Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Профилактика и лечение первичных иммунодефицитов – важнейший вектор развития медицинской науки и практического здравоохранения (обзор литературы) 18
1.1 Наследственная патология как медицинская и социальная проблема 18
1.2 Неонатальный скрининг как оптимальная концепция предиктивно превентивной и персонализированной медицины XXI века 19
1.3 Неонатальный скрининг в Российской Федерации 22
1.4 Профилактика и лечение первичных иммунодефицитов – одна из первоочередных задач медицинской науки и практического здравоохранения 25
1.5 Тяжелая комбинированная иммунная недостаточность: диагностические, клинические, терапевтические и генетические аспекты 30
1.6 Неонатальный скрининг на ТКИН и другие формы первичных иммунодефицитов 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 56
2.1 Отбор материала 57
2.2 Экстракция ДНК 57
2.3 Определение TREC и KREC методом количественной ПЦР в режиме реального времени 59
2.4 Молекулярно-генетическая верификация первичных иммунодефицитов у детей с низкими значениями TREC и (или) KREC 62
2.5 Методы математической обработки данных 69
ГЛАВА 3. Определение нормативных значений количества trec и krec в сухих пятнах крови новорожденных и проведение сравнительного анализа уровней данных маркеров в группе условно здоровых детей и детей с иммунозависимой патологией 70
3.1 Определение уровней TREC и KREC в сухих пятнах крови условно здоровых новорожденных 70
3.2 Определение уровней TREC и KREC в сухих пятнах крови новорожденных с разной степенью недоношенности 73
3.3 Сравнительный анализ уровней TREC и KREC в группах условно здоровых детей и детей с иммунозависимой патологией на первом году жизни 81
ГЛАВА 4. Фенотипическая характеристика детей с дебютом иммунозависимой патологии на первом году жизни 85
4.1. Течение антенатального периода у детей с дебютом иммунозависимой патологии на первом году жизни 87
4.2 Фенотипические особенности детей с дебютом иммунозависимой патологии на первом году жизни 87
ГЛАВА 5. Фенотипическая характеристика детей с клиническими и лабораторными признаками иммунопатологии и низкими значениями trec и krec в сухих пятнах крови в неонатальном периоде 98
5.1 Характеристика детей с лимфопенией и/или гипогаммаглобулинемией и низкими значениями TREC и KREC в неонатальном периоде 99
5.2 Молекулярно-генетическая верификация диагноза ПИД у детей с лимфопенией и/или гипогаммаглобулинемией и низкими значениями TREC и KREC в неонатальном периоде 100
5.3 Характеристика детей с врожденными пороками развития и низкими значениями TREC и KREC в неонатальном периоде 108
5.4 Характеристика детей с летальными исходами на первом году жизни и низкими значениями TREC и KREC в неонатальном периоде 110
5.5 Молекулярно-генетическая диагностика ПИД у детей с летальными исходами на первом году жизни и низкими значениями TREC и KREC в неонатальном периоде 113
5.6 Характеристика детей с перинатальным контактом по ВИЧ и низкими значениями TREC в неонатальном периоде 120
Заключение 126
Практические рекомендации 144
Список сокращений 146
Список использованной литературы 150
- Профилактика и лечение первичных иммунодефицитов – одна из первоочередных задач медицинской науки и практического здравоохранения
- Определение TREC и KREC методом количественной ПЦР в режиме реального времени
- Определение уровней TREC и KREC в сухих пятнах крови новорожденных с разной степенью недоношенности
- Фенотипические особенности детей с дебютом иммунозависимой патологии на первом году жизни
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Проблема раннего выявления детей с первичными иммунодефицитами
(ПИД) в Российской Федерации по-прежнему остается актуальной, несмотря
на значительные успехи в диагностике и лечении таких больных во многих
странах мира (Kwan A., Puck J.M. History and current status of newborn screening
for severe combined immunodeficiency. Semin Perinatol. 2015. Vol.39. № 3. P.
194-205; Чернышева Е.В., Анастасевич Л.А., Щербина А.Ю. и др.
Современные возможности скрининга и диагностики первичных
иммунодефицитных состояний в педиатрии. Педиатрия. 2016. № 3. С. 124– 128). Первичные иммунодефициты – это обширная группа тяжелых, генетически детерминированных заболеваний, вызванных необратимым нарушением одного или нескольких звеньев иммунитета. Разработка и внедрение в практическую медицину современных клинико-диагностических и лабораторных тестов оценки функционирования иммунной системы, бурный рост данных о ведущей роли иммунной системы в патогенезе возникновения и развития целого ряда острых и хронических заболеваний, привели к кардинальным изменениям во взглядах на первичные иммунодефициты. Пересмотру подверглись не только классификация ПИД, изменились данные по частоте встречаемости отдельных нозологий, значительно расширилось представление о клинических проявлениях данных заболеваний. Широко известные «10 признаков ПИД» (Arkwright P.D., Gennery A.R. Ten warning signs of primary immunodeficiency: a new paradigm is needed for the 21st century. Ann N Y Acad Sci. 2011. Vol.123. № 8. P. 7-14), сформулированные иммунологами и в основном имеющие отношение к инфекционным проявлениям ПИД, не потеряли своей актуальности, однако на первый план в современной клинической иммунологии выходит изучение молекулярно-генетических основ первичных иммунодефицитов для более точного понимания патогенеза этих заболеваний и оптимизации подходов к таргетной консервативной и куративной терапии ПИД.
