Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 15
1.1 Становление концепции хронической болезни почек 15
1.2 Регуляция метаболизма неорганического фосфата в норме и при хронической болезни почек (ХБП) 21
1.2.1 Белок Klotho 21
1.2.2 Фактор роста фибробластов 23 (FGF23) 25
1.2.3 Развитие представлений о регуляции метаболизма Pi в условиях ХБП 28
1.3 Диагностика минеральных и костных нарушений при хронической болезни почек (ХБП-МКН) 31
Глава 2 Материалы и методы 34
2.1 Экспериментальные модели 34
2.1.1 Объект исследования 34
2.1.2 Реализация моделей экспериментальной дисфункции почек 35
2.1.3 Группы животных 37
2.1.4 Подготовка и хранение образцов биоматериала 37
2.2 Клиническое исследование 38
2.2.1 Группы исследования 38
2.2.2 Материал 39
2.3 Методы исследования 40
2.3.1 Биохимические методы исследования 40
2.3.2 Иммуноферментный анализ 42
2.3.3 Гистологические исследования 44
2.4 Математическая обработка результатов 48
Глава 3 Результаты 49
3.1 Морфологические и биохимические параметры метаболизма неорганического фосфата при экспериментальном моделировании начальных стадий хронической болезни почек 49
3.1.1 Оценка функции почек у крыс с экспериментальной хронической болезнью почек 49
3.1.2 Кальций-фосфатный метаболизм при моделировании ХБП 51
3.1.3 Концентрации фосфотонических факторов – PTH и FGF23, на начальных стадиях экспериментальной ХБП 53
3.1.4 Гистологическое исследование почечной паренхимы, содержание Klotho и FGFR1 в почке при моделировании ХБП 54
3.1.5 Система Klotho/FGF23 и гипертрофия миокарда в моделях ХБП 62
3.2 Морфологические и биохимические характеристики формирования системного дисбаланса неорганического фосфата у пациентов с начальными стадиями хронической болезни почек 65
3.2.1 Метаболизм неорганического фосфата у пациентов с начальными стадиями ХБП 65
3.2.2 Klotho, FGF23 и PTH у пациентов с начальными стадиями ХБП 67
3.2.3 Информативность определения концентрации Klotho в сыворотке крови при выявлении склеротических изменений нефробиоптата 74
3.2.4 Система Klotho/FGF23 и ГЛЖ у пациентов с ХБП 77
Глава 4 Обсуждение результатов 81
Заключение 94
Выводы 95
Практические рекомендации 96
Перспективы дальнейшей разработки темы 97
Литература .98
- Становление концепции хронической болезни почек
- Гистологическое исследование почечной паренхимы, содержание Klotho и FGFR1 в почке при моделировании ХБП
- Klotho, FGF23 и PTH у пациентов с начальными стадиями ХБП
- Обсуждение результатов
Введение к работе
Актуальность исследования.
Фосфор играет важную роль в биологии клетки, так как вовлечен в большинство процессов, начиная с синтеза нуклеиновых кислот, сигнальной трансдукции и метаболизма липидов, заканчивая минерализацией внеклеточного матрикса [Berndt T., Kumar R., 2009]. В циркуляции фосфор представлен в форме неорганического фосфата (Pi). Высокие концентрации Pi, как и его дефицит, губительны для организма. Накопление Pi токсично для клеток и отчетливо связано с увеличением рисков смерти как у пациентов с хронической болезнью почек (ХБП), так и в общей популяции [McGovern A.P. et al., 2013; Fang Y. et al., 2014].
Гомеостаз Pi в организме поддерживается системными и локальными факторами, регулирующими кишечную абсорбцию, почечную экскрецию/реабсорбцию, ремоделирование костной ткани [Лот К., 2005; Hu M.C. et al., 2013]. При этом, почечная экскреция является основным механизмом поддержания гомеостаза Pi в организме – в физиологических условиях практически весь абсорбировавшийся в кишечнике Pi экскретируется почками [Berndt T. and Kumar R., 2009; Shaikh A., 2008]. ХБП сопряжена с формированием системного дисбаланса Pi, приводящим к минеральным и костным нарушениям (ХБП-МКН), среди которых кальцификация сосудов и аорты является преобладающей причиной смерти пациентов [Ix J.H. et al., 2009; Patange A.R. et al., 2013; Rika J., Tatsuo S., 2014]. В качестве лабораторных критериев ХБП-МКН в настоящее время рекомендуют использовать концентрации Са, Pi, паратиреоидного гормона (PTH), общей щелочной фосфатазы (ЩФ) и кальцидиола в сыворотке крови [KDIGO, 2009]. При этом известно, что концентрации сывороточных Са и Pi, как и ЩФ и PTH, продолжительное время поддерживаются в пределах нормальных значений вплоть до 4-5 стадий ХБП. Концентрация кальцидиола при прогрессировании ХБП достоверно не изменяется, а низкие значения данного показателя могут означать наличие предсуществующего дефицита витамина D, характерного для жителей Санкт-Петербурга и Северо-запада России [Каронова Т.Л. и др., 2016]. В свою очередь, инструментальные методы исследования фиксируют необратимые изменения и не могут быть отнесены к ранней диагностике.
Известно, что изменения метаболизма Pi, приводящие к развитию осложнений на поздних стадиях ХБП, происходят уже при начальном снижении функции почек [Craver L. et al., 2007, Dobronravov V. et al., 2012], исследование данных процессов открывает новые возможности для ранней клинической лабораторной диагностики ХБП-МКН.
Степень разработанности темы исследования.
