют пул резидентных Мф, дифференцированных в фенотипы М1 и М2 [Rey-Giraud et al., 2012].

Гетерогенность и пластичность макрофагов Мф являются гетерогенной клеточной популяцией и хорошо адаптируются к изменяющимся условиям [Gordon, P.R.Taylor, 2005].

Срок жизни цикл Мф составляет от нескольких месяцев до года. Различные резидентные Мф являются высокоспециализированными клетками многих тканей и органов, где они регулируют гомеостаз (рис.2). Две различные популяции моноцитов в клетках крови: резидентные и воспалительные дифференцируются в тканях в широкий спектр тканевых Мф [Mosser, Edwards, 2008]. Фенотипическая гетерогенность Мф зависит от клеточного микроокружения, вида воздействующих микробных структур и проявляется спектром образуемых цитокинов.

Фенотипы и функции Мф меняются под воздействием окружающих иммунных клеток (Тh1, Тh2, NK, CD8+ лимфоцитов, APC и гранулоцитов) (рис.3).

Классически-активированные Мф обладают микробицидной активностью. По свойствам выделяют ранозаживляющие Мф и регуляторные Мф. Регуляторные виды Мф образуются под действием иммунных комплексов, простагландинов, лигандов G-рецепторов, глюкокортикоидов, апоптотических клеток. Они продуцируют значительные количества IL10 - супрессора иммунного ответа. В ряде исследований найдены отличия в спектрах экспрессии генов моноцитов и Мф из разных источников, имеющие разные уровни дифференцировки [Schmid et al., 2004; Kohro et al., 2004].

Рецепторы моноцитов и макрофагов

Мф содержат многие виды клеточных рецепторов для распознавания молекулярных структур патогенов, осуществления фагоцитоза и индукции процессов дифференцировки [Taylor P.R. et al., 2005]. Рецепторы расположены на поверхности, в эндосомах и цитозоле (рис. 4). Некоторые виды этих рецепторов локализованы в вакуолях, куда проникают внутриклеточные патогены.

К группе NTLRs (nonoll-like receptors) Мф относятся C-тип лектиновых рецепторов (СRLs), ранее считавшиеся противогрибковыми. Теперь показано участие СRLs в проникновение вирусов гриппа [Dambuza, Brown, 2015]. Scavenger рецепторы (CD36, SREC, LOX-1) удаляют апоптотические клетки и токсические молекулы из циркуляции.

Интегриновые и иммуноглобулиновые Fc-рецепторы участвуют в фагоцитозе и эндоцитозе. В структуре Fc-рецепторов имеются ингибирующий и активирующий мотивы (ITIM и ITAM, соответственно) [Colonna et al., 2000]. Маннозный рецептор CD206 и макрофаг-рецептор с коллагеновой структурой (MARCO) играют важную роль в процессе взаимодействия с патогеном. Дополнительно на Мф представлены рецепторы провоспалительных цитокинов TNF- и IL1. В центре воспалительных сигнальных реакций рецепторов находятся универсальный фактор транскрипции NFkB (nuclear factor-B) и группа фосфорилирующих протеинкиназ [Hayden et al., 2006; Hu et al., 2007]. Активация MAPKs (mitogen-activated protein kinases), NF-kB and IRFs (interferon regulatory factors) приводит к освобождению цитокинов, хемокинов и ростовых факторов [Hayden, Ghosh, 2008; Lehtonen et al., 2005].

Особое значение имеют рецепторы врождённого иммунитета TLR/RLR/NRLs, которые узнают структуры патогенов (вирусов, бактерий, грибов и погибших клеток) и реагируют на сигналы опасности. Виды TLR-рецепторов, представленные в различных типах иммунокомпетентных клеток, приведены в таблице 1.

TLR-рецепторы участвуют в процессах дифференцировки иммунокомпетентных клеток лимфоидного и миелоидного происхождения и их плюропотентных предшественников. Регуляция их активности имеет значение в лечении лейкозов и лимфом [Visintin et al., 2001; McGettrick, O Neill, 2007]. Показано, что в клетках костного мозга CD34+ экспрессируются рецепторы TLR7 и TLR8 и их индукция вызывает дифференцировку предшественников в Мф и Дк [Sioud et al., 2006]. Однако активация лигандами экспрессии TLR-рецепторов в ряде линий клеток миелоидного лейкоза не всегда вызывает их дифференцировку [Okamoto et al., 2009].

