Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Современные представления об иммунопатогенезе невынашивания беременности(обзор литературы). 13
1.1. Актуальность проблемы невынашивания беременности 13
1.2. Роль иммунологических факторов при физиологической и осложненной беременности. 17
1.3. Роль инфекционных агентов в формировании невынашивания беременности 22
1.4. Роль гормональных нарушений в формировании невынашивания беременности 26
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 37
2.1. Общая характеристика материала 37
2.2. Методы исследования
2.2.1. Клиническое обследование пациенток 39
2.2.2. Инструментальные методы исследования 39
2.2.3. Иммунологические методы исследования 39
2.2.4. Микробиологическое исследование 42
2.2.5. Методы статистического анализа 43
Глава III. Результаты собственных исследований 44
3.1. Клиническая характеристика обследованных пациенток 44
3.2. Микробиологическая характеристика родовых путей беременных клинических групп 56
3.3. Гормональный статус пациенток клинических групп 59
3.4. Иммунологическая характеристика беременных клинических групп
3.4.1. Иммунологическая характеристика беременных с угрозой прерывания в I триместре 66
3.4.2. Иммунологическая характеристика беременных I группы с различным исходом беременности в I триместре 79
3.4.3. Иммунологическая характеристика беременных II группы с различным исходом беременности в I триместре 87
3.5. Корреляционные взаимосвязи между изучаемыми показателями в исследуемых группах 92
3.6. Распределение частот генотипов и аллелей гена ТNF- и IL -10 у
беременных клинических групп 96
3.7. Характеристика исходов беременности 103
Глава IV. Обсуждение полученных результатов 106
Выводы: 124
Практические рекомендации: 126
Список используемых сокращений 127
Список использованной литературы 128
- Роль инфекционных агентов в формировании невынашивания беременности
- Роль гормональных нарушений в формировании невынашивания беременности
- Инструментальные методы исследования
- Иммунологическая характеристика беременных I группы с различным исходом беременности в I триместре
Роль инфекционных агентов в формировании невынашивания беременности
Невынашивание беременности (НБ) является актуальной проблемой современного акушерства и перинатологии, что определяется ее социальной и медицинской значимостью (Назаренко Ю.Г., 2006; Тетруашвили Н.К., 2008; Кошелева Н.Г., с соавт., 2009; Сидельникова В.М., Сухих Г.Т., 2010; Ушакова, Г.А. 2010; Серов В.Н. с соавт., 2011; Сидельникова В.М., 2011). Частота НБ составляет 10-25% всех беременностей, до 85% которых приходится на долю первого триместра. Поздние потери от 12 до 22 недель беременности происходят реже и составляют около 4% исходов беременности (Кулаков В.И., Макаров И.О., Сидорова И.С., 2006; Потапова С.В., 2008; Радзинский В.Е. 2009; Серов В.Н. с соавт., 2011; Carp H.J. A., 2007). Среди недоношенных детей наблюдается свыше 50 % случаев мертворождений, 70-80% - ранней неонатальной смертности, 60-70% -детской смертности. Недоношенные дети умирают в 30-35 раз чаще, чем доношенные, а перинатальная смертность при НБ отмечается в 30-40 раз выше, чем при срочных родах (Амельхина И.В., 2007).
Причины невынашивания беременности могут иметь различную этиологию: хромосомные аномалии, тромбофилические расстройства, дисфункция иммунной системы, различные эндокринные нарушения, инфекции (Потапова С.В., 2008; Радзинский В.Е. с соавт., 2009; Агаркова И.А., 2013; Christiansen O.B. et al, 2008).