Полученные за последнее десятилетие данные доказывают, что активным участником формирования системного дисбаланса Pi при ХБП является фактор роста фибробластов 23 (FGF23) [Добронравов В.А., 2011; Hu M.C. et al., 2013]. FGF23, как и PTH, является фосфотонином, действует как регулятор
позитивного баланса Pi, но в отличие от PTH, оказывает ингибирующее воздействие на кальцитриол (1,25(ОН)2D3) [Razzaque M.S., Lanske B., 2007]. Биологическая активность и тканеспецифичность действия FGF23 обусловлены наличием его ко-рецептора – белка Klotho (Klotho) [Urakawa I. et al., 2006]. Помимо рецепторной функции белок Klotho, способен оказывать FGF23-независимое влияние на минеральный метаболизм благодаря альфа-глюкозидазой активности, позволяющей модулировать активность кальциевых (TRPV5) и калиевых (ROMK) ионных каналов и натрий-фосфатных ко-транспортеров (NPT-2a, b, c) [Hu M.C., Kuro-o M., Orson W., 2012]. Кроме того, Klotho способен ингибировать действие ростовых факторов – TGF-1 (transforming growth factor beta 1) и IGF-I (insulin-like growth factor I), препятствуя прогрессированию фиброза [Doi S. Et al., 2011; Zhou L et al., 2015], кальцификации сосудов [Lim K. et al., 2012], ремоделированию миокарда [Song S. et al., 2013; Yang K et al., 2015].
В настоящее время считается, что изменения в регуляторной системе FGF23/FGFR/Klotho являются первичными при формировании системного дисбаланса Pi [Добронравов В.А., 2011; Hu M.C. et al., 2013; Lu X., Hu M.C., 2016]. В ряде работ показано, что повышение концентрации FGF23 предшествует значительному росту концентрации PTH [Isakova T. et al., 2011; Pavik I. et al., 2013; Spichtig D. et al., 2014], а сам FGF23 может являться важным регулятором активности PTH в почке и костной ткани [Dreke T.B., 2010; Andrukhova O. et al., 2016]. Снижение экспрессии мРНК Klotho в почке, уровня Klotho в моче также выявлены на начальных стадиях экспериментальной дисфункции почек [Barker S.L. et al., 2014, Dobronravov V. et al., 2012]. Следует отметить, что представления о доминирующей роли FGF23 в регуляции фосфатного обмена почками преимущественно основаны на данных, полученных в генетических моделях гиперпродукции FGF23 у животных c интактными почками, либо при анализе экспериментальных и клинических моделей соответствующих третьей и более поздним стадиям ХБП [Kuro-o M., 2013; Добронравов В.А., 2016], в то время как экскреция Pi значительно возрастает уже на первой стадии ХБП [Haruna Y. et al., 2007; Yilmaz M.I. et al., 2010]. Кроме того, остается не вполне ясным, есть ли причинно-следственная связь между активацией системы FGF23/FGFR/Klotho и фосфатурией при начальном снижении скорости клубочковой фильтрации (СКФ). Также неизвестно, является ли рост концентрации FGF23 результатом органной резистентности к его действию в условиях характерного для ХБП снижения Klotho [Razzaque M.S., Lanske B., 2007; Hu M.C. et al., 2013].
Комплексное исследование рутинных и новых показателей баланса Pi при начальном снижении функции почек в эксперименте позволило выявить кандидатные маркеры формирования системного дисбаланса Pi, клиническое исследование – оценить их информативность для осуществления ранней предикции патологических состояний, приводящих к смерти пациентов на продвинутых стадиях ХБП.
Цель исследования – Установить роль фосфат-регулирующей системы FGF23/FGFR1/Klotho в поддержании мочевой экскреции неорганического фосфата и оценить клиническую значимость определения циркулирующих и ренальных компонентов исследуемой системы для ранней диагностики дисбаланса неорганического фосфата у пациентов с хронической болезнью почек.
Задачи исследования:
-
Изучить метаболизм неорганического фосфата (концентрация Pi в сыворотке, относительная и абсолютная экскреция Pi почками) на начальных стадиях хронического повреждения почек в экспериментальном и клиническом исследованиях.
-
Исследовать изменения ренальной экспрессии рецептора FGF23 – FGFR1, и ко-рецептора Klotho при моделировании хронического повреждения почек; проверить выявленные закономерности в клиническом исследовании ранних стадий ХБП.
-
Изучить взаимосвязь Klotho с изменениями микроархитектоники почки в экспериментальном и клиническом исследованиях; оценить прогностическую значимость определения Klotho в сыворотке крови, моче и почке в качестве раннего лабораторного критерия гломерулосклероза и фибропластических изменений тубулоинтерстиция у пациентов с ХБП.
-
Изучить взаимосвязь изменения уровней ренальных и циркулирующих компонентов системы FGF23/FGFR1/Klotho и увеличения индекса массы миокарда в экспериментальном исследовании у крыс SHR.
5. Определить направленность изменений уровней PTH и новых
регуляторов метаболизма Pi – Klotho и FGF23 в экспериментальном
исследовании начальных стадий хронического повреждения почек, оценить
возможность их применения для ранней клинической лабораторной
диагностики формирования системного дисбаланса Pi.
Научная новизна исследования. Впервые в экспериментальном и клиническом исследовании детально изучен характер изменений компонентов регуляторной оси FGF23/Klotho при формировании системного дисбаланса Pi в условиях начального снижения функции почек. Данные получены при комплексном анализе как новых – FGF23, Klotho, так и классических биохимических показателей метаболизма Pi.
Впервые в эксперименте и клинике убедительно доказано, что системное снижение содержания Klotho почке и крови предшествует росту FGF23 при ХБП. Помимо этого, доказано, что рост концентрации FGF23 не является результатом редукции ко-рецептора Klotho, а происходит в ответ на формирующуюся ретенцию Pi.
В экспериментальном и клиническом исследованиях доказано участие системы Klotho/FGF23 в регуляции баланса Pi, при этом, Klotho задействован на ранних стадиях, а FGF23 – на более поздних стадиях дисфункции почек и ассоциирован с ретенцией Pi.