Механизмы влияния гемопоэтических факторов на дифференцировку и микробицидную активность моноцитов не полностью ясны, но показано участие в этих процессах TLR/RLR-рецепторов врождённого иммунитета [O Mahony et al., 2008]. LPS, специфический лиганд рецептора TLR4, изучен как активатор моноцитов in vitro наиболее подробно. Определены транскрипционные и протеомные профили ответов моноцитов на LPS [Tarasova et al., 2016].

Нарушения в регуляции экспрессии TLR-рецепторов в опухолевых клетках и изменения в структуре рецепторных генов (полиморфизм) ассоциированы с патогенезом ряда гематопоэтических нарушений и форм рака [Pandey Singh et al., 2015]. Коррекция TLR-лигандами уровней воспалительного ответа является новым подходом к противоопухолевой терапии [Cannova et al., 2015]. Исследования действия лигандов TLR-рецепторов проводятся на моделях моноцитов и Мф различного происхождения [Cabanski et al., 2008]. На миелоидных Дк представлены рецепторы TLR3 и RIG1 для дсРНК [Perrot et al., 2010].

В различных типах иммунокомпетентных и опухолевых клеток определены профили экспрессии мРНК рецепторов врождённого иммунитета. Данные определения уровней экспрессии мРНК и белков-антигенов TLRs не всегда совпадают. Это объясняется неэффективным проникновением специфических антител при анализе внутриклеточных рецепторов. Кроме того, это может быть вызвано действием специальных видов микроРНК, регулирующих активность TLR-генов [Forster et al., 2015].

Иммунное узнавание вирусов гриппа А TLR/RLR-рецепторами

Знания о роли рецепторов врождённого иммунитета в развитии гриппозной инфекций пока очень ограниченные и, в основном, получены в модельных системах in vitro и на мышах [Iwasaki, Pillai, 2014]. Тем не менее, результаты на больных гриппом согласуются с данными полученными на животных и в клеточных моделях. Сигнальные реакции ТLR/RLR-рецепторов прежде всего контролируют иммунные реакции на ранних этапах гриппозной инфекции.

Уровни активация ТLR/RLR-рецепторов позитивно коррелирует с уровнями вирусной репликации в респираторном тракте. Мультивариантный анализ подтвердил ассоциацию рецепторов врождённого иммунитета с тяжестью заболевания, сроком инфекции, вирусными штаммами и возрастом пациентов. Взаимодействие агонистов с ТLR-рецепторами быстро стимулирует реакции врожденного иммунитета и обеспечивает неспецифическую защиту от летальной гриппозной инфекции. Показана роль TLR-рецепторов и в регуляции адаптивных иммунных ответов [Iwasaki, Pillai, 2014].

Система врождённого иммунитета реагирует на вирус гриппа 3-мя классами TLR/RLR-рецепторов: TLR3 (лиганд дсРНК), TLR7 и TLR8 (лиганд осРНК), RIG-I (вирусная 5-рррРНК) [Ichinohe 2010; Brennan, Bowie, 2010; Lee et al., 2013). Показан рост уровней экспрессии ТLR7/8 в Мф и Дк при взаимодействии с вирусными РНП [Weber et al., 2013; Pulendran, Maddur, 2015]. Недавно появилась информация об участии рецептора TLR10 в иммунном ответе на вирус гриппа А [Lee et al., 2014]. RIG-I и NLRP3 определяют вирус, представленный в цитоплазме заражённых клеток. TLR7/ TLR8 реагируют на вирусную РНК в эндосомах. Исследования с высокими дозами вирусов гриппа А на мышах с дефектами в TLR/RLR-рецепторах и их сигнальных факторах позволили оценить их роль в антивирусной защите и адаптивных иммунных ответах. Полученные данные о роли иммунных рецепторов в развитии гриппозной инфекции противоречивы [Koyama et al. 2007]. Суммируя участие TLR/RLR-рецепторов при гриппозной инфекции можно сказать, что узнавание вирусных РНК даёт спектр иммунных реакций, в котором важен не только противовирусный ответ, обусловленный ИФН, но и воспалительный, влияющий на реакции адаптивного иммунитета, хотя в ряде случаев сильное воспаление приводит к повреждению и гибели клеток. Процессы дифференцировки моноцитов и локализация Мф влияют на чувствительность Мф к гриппозной инфекции и являются проявлением антивирусной стратегии со стороны иммунной системы [Cao et al., 2012; Hou et al., 2012; Strauss-Ayali et al., 2007].