Новые знания о механизмах выкидыша необходимы для эффективных мероприятий, которые могут предотвратить данное осложнение беременности. В 2005 году Европейское общество репродукции человека и эмбриологии (ESHRE) представило пересмотренную терминологию относительно ранних событий беременности (Farquharson R.G. et al, 2005). Клинические выкидыши могут быть подразделены на ранние (до 12 недели беременности) и поздние (от 12 до 22 недель гестации (Сидельникова В.М., 2007; Э.К. Айламазян с соавт., 2013; Jauniaux К, et al, 2006). Предложена классификация по периодам развития беременности (Silver R.M., et al, 2011). Проспективные когортные исследования показали, что только около одной трети беременностей прогрессирует до живорождения (Larsen Е.С. et al, 2013).
Общепринятым является предположение, что спорадические потери беременности в сроке до 5-6 недель представляют собой физиологическое явление, которое предотвращает от серьезных структурных пороков развития или хромосомных аберраций несовместимых с жизнью. Эта концепция поддерживается клиническими исследованиями, в которых выявлено, что в 85% случаев раннего выкидыша наблюдались пороки развития плода (Садекова О.Н., 2012; Vanneste Е. et al, 2009; Branch D.W. et al, 2010).
Тромбофилические факторы, предрасполагающие к тромбоэмболии, связанные с риском невынашивания беременности, могут быть наследственным или приобретенными (Robertson L. et al, 2006). Предполагается, что их ассоциация с невынашиванием беременности связана с риском тромбообразования в плацентарных сосудах (Макацария А.Д. с соавт., 2007, 2008; Мондоева С.С., 2010; Акиньшина СВ., 2011). Наследственные факторы включают дефицит антитромбина, протеина С и S, фактора V Лейдена или генные мутации фактора П. Приобретенные факторы включают наличие анти-фосфолипидных антител, волчаночного антикоагулянта или анти-кардиолипиновых антител. Существует ряд доказательств, что лечение с применением низких доз гепарина во время беременности повышает вероятность рождения живого ребенка у пациенток привычным невынашиванием беременности и антифосфолипидным синдромом (Сидельникова В.М., 2008).
Недавно были получены данные, предполающие, что эпигенетические нарушения могут быть причиной раннего прерывания беременности. Известно, что ХГЧ является гликопротеином состоит из двух субъединиц, и и продуцируется синциотрофобластом в первом триместре беременности, связывается с лютеинизирующим гормоном через ХГЧ рецепторы желтого тела, предотвращая его от регрессии. Выкидыш ассоциируется с низким или неоптимальным приростом уровня ХГЧ. Связь между низким уровнем ХГЧ и выкидышем можно трактовать двояко: рост трофобласта может быть замедлен в связи с генетическими, иммунными или тромбофилическими нарушениями, а также низкий уровень ХГЧ может являться вторичным явлением, когда фетоплацентарный блок продуцирует малое количество ХГЧ в результате первичной недостаточности трофобласта, что приводит к снижению продукции прогестерона и в результате к гибели эмбриона. У женщин с невынашиванием беременности частота полиморфизма промоторной области гена CGB5, который может повышать ХГЧ- транскрипцию, была ниже, чем у здоровых женщин (Rull K.C. O. et al, 2013). При невынашивании беременности были выявлены более низкие уровни ДНК метилтрансферазы 1, фермента, участвующего в поддержании метилирования (Yin L.J. et al, 2012).