В настоящее время известно более 350 генов, мутации в которых
приводят к первичным иммунодефицитам (IUIS: Генетические дефекты могут являться причиной нарушения
работы целого органа иммуногенеза (гипоплазия тимуса при синдроме
делеции 22 хромосомы) или полного «выключения» одной из субпопуляций
клеток иммунной системы (отсутствие В-лимфоцитов при
агаммаглобулинемии). Пациенты с ПИД могут оказаться в поле зрения специалистов самого разного профиля: пульмонологов, гастроэнтерологов, нефрологов, дерматологов, кардиологов и др. Поэтому настороженность врачей различных специальностей в отношении ПИД, ранняя диагностика таких заболеваний на местах, преемственность в передаче пациента для углубленного и специализированного обследования и лечения представляются как никогда актуальными.
Наиболее неблагоприятной группой первичных иммунодефицитов
являются тяжелые комбинированные иммунодефициты (ТКИД), или тяжелая
комбинированная иммунная недостаточность (ТКИН). Внедрение
генетического тестирования новорожденных на ТКИН и другие формы ПИД
методом количественной оценки TREC и KREC (T-cell receptor excision circle,
kappa deleting recombination excision circle – кольцевых участков ДНК,
формирующихся в процессе V(D)J-рекомбинации генов Т-клеточного и B-
клеточного рецептора лимфоцитов), успешно реализованное в большинстве
штатов Америки, Нидерландах, Израиле и некоторых странах Европы
позволило перенести данные заболевания из разряда фатальных в группу
предотвратимых заболеваний (Barbaro M., Ohlsson A., Borte S. et al. Newborn
Screening for Severe Primary Immunodeficiency Diseases in Sweden-a 2-Year Pilot
TREC and KREC Screening Study. J Clin Immunol. 2017. Vol. 37, № 1. P. 51-60).
Однако в России большая часть пациентов с ТКИД умирают
недиагностированными в первые 2 года жизни (Латышева Е.А. Первичные иммунодефициты: состояние проблемы на сегодняшний день: Jmf-центры в России. Вопросы современной педиатрии. 2013. Т.12. № 6. С. 73-77). Гиподиагностика данных заболеваний, долгое время считавшихся редкими, обусловлена как отсутствием настороженности у специалистов первичного звена, так и малодоступностью современных методов молекулярно-генетического анализа в повседневной клинической практике.
Поскольку в России ТКИН не входит в Программу обязательного
массового обследования новорожденных, истинная частота распространения
этой группы заболеваний в популяции остается неизвестной. Кроме того,
существующего объема данных о фенотипических и генотипических
особенностях российских пациентов с первичными иммунодефицитами
недостаточно для создания и планирования эффективной комплексной
системы превентивных мероприятий по дифференциальной,
пресимптоматической и пренатальной диагностике этих заболеваний.
В 2013 году в России разработан отечественный набор реагентов для
количественного одновременного определения копий TREC и KREC («T&B
Test»), который может применяться для оценки эффективности
функционирования иммунной системы пациентов различного возраста, и, что
особенно ценно, у новорожденных (Гордукова М.А., Оскорбин И.П.,
Мишукова О.В. и др. Разработка набора реагентов для количественного
определения молекул ДНК TREC и KREC в цельной крови и сухих пятнах
крови методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.
Медицинская иммунология. 2015. Т.17, № 5. С.467-478). Организация работы
по включению тестирования на ТКИН в российскую национальную
Программу скрининга новорожденных требует серьезных экономических и
финансовых затрат, однако в государственном масштабе они будут
компенсированы за счет снижения детской смертности, уменьшения числа
инвалидов детства, сохранения здоровья и работоспособности индивидов,
получающих адекватную терапию, нивелирующую патологические
проявления ПИД [1, 6, 8].
Все вышеизложенное послужило обоснованием необходимости
проведения нашего исследования.
Цель исследования
Оценить диагностическую и прогностическую значимость
количественного определения кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов в сухих пятнах крови новорожденных детей для раннего выявления дефектов функционирования иммунной системы.
Задачи исследования
-
Модифицировать существующий метод количественного определения кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов в цельной периферической крови, используя в качестве исследуемого материала фильтровальные карточки (тест-бланки) с сухими пятнами крови новорожденных, взятых для рутинного неонатального скрининга.
-
Определить нормативные значения количественных показателей содержания кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов в сухих пятнах крови условно здоровых доношенных новорожденных и детей с разной степенью недоношенности.
-
Провести сравнительный анализ значений количественных показателей кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов в сухих пятнах крови, взятых в ранний неонатальный период, у детей с клиническими признаками иммунных нарушений на первом году жизни и условно здоровых детей.
-
Определить диагностическую значимость количественного определения кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов в ранний неонатальный период у детей с клиническими проявлениями иммунозависимой патологии на первом году жизни.
-
Провести генетическую верификацию первичных иммунодефицитов у детей с низкими значениями количественных показателей кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов, выявленными в раннем неонатальном периоде.