На рисунке 19 (А, Б, C) представлены реакции TLR/RLR-рецепторов на структуры вирусов гриппа, проникшие в иммунокомпетентные клетки. Это приводит к экспрессии NF-B-зависимых провоспалительных цитокинов и ИФН типа 1 и ISGs с участием IRF3.

Мышь с делецией рецептора TLR3 выживает при летальной дозе вируса, хотя в её лёгких находятся большие количества вируса. Однако у такой мыши индуцируются CD4+/ CD8+ T клеточные ответы и образуются специфические антитела.

Геномные РНК освобождаются из вирионов в «кислых» эндосомах. В плазмацитоидных Дк рецептор TLR7 узнают вирусные РНК и индуцируют NF-B и IRF7 зависимую активацию генов воспалительных цитокинов и ИФН [Lund et al., 2004; Diebold et al., 2004]. Такое узнавание не требует вирусной репликации (рис.19 Б). Есть основания считать, что защитное действие TLR7 связано с усилением продукции антител В-клетками.

RIG-I осуществляет узнавание 5-рррРНК, образующихся при вирусной репликации, РНК-дефектных интерферирующих частиц. вирусных РНК в цитоплазме (рис.19 С) [Kato et al., 2005; Hornung et al., 2006; Rehwinkel et al., 2010]. Активируется митохондриальный сигнальный белок MAVS и индуцируются гены провоспалительных цитокинов и ИФН типа I.Хеликазный домен RIG-I взаимодействует с АТФ и каспазным доменом митохондриального сигнального адаптора MAVS [Kowalinski et al. 2011].

Так как вирус гриппа реплицируется в ядре, было не ясно как хеликаза RIG-I обнаруживает вирусную РНК. Недавно выяснили, что RIG1 проникает в антивирусные стресс-гранулы, где находятся вирусная РНК и дсРНК-зависимая протеинкиназа. NS1 белок вируса гриппа блокирует RIG-I сигналы [Gack et al., 2009; Wu W. et al., 2012].

Матриксный белок M2 (активатор ионного канала) в аппарате Golgi стимулирует образование NOD-, LRR- и NLRP3 инфламассомы, происходит активации каспазы 1 и освобождаются зрелые IL1-beta и IL18.

PB1-F2 фибрилы накапливаются в фагосомах, где активируется NLRP3 и освобождаются зрелые IL1-beta и IL-18. Воспалительный ответ во многом связан с белком NLRP3, который образует мультипротеиновый комплекс инфламмасомы (рис. 19 С). Комплекс состоит из адаптора ASC и прокаспазы 1. После активации каспаза 1 превращает IL-1 и IL-18 в активную секретируемую форму. Существует несколько стимулов образования инфламмасомы: повреждение мембран, стресс и вирусная инфекция [Guarda et al., 2011; Pothlichet et al., 2013]. Белки NLRP3 найдены в миелоидных клетках (моноциты, Мф, Дк, нейтрофилы) и в клетках человеческого эпителия. Структуры вируса гриппа (РНК, белок М2, комплекс PB1-F2 в лизосомах) усиливают транскрипцию генов IL-1, IL-18 и NLRP3. Генные ответы опосредованы TLR-рецепторами и рецепторами IL-1 и TNF-alpha [Ichinohe et al., 2010; McAuley et al., 2013]. Митохондрии играют ключевую роль в NLRP3-активации в заражённых вирусом гриппа клетках.