Распространенность гипотиреоза, лежащая в основе аутоиммунных заболеваний щитовидной железы, является весьма значительной среди женщин детородного возраста. Существует доказательство того, что дисфункция щитовидной железы и аутоиммунные заболевания щитовидной железы связаны с бесплодием и невынашиванием беременности, как при наличии антител к ткани щитовидной железы, так и без их обнаружения при повышенном уровне тиреотропного гормона (Мусаева Т.Т., 2009; Twig G. et al, 2012). Согласно недавнему исследованию, наличие антител против тиреопероксидазы (TPO-Ab) повышает риск спорадического выкидыша (vanden Boogaard E., et al,2011). По данным Negro R. et al (2010), уровень ТТГ выше, чем 2,5 мМЕ/л в первом триместре, повышает риск выкидыша в два раза. Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) является распространенным эндокринным расстройством у женщин репродуктивного возраста. СПКЯ может быть связан с овуляторными расстройствами и выкидышем. Распространенность СПКЯ среди женщин с невынашиванием беременности оценивается от 8,3% до 10% (Cocksedge K.A., et al, 2009). Последние исследования показали, что децидуальные стромальные клетки выступают в качестве биосенсора для эмбриональных сигналов (Teklenburg G. et al, 2010). Гипотеза, о том, что селективность эндометрия по качеству эмбрионов может быть нарушена у женщин с невынашиванием беременности нашла поддержку у ряда исследователей. По их мнению, эндометрий женщин с невынашиванием беременности, экспрессирует более низкий уровень муцина 1, молекулы адгезии, необходимой для барьерной функции эпителия, что может привести к снижению селективной функции децидуальной оболочки (Salker M. et al, 2010; Teklenburg G. et al, 2010).
Роль гормональных нарушений в формировании невынашивания беременности
Метод полимеразной цепной реакции. выявление Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealiticum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Neisseria gonorrhoeae, T. vaginalis, а также вирусов герпеса (HSV- 1/2), вируса цитомегалии (CMV), вируса Эпштейна -Барр (EBV), вируса папилломы (HPV). В качестве материала для исследования у пациенток служили соскобы из цервикального канала. Обнаружение вышеперечисленных возбудителей методом ПЦР проводилось с использованием наборов реагентов производства «АмплиСенс» (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ, г. Москва) и оборудования, включающего многоканальный амплификатор ДНК «Терцик» (производство ДНК-Технология г. Москва) с компьютером и программным обеспечением; программируемый твердотельный термостат «Termo 24-15» фирмы Biokom (г. Москва) для лизиса ДНК; центрифугу типа «Eppendorf» (скорость центрифугирования 12 тыс. обмин); комплект оборудования для электрофореза ДНК в полиакриламидном геле, а также видеосканирующую систему для детекции ампликонов ДНК с цифровой видеокамерой, компьютером и программным обеспечением “Sigma-gel” (Швеция).
Определение полиморфизмов генов.
Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови проводили в набором DIAtom DNA Prep 100 по рекомендации фирмы производителя («Центр Молекулярной генетики» Россия). Определение аллельных вариантов генов проводили методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом тест-системами для молекулярно-генетического анализа разработанными ГосНИИгенетика (Москва). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили при помощи программируемых термоциклеров «ДНК-Технология» (Москва) и «PTC-220» (MJ Research, США) по программе, рекомендованной производителем набора. Электрофорез и визуализация результатов. Продукты амплификации и рестрикции разделяли в 6-7% неденатурирующем полиакриламидном (ПААГ) геле, приготовленном на трис-боратном буфере, в аппарате для вертикального электрофореза, окрашивали водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл), просматривали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе «UltraLum» (США) с использованием видео-гель-документации («FlyVideo»).
Иммуноферментный анализ - Определение содержания цитокинов в сыворотке крови и цервикальной слизи. Реакцию проводили согласно рекомендациям производителя. - Определение IL-15 (BCM-Diagnostic, США); - Определение TNF-, TGF-, IL-10 (BenderMedsistems, Австрия); - Определение уровня макрофагального белка воспаления (МІР-1), (BCM-Diagnostic); - Определение уровня гранзима-В, (BCM-Diagnostic, США); - Определение антигена Chlamydia trachomatis (Вектор-бест, Россия). В качестве материала для исследования у беременных служили соскобы эпителия влагалища и цервикального канала. - Определение в сыворотке крови специфических антител к Chlamydia trachomatis класса А, G с использованием диагностических наборов фирмы МБС, (Россия), - Определение IgG к МОМР+ pgp3 Chlamydia trachomatis, Ig М, IgG к HSV- 1/2 и CMV, IgG к Т. vaginalis с использованием диагностических наборов фирмы Вектор-бест, (Россия), - Определение IgM к капсидному антигену (VCA) и IgG к ядерному антигену (EBNA) EBVc использованием наборов фирмы BCMDIAGNOSTIC (США). Учет реакции проводили на многофункциональном программируемом счетчике для иммунологических исследований с компьютером и программным обеспечением 1420 MultilabelCounterVictor (Финляндия). Диагностика урогенитальной инфекции основывалась на комплексной оценке клинической картины заболевания и результатах лабораторных исследований. Диагноз активной стадии хламидийной инфекции ставился при выявлении IgG к МОМР + плазмидному белку pgp3, IgG, IgА, к Chlamydia trachomatis, определении ДНК Chlamydia trachomatis. Диагноз трихомониаза ставился на основании определения антител класса G к T. vaginalis, результатов бактериологического исследования. Диагноз персистирующей герпетической инфекции ставился на основании частых реактиваций, определения специфических антител к HSV (1,2) и их динамики, определении ДНК HSV.