Методология и методы исследования
Для достижения цели и решения поставленных задач был проведен сравнительный анализ клинических, анамнестических и лабораторных данных, включающих иммунологическую оценку состояния здоровья условно здоровых детей и детей с фенотипическими проявлениями иммунозависимой патологии на первом году жизни. Материалом для исследования служили
образцы сухих пятен крови 172 новорожденных, родившихся в Свердловской области в 2011-2015 гг., собранные на стандартные фильтровальные карточки для проведения рутинного неонатального скрининга. В первую группу вошли 65 детей (34 мальчика, 31 девочка) с клиническими признаками иммунозависимой патологии, проявившейся на первом году жизни. В контрольную группу были отобраны 52 условно здоровых ребенка (26 мальчиков, 26 девочек), родившихся в тот же период времени. Для получения данных о влиянии гестационного возраста плода на уровень исследуемых маркеров были отобраны 55 новорожденных с разной степенью недоношенности. Исследования одобрены локальным этическим комитетом ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» УрО РАН (протокол № 1 от 15 июня 2017 года).
У всех детей, включенных в исследование, проводили ретроспективный анализ медицинской документации: амбулаторных карт, карт истории развития ребенка, архивных историй болезни, протоколов вскрытия. Анализ документов проводился с участием клинических специалистов: врачей неонатологов, иммунологов, генетиков, патологоанатомов.
Для верификации диагноза «первичный иммунодефицит» применялись молекулярно-генетические методы исследования: метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, метод таргетного секвенирования генов по Сэнгеру, метод мультиплексной лигазной амплификации проб (multiplex ligation dependent probe amplification, MLPA).
Математическую обработку данных проводили с использованием пакетов прикладных программ Excel, Statistica 7.0 for Windows.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Достоверность полученных результатов исследования обеспечена
обоснованностью исходных теоретических позиций, достаточным объемом
выборки, использованием современных лабораторных методов,
воспроизводимостью результатов, применением компьютерных программ статистического анализа полученных данных и подтверждена экспертной комиссией ФГБУН ИИФ УрО РАН (акт проверки первичной документации от 14 июня 2017 года).
Основные положения диссертации представлены на симпозиуме Евроазиатского проекта J Project в рамках Российского научного форума (г. Екатеринбург, 23-25 октября 2014 г.), заседаниях управляющего комитета (Steering Committee Meeting) J Project (г. Будапешт, 06 марта 2015 г. и 03 марта 2017 г.), на международной конференции J-Project по первичным иммунодефицитам в Анталье (Турция, март 2014 г.), на XII конференции «Иммунология Урала» (Пермь, 2-5 июля 2015 г.), на 4-ом европейском конгрессе иммунологов (EFIS) в Вене (Австрия, 6–9 сентября 2015 г.), конгрессе по проблемам первичных иммунодефицитов в Будапеште (Венгрия, сентябрь 2015 г.), на Симпозиуме по первичным иммунодефицитам в Минске (Беларусь, 23-26 апреля 2015 г.), на II Международной летней школе по первичным иммунодефицитам в Москве (18-19 мая 2016 г.), на
Калининградском научном форуме (Калининград, июнь 2016), на I научно-практической конференции аллергологов-иммунолологов Уральского федерального округа (Екатеринбург, октябрь 2016 г.), на III международном конгрессе по иммунологии, астме и аллергии в Тегеране (Иран, 15-17 февраля 2017 года), на 50-й юбилейной конференции Европейского общества генетиков человека (ESGH) в Копенгагене (Дания, 27-29 мая 2017 года), на XIV конференции иммунологов Урала (Челябинск, 27-29 августа 2017 года).
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Создание базовой идеи, планирование научной работы, интерпретация и анализ полученных результатов проводились диссертантом совместно с научным руководителем. Практическая лабораторная часть, включавшая выполнение молекулярно-генетических исследований, проводилась лично автором.
Положения, выносимые на защиту
-
Количественное определение кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов в сухих пятнах крови новорожденных позволяет выделить группу риска по развитию первичных иммунодефицитов у детей до начала клинической манифестации заболеваний.
-
Уровень содержания кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов в сухих пятнах крови новорожденных зависит от гестационного возраста плода и наличия генетических нарушений Т- и В-клеточного неогенеза.
-
Ретроспективное определение содержания кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов в сухих пятнах крови новорожденных позволяет определить истинную причину младенческой смертности в случаях прижизненно неверифицированного первичного иммунодефицита.
-
При молекулярно-генетической верификации клинического диагноза у детей с низкими значениями уровней содержания кольцевых участков дезоксирибонуклеиновой кислоты Т-клеточного (TREC) и В-клеточного (KREC) рецепторов лимфоцитов в популяции Свердловской области выявляются известные мутации и неописанные ранее варианты изменений нуклеотидной последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты в генах, ассоциированных с первичными иммунодефицитами.
Научная новизна
В результате проведенных научных исследований впервые в Российской Федерации выполнено следующее:
модифицирован способ экстракции ДНК из сухих пятен крови новорожденных для определения TREC и KREC методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени;
определены нормативные значения количества копий TREC и KREC в сухих пятнах крови доношенных новорожденных и детей с разной степенью недоношенности;
у детей с клиническими признаками первичных иммунодефицитов на первом году жизни ретроспективно выявлено снижение количества TREC и KREC в образцах сухих пятен крови, взятых для рутинного неонатального скрининга;
в группе детей с летальным исходом на первом году жизни и с низкими уровнями TREC/KREC в неонатальном периоде, проведена молекулярно-генетическая верификация синдромов первичной иммунной недостаточности.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Модифицированная методика количественного определения TREC и KREC в сухих пятнах крови, взятой для рутинного неонатального скрининга, позволяет использовать отечественный набор «Т&В Test» для ранней диагностики ТКИН и других форм первичных иммунодефицитов у новорожденных.