В экспериментальном исследовании получены данные, свидетельствующие о FGF23-независимом участии Klotho в формировании одного из проявлений ХБП-МКН – ремоделирования миокарда (гипертрофии миокарда).
Показано, что определение концентрации Klotho в сыворотке крови может быть использовано для оценки деструктивных изменений почечной паренхимы и прогрессирования ХБП.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования способствуют углублению представлений о регуляции минерального метаболизма и пониманию механизмов возникновения системного дисбаланса Pi в условиях начального снижения функции почек при ХБП. В работе получены доказательства целесообразности ранней профилактики нарушений метаболизма Pi у пациентов с ХБП, а также выявлены показатели для применения в клинической лабораторной диагностике осложнений и прогрессирования ХБП.
По результатам исследования выявлены показатели, ассоциированные с формированием системного дисбаланса Pi, их измерение позволит выявлять пациентов, входящих в группу риска формирования ХБП-МКН уже на 2-3 стадиях ХБП, до проявления необратимых признаков патологического процесса, и проводить раннюю клиническую лабораторную диагностику и своевременную терапию.
Показано, что уровень Klotho в сыворотке пациентов ассоциирован с выраженностью склеротических изменений почечной паренхимы – склерозом клубочков и фиброзом тубулоинтерстиция. Определение данного показателя может дополнить рутинное морфологическое исследование и позволит оценить прогрессирование хронического процесса.
Методология и методы исследования. В соответствии с принципом трансляционной медицины на первом этапе работы регуляция метаболизма Pi была детально изучена в экспериментальных моделях начальной дисфункции почек, а затем выявленные закономерности были верифицированы в группе пациентов с начальными стадиями ХБП. В работе использованы общенаучные (анализ данных, синтез) и частные научные методы (лабораторные, статистические). Для моделирования хронического повреждения почек выполняли резекцию 3/4 и 5/6 почек у крыс Вистар и крыс линии SHR, сроки эксперимента составили 1 или 2 месяца. В качестве контроля использовали животных с ложной операцией. Анализировали содержание белка Klotho и рецептора FGF23 (FGFR1) в тубулярном эпителии (иммуногистохимия, морфометрия), концентрации интактного FGF23, интактного PTH в сыворотке крови, Klotho в сыворотке крови и моче (иммуноферментный анализ), Pi креатинина, в сыворотке крови и моче, мочевины в сыворотке, концентрацию белка в моче (автоматизированные биохимические методы). Иммуногистохимическое исследование выполняли с использованием первичных антител Abcam (Великобритания), Spring Bioscience (США), вторичных антител Dako (Дания) и полимерной системы визуализации Dako
(США). Морфологическую оценку препаратов осуществляли на световом микроскопе Nikon Eclipse E200 со встроенной фотокамерой с помощью программного обеспечения анализа изображений «Видео ТесТ-Морфология 5.2» с окуляром х10, при объективах х20, х40. Анализ гистологических препаратов выполняли в 10 полях зрения для каждого образца. Основные положения, выносимые на защиту:
1. Рост почечной экскреции неорганического фосфата,
свидетельствующий о формирующемся дисбалансе его метаболизма,
происходит уже на ранних стадиях хронического повреждения почек.
2. Развитие ранних стадий хронического повреждения почек в
эксперименте и клинике сопровождается снижением уровня ренального
(тубулярного) и циркулирующего Klotho, прогрессирующим параллельно
увеличению фибропластических изменений почек и существенно
опережающим повышение концентрации FGF23 в сыворотке. У пациентов на
ранних стадиях ХБП определение концентрации Klotho в сыворотке крови
может быть использовано для клинической лабораторной диагностики
деструктивных изменений почечной паренхимы и оценки прогрессирования
ХБП.
3. Увеличение экскреции неорганического фосфата как реакция почек на
ретенцию этого аниона в условиях начального снижения клубочковой
фильтрации происходит независимо от изменений уровней сывороточного и
ренального Klotho, FGFR1 в почке и FGF23 в циркуляции. Рост концентрации
FGF23 в сыворотке на более поздних стадиях ХБП прямо ассоциирован с
концентрацией Pi в крови и является предиктором гиперфосфатемии.
Степень достоверности и апробация результатов исследования. Достоверность и обоснованность результатов работы обеспечена комплексным анализом биохимических и морфологических параметров метаболизма неорганического фосфата у 72 животных с экспериментальной дисфункцией почек и 80 пациентов с начальными стадиями хронической болезни почек с использованием современных методов гистологических, иммунологических и биохимических исследований и подтверждена методами статистической обработки полученных данных, адекватными поставленным задачам. Результаты научных положений документированы таблицами, рисунками, графиками, фотографиями.
На основании результатов проведенных исследований определены показатели для ранней лабораторной диагностики системного дисбаланса Pi при ХБП и оценки прогрессирования фибропластических и склеротических изменений почки.
Результаты работы представлены, доложены и обсуждены на LXXIV научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины» (Санкт-Петербург, Россия, 2013 г.), VII семинаре последипломного образования «Актуальные вопросы нефрологии и диализа: проблемы диетотерапии» (Санкт-Петербург, Россия, 2014 г.), научно-практической конференции «Инновационные технологии и клиническая
значимость лабораторных тестов» (Саратов, Россия, 2015 г.), научно-образовательном форуме «Лабораторная медицина России: современные технологии, внедрение новых тестов, организационные проблемы» (Симферополь, Россия, 2015), научно-практической конференции «Лабораторная диагностика в решении проблем современной клинической медицины» (Санкт-Петербург, Россия, 2015 г.), Конгрессе Европейской Ассоциации Нефрологов «ERA-EDTA 52nd Congress» (Лондон, Великобритания, 2015), Конгрессе Европейской Ассоциации Нефрологов «ERA-EDTA 53 Congress» (Вена, Австрия, 2016), Конгрессе Европейской Ассоциации Нефрологов «ERA-EDTA 54 Congress» (Мадрид, Испания, 2017).