Существуют две различных стратегии развития инфекции: элиминация патогена и снижение негативных эффектов воспаления. Резистентность к инфекции реализуется способностью к узнаванию, продукцией ИФН-ов и элиминацией патогена путём подавления или ограничения его репродукции. Макрофаги продуцируют ИФН типа 1. ИФН также образуют пневмоциты и плазмацитоидные Дк [Hogner et al., 2013].

Толерантность достигается путём контроля уровня воспалительного ответа и снижения тканевого повреждения, индуцированного патогеном. Организм чувствителен к инфекции, если неспособен снизить вирусную нагрузку или проявить толерантность к негативным последствиям иммунного ответа к инфекции.

Воспаление и толерантность к болезни

Значение NLRP3 инфламмасом в защите от вируса гриппа показано в ряде исследований [Medzhitov et al., 2012; Schmitz et al., 2005] (таблица 4). Хеликаза RIG-I может взаимодействовать с ASC, формируя инфламмасому в заражённых клетках эпителия. Таким образом, при гриппозной инфекции известны два вида инфламмасом: NLRP3 в миелоидных клетках и RIG-I в эпителиальных [Kanneganti et al. 2010].

Действие TLR/RLR-агонистов на ТНР-РМА дифференцированные макрофаги

В дифференцированных ТНР-РМА Мф, имеющих высокие уровни экспрессии генов сигнальных TLR/RLR-рецепторов на 5 день активации, изучен механизм иммунной толерантности. Для этого использована группа TLR-агонистов из набора фирмы «InvivoGen»: TLR3 - polyIC HMW и LMW (дсРНК высокого и низкого Мв), TLR8 - ssRNA40 (осРНК), отечественный препарат Ридостин (смесь дсРНК и осРНК дрожжей). На рис. 31 показаны уровни накопления в ПЦР специфических ДНК-амплификатов и последующий анализ их в агарозном геле.

В пробах ТНР-РМА Мф без TLR-агонистов (кривые 1) величины пороговых циклов (Сq) меньше величин Cq в пробах с добавлением TLR-агонистов (кривые 2-5). Это означает подавление агонистами экспрессии генов в активированных ТНР-РМА Мф. Разница Cq (THP-PMA) – Cq(ТНР-РМА+агонисты) отрицательная (таблица 11).

Исключением является стимуляция Ридостином транскрипции гена MDA5. Между агонистами имеются определённые отличия по выраженности действия. Вместе с тем, разные РНК-агонисты имеют и перекрёстные мишени. Наблюдается сильный ингибирующий эффект агонистов в дифференцированных ТНР-РМА Мф на эндосомальный ген TLR3 и гены цитоплазматических сенсоров RIG1/MDA5, хотя в необработанных РМА клетках ТНР-1 Ридостин был активатором транскрипции широкого спектра TLR/RLR-генов. PolyIC LMW и Ридостин снижают транскрипцию группы генов TLR3, 7, 8, 9. PolyIC НMW преимущественно подавляет экспрессию генов TLR3, 9. SsRNA40 ингибирует активность генов TLR3, 8, 9. В большей степени TLR-агонисты подавляют активность генов TLR3/9 и, в меньшей степени, транскрипцию гена TLR4.

В активированных ТНР-РМА Мф polyIC HMW и Ридостин почти не оказывают влияния на гены группы факторов сигнальных путей (рис. 32).

По оси абсцисс название генов, по оси ординат кратность изменений их активности. Контроль ТНР-РМА Мф принят равным 1 (черный), ТНР-РМА Мф + poly IC HMW (белый), ТНР-РМА Мф + Ридостин (косая штриховка). Достоверные различия между вариантами при р 0,05 обозначены звёздочками.