Определение концентрации уровня гормонов в сыворотке крови -стероидных гормонов: эстриола, прогестерона, хорионического гонадотропина, а также 17-ГОП, ДГЭА-С, тестостерона и тиреоидных гормонов (Т3, Т4, ТТГ) иммунофлюоресцентным методом с использованием тест-систем Delfia (Финляндия).
Инструментальные методы исследования
Прогестерон снижает возбудимость миометрия, подавляет его сократительную активность и тем самым противодействует угрозе преждевременного прерывания беременности (Szekeres-Bartho J,2009), кроме того, имеет решающее значение для поддержания беременности, контролируя развитие эндометрия, а также приводя к привлечению и дифференцировке децидуальных NK клеток, которые в свою очередь, действуют на ангиогенез и инвазию трофобласта.
Недостаток прогестерона может приводить к активации цитокинов, запускающих механизм самопроизвольного выкидыша (Демидова Е.М. и соавт., 2005). Стероидные гормоны участвуют в модуляции секреции цитокинов, влияют на баланс Th1/Th2, сдвигая его в сторону преобладания Th2 интерфейса (Chien E.J. et al, 2006; Schumacher A. et al, 2009; Pazos M.A. et al, 2012; Robinson D.P., Klein S.L., 2012; Hughes G.C. et al, 2013; Pantaleo M. et al, 2013; ChenJ-J. et al, 2013).
Известно, что на поверхности NK-клеток находятся киллер активирующие и киллер-ингибирующие рецепторы. В результате взаимодействия прогестерона с рецепторами CD8+ лимфоциты продуцируют прогестерониндуцированный блокирующий фактор (PIBF), который, воздействуя на NK–клетки, направляет иммунный ответ матери на эмбрион в сторону менее активных NK – больших гранулярных лимфоцитов, несущих маркеры CD56+ CD16-. При наличии этих клеток иммунный ответ матери осуществляется через Th -2 типа, которые продуцируют регуляторные интерлейкины IL-4, IL-10. Под действием прогестерона подавляется продукция цитокинов, вызывающих воспалительные и тромбофилические реакции (TNF-, IL-1). Кроме того, прогестерон и его производные стимулируют в эндометрии продукцию протеинов, которые вызывают апоптоз естественных киллеров (Сидельникова В.М., 2005; R. Raghupathy et al, 2009). При низком содержании прогестерона вырабатывается мало прогестерониндуцированного блокирующего фактора и происходит активация натуральных киллеров. Стероидные гормоны и их медиаторы могут индуцировать эффекторные Т-лимфоциты и увеличивать экспрессию фактора ингибирования лейкоза (LIF), что модулирует иммунный ответ в начале беременности (Arck P. et al, 2007; Hirano S., Furutama D., HanafusaT., 2007; Sundar RajS, et al, 2008; Alok A., Karande A.A.,2009). Эти результаты указывают на значимость стероидных гормонов в иммуномодуляции материнской толерантности к плоду. Таким образом, недостаточная выработка одного из гормонов приводит к осложнённому течению беременности. В частности, недостаток эстрогенов, приводит к нарушению развития хориона и снижению им выработки ХГЧ, что может приводить к нарушению процессов имплантации трофобласта, или же недостаточному образованию рецепторов к прогестерону. Это, в свою очередь, обуславливает прогрессирование дефекта хориальной ткани.