Генетическое тестирование на ТКИН и другие варианты ПИД методом определения TREC и KREC у новорожденных в первые дни жизни способствует повышению эффективности начального этапа дифференциальной диагностики инфекционных процессов у детей в критическом состоянии.
Своевременная молекулярно-генетическая верификация диагноза позволяет ускорить планирование и реализацию радикальных методов терапии, тем самым увеличивая вероятность излечения пациентов с ТКИН.
Проведение молекулярно-генетических исследований у пациентов с ПИД приводит к открытию новых вариантов нуклеотидной последовательности ДНК, что имеет большое значение для понимания генетической гетерогенности первичных иммунодефицитов и расширения общих знаний в иммуногенетике.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в практику Государственных
бюджетных учреждений здравоохранения Свердловской области «Областная
детская клиническая больница №1» и «Клинико-диагностический центр
Охрана здоровья матери и ребенка», используются в работе Областной
комиссии Минздрава Свердловской области по разбору случаев младенческих
и детских смертей. Результаты исследования внедрены в научно-
исследовательскую работу лаборатории иммунологии воспаления Института
иммунологии и физиологии УрО РАН, г. Екатеринбург. Материалы
диссертации включены в учебный процесс по дисциплине «аллергология и
иммунология» на кафедре терапии факультета повышения квалификации и
профессиональной переподготовки Федерального бюджетного
образовательного учреждения высшего образования «Уральский
государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Публикации
Соискатель имеет 15 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 11 научных работ общим объемом 1,5 печатных листа, в том числе 6 (5 статей, 1 тезисы) в научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России, 4 работы в материалах международных конференций, 1 статья в зарубежном научном издании; получена справка о приоритетном праве по заявке на патентное изобретение «Способ экстракции ДНК, пригодной для проведения количественной ПЦР в режиме реального времени, из сухих пятен крови новорожденных» (заявка № 2017100186 от 09.01.2017).
Объем и структура диссертации
Профилактика и лечение первичных иммунодефицитов – одна из первоочередных задач медицинской науки и практического здравоохранения
В 2012-2015 годах в Свердловской области действовала программа расширенного неонатального скрининга, в которой помимо основных пяти наследственных болезней обмена (НБО) массовое скринирование проводилось еще на одиннадцать наследственных нарушений метаболизма [32], обнаруживаемых методом тандемной масс-спектрометрии (ТМС). За это время тестирование на генетические заболевания обмена веществ прошли более 150 тыс. новорожденных, выявлено 9 больных по 7 различным нозологиям. Таким образом, суммарная частота выявления патологии по 16 наследственным заболеваниям в популяции Свердловской области составила 1 случай на 1130 детей, рожденных живыми (при среднем общероссийском показателе 1 больной ребенок на 1000) [27].
С 2015 г. массовый скрининг на НБО в Свердловской области заменен на селективный. Согласно протоколу проведения обследования детей на НБО, тестированию методом тандемной масс-спектрометрии подлежат «дети отделений патологии новорожденных, палат интенсивной терапии и реанимационных отделений, по показаниям – дети инфекционных, гастроэнтерологических, неврологических, педиатрических, эндокринологических отделений» [28]. Непродолжительное время массового обследования, а также финансовые трудности, приводящие к периодическим остановкам реализации программы систематического скринирования новорожденных, не позволили сделать научно обоснованных выводов о частоте распространения отдельных форм НБО в популяции. Однако полученный опыт проведения расширенного неонатального скрининга способствовал пониманию того, что на современном этапе массовое скринирование новорожденных только на пять заболеваний не отвечает требованиям, предъявляемым мировым сообществом к программе неонатального скрининга. Оставаться на достигнутом уровне применения политики скринирования населения на генетическую патологию означает неминуемую остановку в развитии всей системы национального здравоохранения. Сегодняшние успехи в развитии лабораторных диагностических технологий и активное внедрение в медицинскую практику достижений генетики и молекулярной биологии позволяют говорить о возможности расширения спектра скринируемых врожденных и наследственных заболеваний в России.
На сегодняшний день имеется несколько заболеваний, рассматриваемых в качестве кандидатов для включения в российскую программу скрининга новорожденных. Три из них относятся к наследственным болезням обмена веществ, выявляемых с помощью метода ТМС: недостаточность биотинидазы (BTD), дефицит средне- и длинноцепочечной ацетил-коэнзим A-дегидрогеназ (MCAD, LCHAD), и четвертый кандидат из группы первичных иммунодефицитов – тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД или ТКИН). Все упомянутые заболевания присутствуют в программах неонатального скрининга ряда стран [13, 235], в некоторых государствах вопрос о необходимости их включения в программу неонатального скрининга находится в стадии рассмотрения [155, 235].