Основные результаты исследования внедрены в практику учебной работы кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, в практику лечебной работы клиник ФГБОУ ВО «ПСПбГМУ им. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения России. Организация и проведение диссертационного исследования одобрены независимым этическим комитетом ФГБОУ ВО «ПСПбГМУ им. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения России.
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 5 в научно-практических журналах, рекомендуемых Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание учёной степени кандидата и доктора наук.
Личное участие автора в получении результатов. Автором лично проведены анализ литературных данных и планирование диссертационной работы, организация исследования образцов экспериментального и клинического биоматериала, выполнены биохимические и гистологические исследования, иммуноферментный анализ в Научно-исследовательском институте нефрологии ПСПбГМУ им. И.П.Павлова, фоторегистрация и морфометрия микропрепаратов на кафедре патологической анатомии ПСПбГМУ им. И.П. Павлова, осуществлены статистическая обработка, анализ полученных данных, обобщение результатов исследований, подготовка материалов к публикациям, написание и оформление диссертации.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 177 источников: 13 отечественных и 164 зарубежных. Работа содержит 16 таблиц и 19 рисунков.
Становление концепции хронической болезни почек
В последние десятилетия мировое сообщество столкнулось с глобальной проблемой, имеющей огромное медицинское и социально-экономическое значение – пандемией хронических неинфекционных заболеваний [9, 110]. Заболевания почек занимают важное место среди хронических болезней в связи с их распространенностью в популяции и прогрессивным ростом количества больных. Согласно данным World Health Report и проекта Global Burden Disease на начало XXI века патология почек и мочеполовых путей ежегодно приводит к смерти примерно 850000 человек и обеспечивает утрату трудоспособности в 15010167 случаев [11, 150]. В исследовании NHANES (National Health and Nutrition Examination Surveys) показано, что распространенность дисфункции почек в общей популяции составляет 5% [51], однако истинная распространенность и заболеваемость в данном и ряде других исследований может недооцениваться. Например, в World Health Report не учитываются пациенты с сахарным диабетом, у которых в 30% случаев из 170 млн. таких пациентов имеется диабетическая нефропатия [11].
В настоящее время заболевания почек рассматриваются в качестве одной из наиболее важных проблем системы здравоохранения из-за значительной распространенности в популяции, резкого снижения качества жизни пациентов и высокой смертности, дорогостоящих методов заместительной терапии на терминальной стадии – диализа и трансплантации почки [9].
Развитие биомедицинской науки и фармакологии в XX веке, уточнение патогенеза и выявление факторов риска хронических заболеваний почек, заложило основы для разработки ряда подходов к диагностике, профилактике и терапии, позволяющих существенно замедлить прогрессирование заболевания почек. Такие подходы оказались применимы к подавляющему большинству пациентов с почечной патологией, независимо от ее причины, и потребовали от нефрологов выработки ориентиров, которые позволяли бы правильно выбирать терапевтические вмешательства соответственно этапу развития патологического процесса [9]. Вместе с тем, в медицине до последнего времени отсутствовали не только общепринятые рубрикации различных стадий прогрессирования патологического процесса в почках, но и универсальная терминология. Таким образом, стала очевидной необходимость определения факторов риска развития и прогрессирования хронического патологического процесса, выработки «единого языка», в котором давались бы принятые всем нефрологическим сообществом единые трактовки самых основополагающих понятий клинической нефрологии [9, 11, 35].
Исторически первая масштабная попытка разработки единой признанной мировым научным сообществом концепции и терминологии была предпринята в начале XXI века Национальным Почечным Фондом США (НПФ). Для этой цели была создана группа экспертов, включающая специалистов в области нефрологии, эпидемиологии, клинической лабораторной диагностики, диетологии, социальной деятельности, геронтологии, а также семейной медицины. В разработке данной модели принимали участие эксперты Европейской Почечной Ассоциации – Европейская Ассоциация Диализа и Трансплантации (ERA-EDTA) и Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) [110]. В результате анализа более 18 000 публикаций по вопросам диагностики и лечения заболеваний почек, прогностической роли биомаркеров, оценки ряда показателей, определяющих течение и исходы заболеваний почек, терминологии и согласований с представителями бюрократии, был достигнут консенсус, результатом которого стало принятие определения хронической болезни почек (ХБП), единой терминологии и стратификации ХБП.
Хроническую болезнь почек определяют как наличие повреждения почек (снижения уровня функции почек или наличие любых маркеров повреждения почек) в течение трех месяцев и более, независимо от диагноза [9, 35]. Независимость ХБП от основного диагноза является важнейшим принципом в определении данного состояния [11]. Под маркерами повреждения почек следует понимать любые изменения, выявляющиеся при клинико-лабораторном обследовании, которые связаны с наличием патологического процесса в почечной ткани (Таблица 1.1.1).
Трехмесячное ограничение (критерий «стойкости») в качестве временного параметра определения ХБП было выбрано потому, что в данные сроки острые варианты развития дисфункции почек, как правило, завершаются выздоровлением или приводят к очевидным клинико-морфологическим признакам хронизации процесса [9]. В 2002 г. была принята классификация ХБП, состоящая из пяти стадий в зависимости от выраженности снижения функции почек (Таблица 1.1.2) [35]. Критерии определения стадий ХБП у взрослых и детей идентичны.
Как видно из таблицы 1.1.2, стадия ХБП в классификации НПФ оценивается по величине расчетной скорости клубочковой фильтрации (рСКФ). Эксперты НПФ сочли данный показатель наиболее полно и просто (в виде одного числового значения), отражающим функциональное состояние почек.