TLR-агонисты не влияют на активность гена фактора транскрипции NFkB и слабо стимулируют транскрипцию генов адаптора MyD88 и ИФН-регулируемого фактора IRF7. Агонисты заметно подавляют транскрипцию генов ИФН-зависимых путей - IRF3, IPS и TRIF. Ответ дифференцированных ТНР-РМА Мф на TLR3,7/8 -агонисты похож на наблюдаемый в зрелых Дк с LPS-агонистом TLR4 [Visintin, 2001]. Это даёт нам основание считать, что в ТНР-РМА Мф активация сигнальных процессов достигает максимума и включается механизм альтернативной регуляции или генной толерантности [Ivashkiv, 2011]. Поэтому препарат Ридостин - эффективный активатор TLR/RLR генов в клетках крови человека и моноцитарной лейкемии ТНР-1 конкурирует с действием РМА в Мф [Соколова и др., 2015, 2017].

Несмотря на транскрипционную конкуренцию с агонистами ТНР-РМА Мф продолжают синтезировать и секретировать цитокины (таблица 12).

Добавление TLR-агонистов polyIC HMW, ssRNA40 и Ридостина к дифференцированным ТНР-РМА Мф усиливает секрецию IL1-бета и TNF-alpha.

Таким образом, впервые показано, что дифференцировка ТНР-1 моноцитов в Мф под действием РМА сопровождается активацией сигнальных механизмов врождённого иммунитета с участием генов TLR/RLR-рецепторов, их адапторов и транскрипционного фактора NFkB. Состояние зрелости активированных Мф проявляется негативной реакцией генов сигнальной трансдукции на TLR-агонисты. Дифференцированные ТНР-РМА Мф имеют воспалительный М1 фенотип и продолжают секретировать воспалительные цитокины IL1-beta и TNF-alpha.

Абортивная инфекция ТНР-РМА макрофагов вирусами гриппа подтипов Н1, Н5 и Н9

В культуральной жидкости ТНР-РМА Мф, заражённых 3-мя исследованными вирусами гриппа H1N1pdm09, H5N2 и H9N2 в дозе 32 ГА/мл инфекционная активность не обнаружена на всех сроках инфекции 24 ч - 96 ч ( 2log2 TCID50 в клетках Сасо-2). РГА с куриными эритроцитами также дала отрицательный результат ( 2 ГА ед/мл) (таблица 15).

В ТНР-РМА Мф, заражённых птичьими вирусами гриппа А H5N2 и H9N2 через 24 ч происходит увеличение внутриклеточных гранул (выраженная зернистость) и развитие ЦПД (рис. 43).

Быстрое проявление ЦПД птичьих вирусов ТНР-РМА Мф достигает максимума к 72 ч (таблица 15). ЦПД вируса Н1N1pdm развивается значительно медленней и через 24 ч инфекции морфология заражённых Мф почти не отличается от контроля. К 96 ч инфекции человеческим пандемическим вирусом H1N1 доля погибших клеток составляет 50%.

Несмотря на вызываемое ЦПД вирусов гриппа А птиц H5N2 и H9N2, в ТНР-РМА Мф отсутствует выход инфекционных вирионов из клеток. Полученный результат согласуется с сообщениями о блокировании этапов освобождения инфекционных вирионов из моноцитарных и альвеолярных макрофагов [Short et al., 2012; van Riel et al., 2011; Marvin et al., 2016].

Для получения многоцикловой гриппозной инфекции в среду культивирования добавляли ТРСК-трипсин в дозе 1,2 мкг/мл.

Внутри инфицированных вирусами H1N1pdm09, H5N2, H9N2 ТНР-РМА Мф обнаружены высокие уровни вирусных М1-РНК (рис. 44 А). Существенных изменений в содержании M1-РНК вирусов в динамике инфекции не происходит.

Результаты электрофореза в агарозном геле подтверждают специфичность полученных ПЦР-продуктов М1-генов вирусов (рис. 44 Б).

Размер специфического ПЦР-продукта 245 п.н., М – маркеры Мв.

Внутриклеточное содержание М1-РНК птичьих вирусов H9N2 и H5N2 (Cq16-19) значительно выше, чем человеческого H1N1pdm (Cq 26-29). Об этом также свидетельствуют относительные внутриклеточные уровни вирусных РНК в динамике инфекции, которые рассчитаны относительно РНК вируса H1N1pdm на сроке 24 ч (таблица 16).