Иммунологическая характеристика беременных с угрозой прерывания в I триместре Не подлежит сомнению участие иммунной системы беременной в ходе гестационного процесса. С развитием беременности иммунная система женщины претерпевает значительные изменения, в основе которых лежит формирование гестационной иммуносупрессии. Состояние иммунной системы является одним из важных составляющих полноценности функциональных гомеостатических механизмов беременной, обеспечивающих динамическое равновесие в системе мать-плацента-плод (Газиева И.А. Чистякова Г.Н. c соавт., 2013; Панкратов О.В., 2006).
Беременность характеризуется появлением антигенов плода, определяющих новое состояние иммунного гомеостаза, формирующих тип иммунного ответа, особенности популяционного состава иммунокомпетентных клеток и их функциональную активность. Исследование иммунного статуса беременных, несомненно, имеет большое значение, как для теоретической, так и для практической медицины.
Результаты иммунологического обследования беременных позволяют понять возможные причины осложнений гестационного процесса при инфекционнойурогенитальной патологии и гормональных нарушениях (Larsenetal E.C., 2013). Проведенный нами анализ показал, что развитие угрозы прерывания беременности сопровождалось значительными изменениями показателей иммунитета. Выявленные особенности иммунного статуса у беременных с осложненным течением гестации представлены в таблице 19. В I группе по сравнению с контрольной и II группой выявлено повышение CD 8+лимфоцитов и снижение уровня CD4+(р 0,05). Для пациенток с гормональными причинами угрозы прерывания беременности содержание CD 4+ лимфоцитов превышало показатели контрольной группы в 1,3 раза (р 0,05), (Таблица 19. Рисунок 5). Иммунорегуляторный индекс в I группе был ниже, чем в контрольной и во II группе ( в 1,4 и 1,7 раз, соответственно, (р 0,05).
Известно, что на ранних этапах нормальной беременности NK клетки регулируют ангиогенез в эндометрии, участвуют в имплантации (Quenby S. et al, 2009), однако активированные NK - клетки способны лизировать трофобласт, кроме того, они опосредуют свои цитотоксические эффекты через секрецию TNF –, что приводит к сокращению гладкой мускулатуры сосудов с последующим развитием ишемического некроза (Воробьев А.А. c соавт., 2006; King K. et al, 2010; Quenby S. et al, 2009; Tang A.W. et al, 2011). Анализируя показатели содержания натуральных киллеров (CD16+) в I и II группе отмечено достоверное увеличение их относительного количества, по сравнению с контрольной группой ( в 2,6 и 2,1 раз, соответственно, (р 0,05).
Иммунологическая характеристика беременных I группы с различным исходом беременности в I триместре
Согласно современным представлениям этапы имплантации и развития беременности являются цитокин-зависимыми процессами, а уровень экспрессии генов цитокинов зависит от аллельных вариантов генов в генотипе, в этой связи актуальным является исследование взаимосвязи частоты полиморфизма генов регуляторных цитокинов и риском невынашивания беременности (Алегина Е.В., с соавт., 2014). Цитокины представляют иммуномодулирующие белки и особенно важны как для врожденного так и адаптивного иммунного ответа. В зависимости от их воспалительных реакций, цитокины в целом можно разделить на провоспалительные и противовоспалительные, производимые Th1 и Th2 клетками, соответственно. Th2 иммунные реакции поддерживают нормальную беременность, а Th1 иммунный ответ считается вредным для плода. Уровни иммунологической реактивности закреплены генетически, а полиморфизм генов, кодирующих экспрессию TNF – может приводить к усилению продукции провоспалительных цитокинов, дифференцировки в направлении Th1, неблагоприятного для течения беременности. TNF- является одним из ключевых провоспалительных цитокинов с множеством функций в воспалительный сети, его синтез регулируется, как на транскрипционных так и посттранскрипционных уровнях. TNF- может стимулировать IL-1 и IL-6 продукцию, а последний повышает чувствительность реакции тканей к TNF-. TNF- регулируется многими медиаторами, в частности ЛПС. Врожденная иммунная активация синтеза TNF- в свою очередь может привести к невынашиванию беременности.