В 2005 году организация KDIGO поддержала инициативу K/DOQI, направленную на широкое использование термина «ХБП». В МКБ-10 ХБП не классифицируется, однако, в международной классификации ICD-9-CM, начиная с 1 октября 2005 года, всем пяти стадиям ХБП присвоены свои коды.
В 2007 г. в Москве на Пленуме Правления Научного Общества Нефрологов России данная проблема была детально проанализирована, в результате чего было принято решение о разработке Национальных Рекомендаций, вышедших в 2012 году [9].
Гистологическое исследование почечной паренхимы, содержание Klotho и FGFR1 в почке при моделировании ХБП
У крыс контрольных моделей W2, SHR1 не было обнаружено значительных нарушений гистоархитектоники органа: соотношение коркового и мозгового слоев близко к норме, клубочки не увеличены, просветы канальцев не сужены, проявлений дистрофических изменений и атрофии канальцев не выявлено. При окраске трихром по Массону коллагеновые волокна наблюдали вдоль сосудов, рядом с клубочками и под капсулой почки, общая площадь соединительной ткани не превышала 5% от площади тубулоинтерстиция, выраженный фиброз и гомогенные отложения коллагеновых волокон не обнаружены (Рис. 3.2а).
В реализованных моделях хронического повреждения почек наблюдали патоморфологические проявления характерные для ХБП у пациентов.
У крыс с 3/4 НЭ – модели W2(3/4), SHR1(3/4), SHR2(3/4), были отмечены деструктивные изменения тубулоинтерстиция: сужение просвета канальцев, клетки которых приобретали неправильную форму, зернистость цитоплазмы эпителиоцитов, площадь фиброзированной ткани достигала 15-20% от площади тубулоинтерстиция (Рисунок 3.1, 3.2). Помимо этого, наблюдали частичное склерозирование клубочков в юкстамедуллярной коре.
У крыс с 5/6 НЭ – модели SHR1(5/6), SHR2(5/6), обнаружены значительные дистрофические изменения тубулоинтерстиция: зернистая дистрофия и в некоторых случаях некроз эпителиоцитов, нарушение структуры щеточной каемки клеток проксимальных канальцев. Наблюдали частичное и полное склерозирование гломерул в субкапсуляной и юкстамедуллярной коре. В интерстиции коркового вещества почки отложения коллагена составляли до 30% от площади ткани (Рисунок 3.1, 3.2б).
Белок Klotho в почке крыс был локализован преимущественно в корковом веществе, специфическое окрашивание наблюдали в проксимальных (ПК) и дистальных канальцах (ДК), а также начальном отделе собирательных трубочки (СТ) нефрона (Рисунок 3.3). В ПК было выявлено цитоплазматическое окрашивание (отмечено в моделях W2, SHR1; Рисунок 3.3 б, в), окрашивание апикальной части клетки и щеточной каёмки (модели W2, SHR1, SHR2; Рисунок 3.3 б-е). В ДК белок Klotho детектировали в цитоплазме эпителиоцитов (модели W2, SHR1, Рисунок 3.3 б, в), в модели SHR2 белок Klotho в ДК практически отсутствовал (Рисунок 3.3 е). В начальном отделе СТ Klotho был локализован преимущественно в апикальной части эпителиоцитов (Рисунок 3.3 в, г). В редких случаях наблюдали окрашивание цитоплазмы эндотелия сосудов.
При усугублении патологии почек локализация Klotho как в ткани, так и в клетке несколько изменялась (Рисунок 3.4). У моделей более ранних стадий хронического повреждения почек W2(3/4) и SHR1 присутствовало как равномерное цитоплазматическое окрашивание, так и окрашивание щеточной каёмки ПК (Рисунок 3.4 а, б). У моделей с более поздними стадиями хронического повреждения почек SHR2(3/4), SHR1(5/6), SHR2(5/6) цитоплазматическое окрашивание ПК практически отсутствовало, преобладала окраска щеточной каймы (Рисунок 3.4 в-д). У некоторых крыс более поздних моделей ХБП W2(3/4), SHR1(5/6), SHR2(3/4), SHR2(5/6) наблюдали зернистое окрашивание цитоплазмы клеток ПК, что, вероятно, связано с дистрофическими изменениями канальцев в результате прогрессирования хронического процесса (Рисунок 3.4 а, в).
Экспрессию рецептора FGF23 – FGFR1, исследовали в тубулоинтерстиции коркового вещества почки. Наблюдали равномерное цитоплазматическое окрашивание эпителиоцитов ПК и ДК, окрашивание гранул, а также в некоторых случаях продукт реакции был локализован в перинуклеарной области клетки и в области базального лабиринта (Рисунок 3.5).
Цитоплазматическая локализация продукта, и локализация в перинуклеарной области, вероятно, связаны с поддержанием синтеза FGFR1 в клетках тубулярного эпителия. Локализация в области базальной исчерченности связана с представленностью FGFR1 на базальной мембране клетки, где он выполняет рецепторную функцию. При морфометрическом исследовании оценивали общее содержание FGFR1 в тубулоинтерстиции.
Согласно результатам морфометрии экспрессия белка Klotho в корковом веществе была значительно ниже в моделях хронического повреждения почек по сравнению с контролем (Таблица 3.3). У крыс модели W2(3/4) содержание Klotho в почке было достоверно ниже, чем в контрольной группе W2 (Таблица 3.3). У крыс линии SHR, стратифицированных по степени повреждения почек, уровень ренального Klotho достоверно снижался по мере роста повреждающего воздействия (Таблица 3.3).