Однако в настоящее время ни одна из трех наследственных болезней обмена, рассматриваемых в качестве кандидатов на включение в список обязательного скринирования в России, не имеет доказательной базы в виде научных или пилотных исследований с указанием предполагаемых частот и четкими пояснениями необходимости проведения тестирования российского населения на данное заболевание. Согласно полученным суммарным результатам скрининга (как массового, так и селективного), распространенность заболеваний с дефектами митохондриального -окисления (MCAD, LCHAD) является достаточно низкой среди популяции Свердловской области, что совпадает с общероссийскими данными (частота дефицита среднецепочечной ацетил-коэнзим А-дегидрогеназы оценивается как 1:58 000, длинноцепочечной ацетил-коэнзим А-дегидрогеназы – 1:280 000 [1, 8, 42]. Предполагаемая частота третьего кандидата – недостаточности биотинидазы – составляет 1:35-40 тыс. новорожденных [253, 254], однако в РФ до сих пор не зарегистрирован биотин – основное лекарственное средство для лечения дефицита биотинидазы. Это ставит под сомнение целесообразность включения данной нозологии в национальную программу неонатального скрининга в ближайшее время, поскольку необходимо понимать, что диагностическая процедура – это только первый этап программы неонатального скрининга – полномасштабной системы мероприятий, включающей в себя, помимо диагностики, обязательное генетическое консультирование семьи, дополнительные лабораторные или клинические исследования для подтверждения (исключения) диагноза, обеспечение больного ребенка лекарственными препаратами, постоянное мониторирование его состояния и т.п. [9, 13, 31].
ТКИН – четвертый кандидат на включение в государственную программу массового обследования новорожденных России. Самое серьезное и тяжелое заболевание из группы первичных иммунодефицитов полностью соответствует критериям, разработанным Вилсоном (J. Wilson) и Джангнером (Y. Jangner) и усовершенствованным далее Европейским обществом медицинских генетиков [178, 204, 252]. Это первое исследование в практике неонатального скрининга, основанное на анализе ДНК ребенка, которое включено в 2010 году в качестве теста для массового обследования новорожденных на тяжелый комбинированный иммунодефицит в штате Висконсин (США) [163].
Определение TREC и KREC методом количественной ПЦР в режиме реального времени
Еще одна группа иммунодефицитных состояний, характеризующихся развитием Т-клеточной лимфопении вторичного происхождения, может быть выявлена тестированием на TREC. Дети с кишечной лимфангиэктазией, водянкой, гастрошизисом, хилотораксом также попадут в группу риска по ТКИН вследствие низких TREC [137]. Кроме того, дети матерей, получающих иммунодепрессанты в качестве лекарственного средства по поводу аутоиммунных заболеваний во время беременности могут демонстрировать приобретенную Т-клеточную лимфопению вследствие трансплацентарного переноса глюкокортикоидов к плоду, в связи с чем материнский анамнез приобретает первостепенное значение для ребенка с позитивным результатом скрининга на ТКИН и другие формы первичных иммунодефицитов [67, 90, 194, 207].
Необходимо заметить, что в последнее время углубленное исследование феномена абсолютной лимфопении при патологии неонатального периода становится одним из самых настораживающих и востребованных направлений диагностического процесса в неонатологии. Уже доказано, что развитие стойкой лимфопении, как проявление иммунной недостаточности у детей в отделениях реанимации и интенсивной терапии новорожденных, является неблагоприятным прогностическим признаком и свидетельствует о высоком риске летального исхода [10]. Поэтому не подлежит сомнению тот факт, что определение истинной причины абсолютной лимфопении у таких маленьких пациентов, когда необходимо определить, обусловлена ли она генетическими нарушениями или является следствием вторичной инволюции органов иммунной системы, явилось бы позитивным шагом в изучении возможных механизмов развития данного феномена и разработке способов его коррекции. Именно это знание и может дать количественная оценка уровня маркеров лимфоцитарного неогенеза - TREC и KREC - в сухом пятне крови каждого новорожденного. И главное, как уже было отмечено, это может быть выявлено еще до начала клинических проявлений заболевания.
Преждевременные роды также являются одной из самых значимых проблем современного здравоохранения [4, 46, 202]. В развитых странах уровень недоношенных составляет от 5-ти до 18 % всех новорожденных с тенденцией к росту [44]. В Свердловской области количество преждевременных родов также растет: за 5 лет (2010 – 2014) количество детей, родившихся при сроке гестации до 37 недель, увеличилось с 5,9% до 7,2% [16]. Известно, что такие дети в большей мере подвержены различным сердечнососудистым, неврологическим, метаболическим и желудочно-кишечным заболеваниям, а также имеют повышенную восприимчивость к инфекциям органов дыхания и мочевыводящих путей [4, 66, 86, 89, 138, 249]. Хотя многие из этих факторов риска действительно связаны с преждевременными родами, некоторые случаи тяжелой патологии новорожденных не могут быть объяснены только физиологической незрелостью жизненно важных органов и систем. В этом контексте, незрелость иммунной системы как временный фактор, обусловленный гестационным возрастом, трудноотделим от специфических факторов, связанных с состоянием здоровья недоношенных новорожденных. Эти факторы могут включать в себя врожденные аномалии, инфекционные, эндокринологические осложнения и нарушения обмена веществ, которые также могут приводить к нарушениям функции тимуса и, как следствие, к снижению числа тимических мигрантов в периферической крови [65, 157]. Кроме того, в дополнение к незрелости иммунной системы, недоношенные дети подвергаются повышенному риску развития рецидивирующих бактериальных инфекций в течение первых недель жизни из-за частого назначения инвазивных процедур, таких как катетеризация сосудов, парентеральное питание или искусственная вентиляции легких [121, 202, 213]. Поэтому крайне важно найти алгоритм уточнения дефектных механизмов, лежащих в основе иммунных реакций у новорожденных, который будет способствовать раннему распознаванию пациентов с врожденными иммуннодефицитами. Повышенная частота аномальных результатов количества TREC у недоношенных новорожденных отмечается во многих исследованиях [159, 162, 209], однако данные о диапазоне значений KREC в этой группе представлены в литературе весьма незначительно [73, 90].