Судя по уровням внутриклеточных РНК, быстрее других в ТНР-РМА Мф проникают птичьи вирусы H9N2 и H5N2 с рецепторной специфичностью остатков сиаловых кислот 2,3-gal. Менее эффективно в ТНР-РМА Мф проникает человеческий вирус H1N1pdm09 c остатками сиаловых кислот 2,6-gal в НА. Различия, вероятно, связаны с количеством и свойствами сиаловых кислот в НА человеческих и птичьих вирусов [Londrigan et al., 2012; Short et al., 2012; van Riel et al., 2011].

Результаты с вирусными РНК в ТНР-РМА Мф подтверждают данные, полученные с РНК вируса A/PR8H1N1/H5N1 на лимфоцитах крови и H1N1pdm09 на моноцитарных GM-Мф представленные выше, и демонстрируют общее явление - депонирование РНК вирусов гриппа А в иммунокомпетентных клетках.

Таким образом, вирусы гриппа А с разной видовой и рецепторной специфичностью проникают в ТНР-РМА Мф с разной эффективностью. В большей степени это свойственно птичьим вирусам H5N2 и H9N2, и в меньшей - пандемическому вирусу H1N1pdm09.

Результаты исследования методом иммунофлюоресценции белка NP в ТНР-РМА Мф через 24 ч после заражения вирусами подтипов Н1, Н5 и Н9 приведены на рис. 45.

Использовали моноклональные антитела МКА7F5 к консервативному участку белка NP вирусов гриппа А [Климова и др., 2011]. В контрольных ТНР-РМА Мф белок NР не выявлялся. В Мф, заражённых пандемическим вирусом H1N1, выявлены единичные клетки с NP белком (зелёный) среди множества клеток, не содержащих белок и идентифицированных по окраске ядер Hoechst 33258 (голубой).

Иная картина наблюдалась в Мф, заражённых вирусом H5N2. На фоне выраженной клеточной деструкции, вызванной вирусом H5N2, в большинстве неразрушенных клеток была обнаружена метка, свидетельствующая о локализации вирусного белка NP в цитоплазме и в ядрах. Обработка Мф альфа2-ИФН в дозе 5х10 4 МЕ/мл за 1 ч до заражения вирусом H5N2 снижала число клеток с NP белком до единичных. При этом в обработанных ИФН зараженных клетках наблюдался антивирусный эффект, который проявлялся заметным снижением количества клеток с вирусным NP-белком в цитоплазме и в ядрах. Антивирусный эффект ИФН проявлялся также в значительным увеличением количества жизнеспособных клеток с нормальной морфологией.

В ТНР-РМА Мф, заражённых вирусом H9N2, белок NP выявлялся несколько слабее (по интенсивности флюоресценции), чем в заражённых вирусом H5N2. Ранее было показано, что МКА 7F5 активно взаимодействуют в ИФА с широким набором вирусов гриппа А человека и животных различных подтипов [Масалова и др., 2014], но с вирусом подтипа Н9 не были изучены. Возможно, полученные результаты могут объясняться меньшей аффинностью взаимодействия МКА 7F5 с NP вируса гриппа А подтипа Н9 по сравнению с другими изученными подтипами вируса А. Не исключено также, что эпитоп, с которым взаимодействует МКА 7F5, по-разному экспонирован на белке NP вируса H9N2 и 2-х других исследованных вирусов гриппа.

Поскольку в динамике инфекции внутри ТНР-РМА Мф содержатся вирусные РНК и NР-белки, но в культуральной жидкости не обнаружена ГА-активность и инфекционные вирионы, мы делаем заключение о том, что вирусы гриппа птиц подтипов H5 и Н9 вызывают абортивную инфекцию. По нашим данным ТНР-РМА Мф резистентны к пандемическому вирусу гриппа А H1N1. Сделанные выводы на ТНР-РМА Мф согласуются данными литературы о блоке поздних стадий репродукции, полученными на альвеолярных и моноцитарных Мф с вирусами гриппа А подтипов Н1, Н5 и Н7 [Marvin et al., 2017; Short et al., 2012].