При сравнении попарно достоверное снижение экспрессии Klotho в почке наблюдали в модели SHR2 (0,315±0,066) при сравнении с контролем SHR1 (0,224±0,077) (р=0,015). Следует отметить, что SHR2 является моделью наиболее раннего хронического повреждения почек из исследуемых. В моделях SHR1(3/4) (0,244±0,048) и SHR1(5/6) (0,199±0,051) уровень Klotho был ниже, чем в модели SHR1 (0,315±0,066) (pSHR1-SHR1(3/4)=0,018, pSHR1-SHR1(5/6) 0,001). У крыс моделей SHR2(5/6) (0,134±0,024) уровень Klotho был ниже, чем у моделей SHR2 (0,224±0,077; pSHR2-SHR2(5/6)=0,007) и SHR2(3/4) (0,214±0,030; pSHR2(3/4)-SHR2(5/6) 0,001), которые значительно не различались по содержанию Klotho в почке (pSHR2-SHR2(3/4)=0,71).
Содержание FGFR1 в кортикальной области почки достоверно не различалось, как при сравнении попарно групп с разными сроками эксперимента и повреждающим воздействием (Таблица 3.3), так и при оценке тренда изменения уровня FGFR1 в группах, стратифицированных по тяжести хронического повреждения почек (pАnova = 0,31).
Анализ корреляционной взаимосвязи уровня ренального Klotho с основными параметрами функции почек и метаболизма Pi, показал, что по мере прогрессирования патологии Klotho в тубулоинтерстиции снижается: содержание Klotho в почке обратно коррелировало с концентрацией мочевины (r= - 0,60, p 0,05) и креатина в крови (r= - 0,58, p 0,05). Помимо этого, уровень Klotho был ассоциирован с фиброзом тубулоинтерстиция (r= -0,48, p 0,05). При использовании множественного регрессионного анализа было показано, что FEPi в большей степени связана с уровнем белка Klotho в почке (=-0,36±0,11; р=0,002) и с концентрацией FGF23 (=0,25±0,11; р=0,034) в сыворотке крови, несмотря на включение в качестве зависимых переменных других факторов – FGFR1 (=0,15±0,11; р=0,19) и PTH (=0,12±0,10; р=0,15).
На данном этапе исследования было показано, что достоверное снижение ренального Klotho происходит уже на самых ранних из моделируемых стадий ХБП, в модели SHR2, по клиренсу креатинина и суточной потере белка не отличающейся от контроля SHR1, и соответствующей пограничному значению между нормой и умеренной уремией. При этом содержание FGFR1 в почке остается стабильным независимо от сроков экспериментального воздействия и степени повреждения. Изменение уровня Klotho происходит одновременно с ростом экскреции Pi почками, при этом, Klotho в наибольшей степени из исследуемых фосфотонинов ассоциирован с относительной экскрецией Pi почками (FEPi).
Результаты гистологичсекого исследования: преимущественная локализация Klotho на щеточной каёмке ПК, а также локализация Klotho в гранулах эпителиоцитов ПК, вероятно связанная с эндоцитозом, позволили предположить участие секреторной формы Klotho при развитии патологического процесса, что было учтено при планировании клинической части работы.
Klotho, FGF23 и PTH у пациентов с начальными стадиями ХБП
Экспрессия Klotho выявлена в тубулярном эпителии коркового вещества почки. Специфический продукт иммуногистохимической реакции детектировали в проксимальных и дистальных канальцах и начальном отделе собирательных трубочек коркового вещества (Рисунок 3.8). В дистальном отделе нефрона – ДК и начальном отделе СТ, продукт реакции был выражен активнее (цитоплазма канальцев была окрашена более интенсивно). В ПК, продукт реакции имел цитоплазматическую локализацию, окрашивание щеточной каемки отсутствовало (Рисунок 3.8).
По мере прогрессирования дисфункции почек наблюдали снижение содержания Klotho в тубулоитерстиции (Рисунок 3.9).
Площадь экспрессии Klotho в тубулоинтерстиции была достоверно ниже в группе 2 и объединенной группе 3-4 в сравнении с группой 1 (Рисунок 3.10).
Снижение содержания специфического продукта ИГХ в дистальном отделе нефрона, морфологически проявлялось как отсутствие окраски отдельных эпителиоцитов и снижение интенсивности окрашивания цитоплазмы с изменением внутриклеточной локализации продукта реакции (Рисунок 3.11).
Площадь экспрессии Klotho в дистальном отделе нефрона была выше у пациентов группы 2 (рСКФ 99-70 мл/мин/1,73 м2) по сравнению с группой 1 (рСКФ 140-100 мл/мин/1,73 м2), в группе 3 и 4 наблюдали тенденцию к снижению содержания Klotho в дистальном отделе нефрона по сравнению с группой 2 (Рисунок 3.12)
Концентрация Klotho в сыворотке была ниже в объединенной группе 3 и 4 (рСКФ 69-30 мл/мин/1,73 м2) в сравнении с группой 1 (Рисунок 3.13 А). Среднее значение uKlotho/uCr было несколько выше в группе 2, однако, достоверные различия между группами отсутствовали (Рисунок 3.13 Б).
Концентрация Klotho в сыворотке имела достоверную прямую корреляцию с рСКФ (r=0,35, p=0,002) и обратную с выраженностью склеротических изменений: атрофии канальцев (r= - 0,44, p=0,037), очагового интерстициального фиброза (r= - 0,43, p=0,025) и индексом гломерулярного склероза (r=-0,45, p=0,015). Концентрация Klotho в моче прямо коррелировала с суточной экскрецией Pi (uPi24) (r=0,31, p=0,015).
В исследуемых группах средние концентрации PTH находились в пределах нормальных значений (12-88 пг/мл, Рисунок 3.14 А). При сравнении групп попарно выявлено достоверное увеличение PTH при снижении рСКФ, начиная с группы 2 (Рисунок 3.14 А). Концентрация FGF23 в группах 1, 2, 3 находились в пределах нормы 8,2-54,3 пг/мл [19] и достоверно не различались (Рисунок 3.14 Б). Только в группе 4 (рСКФ 49-30 мл/мин/1,73 м2) концентрация FGF23 была достоверно выше по сравнению с группами 1, 2, 3 (Рисунок 3.14 Б).