Низкое количество Т-клеток является общим признаком многих заболеваний из группы ПИД. Тем не менее, существует целый ряд состояний, характеризующихся нарушением функции Т-лимфоцитов, которые не могут быть идентифицированы методом определения TREC [140, 161]. Так, некоторые гипоморфные дефекты в генах, ассоциированных с ТКИН, не оказывают влияние на пролиферацию тимоцитов, оставляя количество TREC в пределах нормального диапазона значений. У некоторых детей с ТКИН, вызванной дефектом в гене аденозиндезаминазы (ADA), фетальные Т-клетки надежно защищены от промежуточных пуриновых метаболитов с помощью механизма материнской детоксикации, что приводит к нормальному уровню TREC при рождении. Однако эта защита ослабевает со временем, количество TREC и наивных Т-клеток начинает стремительно сокращаться, что проявляется замедленным или поздним началом ADA-ТКИН у пациента [93].
Раннее скринирование на TREC не способно выявить ПИД, при котором TREC и Т-клетки присутствуют в достаточном количестве, однако функции клеток нарушены по причине генетических дефектов, случившихся после процесса V(D)J-реаранжировки генов в тимусе (дефицит ZAP-70, недостаточность лиганда CD40) [140, 161]. Кроме того, ПИД из группы заболеваний с дефектами гуморальных параметров иммунитета или с нарушением функций нейтрофилов, также не будет обнаружен TREC-тестированием.
Определение уровней TREC и KREC в сухих пятнах крови новорожденных с разной степенью недоношенности
Основываясь на данном наблюдении, можно констатировать, что определение количества KREC в сухом пятне крови новорожденного старше 28 недель гестации в пределах нормативных значений служит показателем адекватного (правильного) прохождения процесса созревания В-клеток в костном мозге и не требует взятия повторного образца для исследования данного маркера по достижении ребенком «возраста доношенности» (37 недель гестации).
Однако, поскольку в рассматриваемой методике скринирования новорожденных на ТКИН используется мультиплексное, т.е. одновременное исследование сразу двух маркеров (TREC и KREC), оптимальный срок выполнения данного тестирования определяется маркером, для которого свойственно более позднее появление в системе кровообращения плода. В данном случае таковым является TREC, поэтому, по нашим данным, при взятии образца крови для анализа на ТКИН у недоношенного ребенка, необходимо учитывать его гестационный возраст при рождении и выполнять исследование не ранее возраста, соответствующего 37-ми неделям гестации. В противном случае, при тестировании недоношенного ребенка в возрасте до 37 недель и получении результата с количеством TREC или KREC ниже нормативных значений, запрос о взятии ретестового образца у данного пациента в более поздний срок является обязательным, поскольку гарантирует получение наиболее информативных данных о состоянии иммунной системы ребенка. При этом необходимо отметить, что подобные случаи низких значений TREC у данной категории детей все же будут оказывать негативное воздействие на технологию скрининга, увеличивая количество ложноположительных результатов.
Особого внимания в этом контексте заслуживают недоношенные новорожденные, у которых будет обнаружено полное отсутствие маркеров TREC и (или) KREC в образце крови при нормальном количестве копий контрольного гена. Такие пациенты, независимо от степени недоношенности, в незамедлительном порядке должны быть направлены на консультацию иммунолога для проведения лабораторно-диагностических исследований по соответствующей программе углубленного иммунологического обследования (УЗИ тимуса, иммунофенотипирование лимфоцитов, измерение параметров фагоцитоза и др.).
Клинический пример №1 (пациент В.). Девочка В., гестационный возраст 25-26 недель, масса тела при рождении 650 г, длина 27 см, родилась в тяжелом состоянии. С рождения находилась на искусственной вентиляции легких (ИВЛ), энтеральное питание не усваивала, мекониальные массы скудные. На 8-е сутки жизни переведена из роддома в отделение реанимации и интенсивной терапии. На 14-е сутки – прооперирована по поводу некротизирующего энтероколита. Девочке проведена лапаротомия, двойная илеостомия, санация брюшной полости. Послеоперационный период осложнился нестабильностью гемодинамики и анемией тяжелой степени (Hb – 105,0 г/л, er – 3,1 1012/л). К возрасту 3-х недель состояние девочки оставалось крайне тяжелым за счет синдрома полиорганной недостаточности (СПОН): дыхательной, сердечнососудистой, церебральной на фоне течения инфекционного процесса, глубокой недоношенности, иммунодефицита. Клинический диагноз: Ранний неонатальный сепсис; некротизирующий энтероколит новорожденного (2Б стадия), обтурационно-инфильтративная форма; острый перитонит; перинатальное поражение центральной нервной системы гипоксически-геморрагического генеза тяжелой степени; внутрижелудочковое кровоизлияние 3-ей степени с обеих сторон.