TNF- является важной регулирующей молекулой во время беременности, которая опосредует воспалительный ответ и также участвует в процессе маточных сокращений. Нарушение регуляции экспрессии TNF- связано с патологическими причинами различных опосредуемых иммунной системой воспалительных процессов.
Ген фактора некроза опухоли (TNF-) расположен на 6-й хромосоме, в позиции 6р21.1-21.3 внутри кластера генов III класса главного комплекса гистосовместимости между генами HLA-B и HLA-DR. Известны более 30 полиморфных вариантов гена (SNP-полиморфизмы, микросателлиты), но только часть из них влияет на уровень экспрессии TNF- in vitro. Наибольший интерес исследователей вызывает SNP-полиморфизм промоторной области гена в позициях -238, -308 с заменой гуанина на аденин и -863 с заменой цитозина на аденин. Полиморфизм 308G/A, вызывает изменение промоторной активности, что приводит к увеличению синтеза TNF-a цитокина в сыворотке крови. IL -10 подавляет секрецию провоспалительных цитокинов в мононуклеарных макрофагах, что ведет к уменьшению продукции TNF-a, IL-1, IL-6 и других факторов. Одновременно, IL -10 может повысить высвобождение провоспалительных цитокинов, таких как IL-1R и антагонистов растворимого TNF-a-рецептора. IL -10, как полагают, ингибирует синтез IL-1, тем самым регулируя иммунный ответ (Kaur A., 2011 ; Xin Liu1, 2015; Vidyaari M., 2015).
Ген IL-10 локализован на 1-ой хромосоме 1q31-1q32 и состоит из 5 экзонов и 4 интронов. Сообщается, что несколько принципиальных полиморфных сайтов в гене IL-10, в том числе три в области промотора (-1082G/A, -819C/T, -592C/A), могут оказывать влияние на транскрипцию тРНК и экспрессию IL-10 in vitro (Kingo K. et al, 2005). Полиморфизм G1082A гена интерлейкина-10 включает в себя три генотипа AA, GA и GG, из которых генотип AA ассоциирован с низким синтезом IL-10, в то время как генотипы GA и GG связаны с умеренной и высокой продукцией, соответственно (Matsumoto K. et al., 2010).
Задачей настоящего исследования являлся сравнительный анализ распределения частот генотипов 592C/A промотора и 1082G/A гена IL-10 и 308G/A и 238G/A гена TNF-a и их сочетаний (Таблица 35, 36). В ходе проведенных исследований не было установлено статистически значимых различий в распределении полиморфизмов 238G/A гена TNF-a между пациентками I, II и контрольной группы. Проведенные исследования частоты генотипов и аллелей TNF – у беременных с угрозой прерывания не выявили статистически значимых различий в распределении частоты полиморфизмов 308G/А гена TNF- между пациентками I, II и контрольной группы. Однако установлено, что в подгруппе I а по сравнению с контрольной группой и подгруппой I б частота генотипа G/A гена TNF- встречалась в 3,5 и 2,9 раз чаще, (р 0,01), а генотипа G/G гена TNF- достоверно реже в 3,2 и 2,9 раз, соответственно, р 0,01), (Таблица 35, Рисунок 20), что согласуется данными (Питиримова Л.Н., с соавт., 2014).