В общей группе пациентов концентрация Pi в сыворотке прямо коррелировала с FGF23 и PTH, относительная экскреция фосфата (FEPi) прямо – с концентрациями FGF23, PTH, и обратно – с содержанием Klotho в тубулоинтерстиции; абсолютная экскреция Pi (uPi24) прямо коррелировала с Klotho в моче (Таблица 3.7).
В подгруппе больных с начальным снижением функции почек (рСКФ 70 мл/мин/1,73 м2) показатель uPi24 прямо коррелировал с концентрацией Klotho в моче, а FEPi – с FGF23 и PTH. У больных с рСКФ 70 мл/мин/1,73 м2 концентрация Pi сыворотки прямо коррелировала только с FGF23, FEPi– с PTH (Таблица 3.7).
В общей выборке, как и в подгруппах, концентрация FGF23 прямо коррелировала с концентрацией PTH: в общей группе r=0,48, p 0,001; в группе пациентов с рСКФ70 мл/мин/1,73 м2 – r=0,57, p 0,001; в группе пациентов с рСКФ 70 мл/мин/1,73 м2 – r=0,44, p=0,013).
При этом множественный регрессионный анализ показал, что концентрация Klotho в моче ассоциирована с абсолютной экскрецией фосфата, независимо от включения в модель в качестве независимых переменных FGF23 и PTH. Факторами, независимо связанными с общим содержанием Klotho в почке, являются только рСКФ (= 0,52; р=0,044) и uKlotho/uCr ( = -0,28; р=0,019). С концентрацией Klotho в сыворотке ассоциированы индекс гломерулярного склероза (ИГС) (= -0,30; р=0,018) и тубулоинтерстициальные изменениямя (ТИИ) (= -0,30; р=0,034).
Концентрации FGF23, как и PTH, не зависели от значений Klotho в сыворотке и общего содержания Klotho в почке. Независимыми предикторами роста концентрации FGF23 были PTH (= 0,35; р= 0,011), Pi сыворотки (= 0,37; р= 0,003), концентрации PTH – рСКФ (= -0,41; р= 0,032), и FGF23(= -0,41; р= 0,011). Прямую достоверную связь с Pi сыворотки имел FGF23, с FEPi – PTH. (Таблица 3.8).
Коррекция моделей по возрасту, Klotho в тубулоинтерстиции, Klotho в сыворотке, индексу гломерулярного склероза, тубулоинтерстициальным изменениям (кроме показателей, приведенных в таблице); знак «-» – указывает на отсутствие связи, пустая ячейка – на то, что данный параметр не был использован в модели
Обсуждение результатов
Центральная роль системы FGF23/Klotho в механизмах дисрегуляции обмена Pi при ХБП в настоящее время признается очевидной [3, 33, 64, 74, 132, 160]. Считается, что FGF23 и его ко-рецептор Klotho определяют увеличение мочевой экскреции Pi, тем самым поддерживая его нормальную концентрацию в плазме крови в условиях любого снижения СКФ. Вместе с тем, существующие представления основаны на результатах, полученных в генетических моделях с интактными почками, либо в экспериментальных и клинических исследованиях относительно поздних стадий, соответствующих рСКФ 60 мл/мин/1,73 м2 и меньше [107]. Впоследствии эти результаты при отсутствии достаточной доказательной базы были экстраполированы на начальные стадии формирования задержки Pi. Действительно, известные генетические модели определенно указывают на почечную задержку Pi при нокауте генов FGF23 и Klotho, и обратный ответ при их активирующих мутациях у животных [83, 84]. При этом не вполне ясно, есть ли причинно-следственная связь между активацией системы FGF23/Klotho и фосфатурией при начальном снижении функции почек. Отчетливое повышение FGF23 выявляется при рСКФ менее 60 мл/мин/1,73 м2 ( 60% остаточной функции органа) [67, 121]. В то время как, согласно опубликованным данным и полученным нами результатам (Таблица 3.2, Рисунок 3.7В), экскретируемая почками фракция Pi значительно увеличивается гораздо раньше, в диапазоне рСКФ 120-90 мл/мин/1,73 м2 (то есть, при нормальной функции почек).
При выполнении диссертационного исследования для моделирования ранних стадий хронического повреждения почек различной степени выраженности экспериментальных животных подвергали частичной нефрэктомии (резекция 3/4 почки) [7, 167] и субтотальной нефрэктомии (резекция 5/6 почки) [22, 48, 62, 86, 119, 158]. Реализованные хирургические техники позволили получить четкую градацию хронического поражения почек, сопоставимого с первой-третьей стадиями ХБП у пациентов, что подтверждалось характеристиками функции почек у крыс экспериментальных групп – концентрациями креатнина и мочевины в крови, общего белка в моче и показателями клиренса креатинина (Таблица 3.1). Независимо от этиологии общей характеристикой для ХБП является наличие прогрессирующего фиброза, который в конечном итоге поражает все структуры почки и приводит к терминальной почечной недостаточности [108]. Хорошо известно, что выраженность и распространенность тубулоинтерстициального фиброза напрямую связаны с функцией почек [175]. Наблюдаемое в эксперименте закономерное увеличение площади фиброза коры почки, свидетельствует о соответствии реализуемых моделей начальным стадиям ХБП (Рисунок 3.1). Адекватность примененного экспериментального подхода также была подтверждена ожидаемыми изменениями обмена Pi. Экскретируемая фракция Pi достоверно повышалась, концентрация Pi в сыворотке снижалась в группах животных подвергнутых НЭ по сравнению с контрольными группами (Таблица 3.2). Такие изменения определенно отражают почечные фосфотонические эффекты, возникающие в ответ на ретенцию Pi вследствие начального снижения количества функционирующих нефронов. Следовательно, были получены экспериментальные модели, в достаточной мере соответствующие клинико-лабораторным проявлениям начальных стадий ХБП. Благодаря чему в эксперименте и клинике наблюдали единообразные изменения исследуемых фосфат-регулирующих систем.