На четвертой неделе жизни развились осложнения в виде перфорации подвздошной кишки, разлитого гнойного перитонита, постгеморрагической окклюзионной тривентрикулярной гидроцефалии, СПОН, анемии тяжелой степени смешанного генеза.
В общем анализе крови (ОАК) – нейтрофиллез со сдвигом влево, моноцитоз, лимфопения (0,82 109/л), в иммунограмме снижено количество Т-клеток (CD3+ – 0,63 109/л; [2,28 – 6,45 109/л]), повышено количество натуральных киллеров, концентрация сывороточных иммуноглобулинов класса A и G резко снижена (0,0 и 0,7 г/л соответственно). Результат ультразвукового сканирования тимуса: масса железы меньше возрастной нормы (1,1 г [1,4-3,1 г]-по таблице Поттера), отмечаются диффузные изменения паренхимы органа. Учитывая течение инфекционного процесса, лимфопению, гипоплазию тимуса, назначено определение маркеров первичных иммунодефицитов TREC и KREC.
Из архива лаборатории неонатального скрининга КДЦ «ОЗМР» был извлечен тест-бланк с нанесенными сухими пятнами крови новорожденной В., взятой на 7-е сутки жизни. Заключение лаборатории на основании количественной оценки маркеров Т-клеточного и В-клеточного неогенеза: уровень KREC в пределах нормативных значений (142 копии на 10000 лейкоцитов) и неопределяемый уровень TREC при валидном значении копий контрольного гена; предположительный иммунофенотип ребенка – T-B+NK+. Таким образом, впервые в практике ведения ребенка с глубокой степенью недоношенности диагноз тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИД) был поставлен прижизненно.
На фоне прогрессирования синдрома полиорганной недостаточности (СПОН) смерть ребенка наступила на 23-и сутки жизни. При патологоанатомическом исследовании основной причиной смерти определена тяжелая комбинированная иммунная недостаточность, непосредственной – сепсис. Следует обратить внимание на тот факт, что оперативные роды в такой ранний срок гестации (25-26 недель) были обусловлены развитием у матери тяжелой преэклампсии. К сожалению, в предоставленных документах отсутствует какая-либо информация о течении предыдущей беременности (данная беременность – вторая), об анамнезе матери и других членов семьи, о состоянии их здоровья. Эти данные позволили бы ответить на вопрос о генезе иммунодефицита, на фоне которого развернулась клиническая картина, неизбежно приведшая к летальному исходу, непредотвратимому в отсутствие проведения радикальных мероприятий. Первичный тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД), в пользу которого свидетельствовали врожденная гипопластическая дисплазия тимуса, анемия, лимфопения, лимфоидное опустошение периферических органов иммунной системы – лимфатических узлов и лимфоидного аппарата кишечника – привел к неизбежному развитию генерализованного септического процесса у новорожденной и очень быстрому прогрессированию патологии с развитием полиорганных необратимых изменений на фоне неэффективности проводимых терапевтических мероприятий.
Указанный алгоритм диагностики (определение TREC и KREC в сухом пятне крови, взятой для неонатального скрининга, иммунофенотипирование лимфоцитов, УЗИ тимуса) может быть предложен в качестве условия для повышения уровня дифференциальной диагностики патологии у недоношенного ребенка с тяжелой лимфопенией и прогрессированием воспалительного процесса, в большинстве случаев обусловленного не столько инфекционной природой, сколько репаративными нарушениями, связанными с генетическим дефектом.
В представленном случае постановка ребенку корректного диагноза имела положительное значение для семьи, поскольку знание о семейном случае ТКИН позволит вести следующую беременность женщины В. с обязательным назначением медико-генетического консультирования и наблюдением у иммунолога. 3.3 Сравнительный анализ уровней TREC и KREC в группах условно здоровых детей и детей с иммунозависимой патологией на первом году жизни
С целью получения данных, способствующих оценке информативной и прогностической значимости определения TREC и KREC в сухих пятнах крови новорожденных с помощью тест-системы российского производства «Т&В Test», был проведен сравнительный анализ количества данных маркеров у новорожденных детей двух групп.
Фенотипические особенности детей с дебютом иммунозависимой патологии на первом году жизни
Согласно многочисленным зарубежным публикациям, количественная оценка уровней TREC позволяет выявить не только больных с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИН), но и другие первичные иммунодефицитные состояния, в частности, синдром делеции 22-ой хромосомы, более известный как синдром Ди Джорджи (Di George syndrome (DGS), del22q11.2 [137, 142, 156, 165].
В наше исследование была включена группа детей с врожденными пороками развития (n=10). Из них шесть пациентов имели верифицированный диагноз микроделеции 22-ой хромосомы (синдром Ди Джорджи), четыре ребенка с врожденным пороком сердца были без данной генетической патологии. Для троих детей с DGS генетическая верификация диагноза была выполнена на первом месяце жизни, в одном случае – на втором месяце, еще двоим диагноз был подтвержден на четвертом году жизни.
Мы провели количественную оценку уровней маркеров Т-клеточного и В клеточного неогенеза (TREC и KREC) в сухих пятнах крови, взятых у данных детей на фильтровальные карточки для неонатального скрининга (ретроспективно). У всех детей из исследуемой группы количество KREC оставалось в рамках нормативных значений. Уровни TREC ниже нормативных значений, определенных в контрольной группе, были обнаружены у 4-х новорожденных (66,7%), которым впоследствии был диагностирован синдром микроделеции 22q11.2.
Согласно проведенным в штатах Калифорния и Висконсин (США) исследованиям, неонатальный скрининг на тяжелые комбинированные иммунодефициты методом определения TREC способен выявить от 5% до 10% пациентов с синдромом del22q11.2 [160, 162, 163]. Эти данные были рассчитаны, исходя из частоты встречаемости микроделеции 22q11.2 в исследуемой популяции один случай на 5 000 новорожденных, что не может быть сравнимо с нашей выборкой. Кроме этого, как отмечают авторы, для идентификации новорожденных с синдромом Ди Джорджи имеют значение особенности алгоритма проводимых скрининговых исследований и пороговый уровень, применяемый в лаборатории.
Полученные нами результаты получены в несравнимо меньшей выборке пациентов с синдромом делеции 22q11.2, тем не менее, они также подтверждают тот факт, что низкие значения TREC не обязательно будут обнаруживаться у всех пациентов с синдромом Ди Джорджи, поскольку данная категория детей отличается разной степенью гипоплазии тимуса и проявлениями иммунодефицита. Среди описываемых нами детей с синдромом Ди Джорджи и аномальными значениями TREC у двоих пациентов не было отмечено выраженных проявлений иммунозависимой патологии на период обследования. Первый ребенок был направлен на консультацию к иммунологу во время подготовки к плановой кардиологической операции и в связи с отсутствием тимуса при УЗ-сканировании грудной клетки, родители второго ребенка обратились за медико-генетическим консультированием по поводу задержки психо-речевого развития мальчика и наличия аутистикоподобных проявлений.
Несмотря на то, что данные дети не нуждались в незамедлительных иммунокорригирующих мероприятиях на момент постановки диагноза, тем не менее, наши находки подтвердили наличие у них Т-клеточной лимфопении, проявлявшейся случаями рекуррентных ОРВИ в анамнезе. Это согласуется с данными других исследователей, описывающих связь между Т-лимфопенией и частыми вирусными оппортунистическими инфекциями у детей с синдромом del22q11.2 [43, 142, 156, 225, 227]. 110 Учитывая, что манифестация наследственной патологии и появление клинических симптомов болезни может происходить в течение нескольких лет, а при рождении ребенок с синдромом Ди Джорджи часто имеет только порок развития сердечнососудистой системы, использование всего арсенала диагностических технологий для постановки точного диагноза является первоочередной задачей, особенно при наличии дисморфий и/или аномалий других органов и систем [148, 179, 180, 239, 243]. Кроме того, выявление хромосомных нарушений, в том числе и на микроструктурном уровне, обосновывает необходимость проведения мероприятий эффективной профилактики – пренатальной и предимплантационной диагностики в семьях с отягощенным анамнезом. Следовательно, можно резюмировать, что ранняя настороженность медицинских работников первичного звена в отношении новорожденных с низкими значениями TREC позволит своевременно направить детей из группы риска по ПИД на углубленное иммунологическое и генетическое обследование. Это поможет не только избежать вакцинации препаратами живых инфекционных агентов и предупредить развитие БЦЖ-итов, нередко приводящих к летальному исходу у данной категории детей, но и оценить риск развития у каждого из них тяжелых вирусных инфекций в неонатальном периоде, а также вероятность возникновения крайне опасных осложнений при трансфузии препаратов крови или осложнений послеоперационного периода, связанных с нарушениями репарации при первичных иммунодефицитах.
В настоящее ретроспективное исследование были включены дети (n=40, из них 19 мальчиков и 21 девочка), умершие на первом году жизни в возрасте от 5 суток до 10 месяцев жизни за период 2012 – 2015 гг на территории Свердловской области. В исследование были включены дети с врожденными пороками развития (n=12), острыми вирусными инфекциями (n=13), генерализованной инфекцией (n=9), и другими инфекционными заболеваниями, такими как пневмония, энтероколит, менингоэнцефалит (n=6).
Сопоставление количества копий T- и В-клеточных эксцизионных колец, полученных в образцах крови исследованных детей, показало, что у половины пациентов (n=20) содержание TREC и KREC оказалось значительно ниже минимального значения, определенного для контрольной группы. При этом шесть детей имели сниженными сразу оба показателя, у 14-ти детей были низкими только значения TREC, уровни KREC оставались в пределах нормативных значений.
При сравнительном ретроспективном анализе анамнестических данных, результатов клинических и лабораторных исследований детей с низкими значениями маркеров Т- и В-клеточного неогенеза, было выяснено, что все дети родились доношенными, на 37-40 неделе гестации, с массой тела от 1885 до 3648 граммов.
Дебют клинической манифестации заболеваний охватывал период от нескольких дней до 10 месяцев, и в 65% случаев (13/20) приходился на первые 3 месяца жизни.
Семь детей из группы с низкими значениями TREC и KREC имели множественные врожденные пороки развития (МВПР). Из них пороки сердечнососудистой системы наблюдались в 6-ти случаях (ВПС), пороки внутренних органов – 4 случая (гастрошизис – 1, пороки развития кишечника с формированием кишечной непроходимости – 1, пороки развития почек и мочевыводящих путей – 2), лицевой дисморфизм – один случай, трисомия по 21-й хромосоме (синдром Дауна) – 1 случай, моносомия по Х-хромосоме (синдром Тернера) – 1 случай. Матери двоих детей были ВИЧ-инфицированы.