В основу настоящей работы была положена гипотеза о редукции Klotho в почке как первичном событии при формировании системного дисбаланса Pi. При исследовании содержания ренального Klotho в клетках эпителия проксимальных канальцев детектировали три основных варианта его локализации – в цитоплазме, в транспортных везикулах и щеточной каемке. Наличие специфического продукта ИГХ реакции в цитоплазме и апикальной мембране эпителиоцитов соответствует результатам Hu M.C. и др. (2010), и подтверждают возможность прямого действия FGF23 на проксимальные канальцы [56, 102]. В контрольной группе крыс Вистар в цитоплазме эпителиоцитов выявляли яркоокрашенные гранулы, что может быть связано с конститутивным синтезом белка Klotho при отсутствии хронического повреждения почек. По мере роста повреждающего воздействия происходило снижение окрашивания цитоплазмы, продукт ИГХ реакции был локализован преимущественно в щеточной каемке и транспортных везикулах. Наличие в цитоплазме клеток ПК везикул со слабой положительной реакцией к Klotho является проявлением дистрофических изменений канальцев, связанных с нарушением внутриклеточного транспорта при хроническом повреждении почек. Позитивное окрашивание транспортных везикул может являться результатом «захвата» Klotho апикальной плазматической мембраной эпителия проксимальных канальцев.
Циркулирующая изоформа белка Klotho присутствует в просвете канальцевой системы нефрона, а также детектируется в моче человека и экспериментальных животных – мышей и крыс [102]. Белок Klotho может попадать (из капилляров или дистальных канальцев) и транспортироваться через базолатеральную мембрану, а также синтезироваться in situ в проксимальных канальцах, в том числе, могут иметь место оба варианта одновременно. При передаче внутриклеточного сигнала FGF23 взаимодействует с рецептором FGFR1 и ко-рецептором Klotho на базальной мембране эпителиоцитов [56]. Тем не менее, при светооптическом исследовании окрашивание базолатеральной мембраны клеток отсутствовало. Способность циркулирующей формы Klotho образовывать комплексы с FGF23 предполагает возможность передачи сигнала от FGF23 / FGFR в присутствии свободного Klotho [176]. Кроме того, окрашивание щеточной каймы и наличие Klotho в эндоцитозных везикулах, свидетельствует о присутствии не связанных с мембраной изоформ Klotho. Со стороны щеточной каемки циркулирующие изоформы Klotho независимо от FGF23 способны приводить к интернализации натрий-фосфатных ко-транспортеров и фосфатурии [85], в связи с чем при проведении клинического исследования также оценивали концентрации циркулирующих изоформ Klotho.
Значительное снижение продукции ренального Klotho наблюдали как при начальной, так и при выраженной хронической дисфункции почек, что соответствовало ранее опубликованным данным [17, 21, 44, 164]. В проведенных экспериментах экспрессия белка Klotho в почке достоверно снижалась с ростом повреждения органа (Таблица 3.3). Это было очевидно в моделях НЭ, однако интересно, что нам удалось документировать достоверное снижение ренального Klotho даже у ложнооперированных животных – в модели SHR2, соответствующей наиболее ранней из реализуемых стадий хронической дисфункции почек, где фактором повреждения на протяжении двух месяцев была только артериальная гипертензия (Таблица 3.3). Клинические данные о снижении rKlotho по мере снижения СКФ соответствовали экспериментальным (Рисунок 3.10). Кроме того, в клиническом исследовании удалось показать параллельное снижение пула циркулирующего Klotho (Рисунок 3.13A), роль которого как системного эндокринного регулятора в настоящее время дискутируется [83, 84].
Подобные данные могут указывать на Klotho как на маркер ренального повреждения и фактор, связанный с его прогрессированием [173]. Данное предположение было проверено в клинической части настоящего исследования, где была показана высокая прогностическая ценность определения концентрации Klotho в крови и моче при оценке прогрессирования патологических изменений тубулоинтерстиция и гломерулярного склероза (Рисунок 3.15, 3.16).
Помимо ко-рецептора Klotho при трансдукции внутриклеточного сигнала FGF23 задействован его канонический рецептор FGFR1 [24, 72]. Снижение экспрессии FGFR1 в почке при ХБП может приводить к резистентности органа по отношению к FGF23 с последующим компенсаторным повышением его синтеза остеоцитами. Данные об изменении экспрессии рецепторов FGF23 при ХБП на настоящий момент обнаружить не удалось. При гистологическом исследовании паренхимы почки специфический продукт ИГХ реакции наблюдали в секреторных гранулах и цитоплазме эпителиоцитов проксимального и дистального отделов нефрона. На протяжении всего эксперимента продукт реакции обнаруживали в перинуклеарной области клеток эпителия канальцев, что свидетельствует о сохранном биосинтезе FGFR1, несмотря на хроническое повреждение почек. Тип локализации FGFR1 не изменялся в экспериментальных моделях и не зависел от выраженности повреждающего воздействия. Также во всех моделях FGFR1 был представлен на базальной мембране эпителиоцитов ПК и ДК, где он выполняет рецепторную функцию. При оценке общего содержания FGFR1 в коре почки статистически значимых различий между исследуемыми моделями выявлено не было, что не позволило подтвердить существенное значение FGFR1 в формировании дисбаланса метаболизма фосфата при начальном снижении функции почек.