Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Иммунологические аспекты хронических воспалительных заболеваний суставов у детей (обзор литературы) 14
1.1. Характеристика вариантов течения ювенильного идиопатического артрита и реактивной артропатии 14
1.2. Особенности этиологии и патогенеза ювенильного идиопатического артрита и реактивных артропатий у детей 16
1.3. Аутоантитела в диагностике ювенильного идиопатического артрита и неуточненной реактивной артропатии 21
1.4. Цитокины в диагностике ювенильного идиопатического артрита и неуточненной реактивной артропатии 30
Глава 2. Материалы и методы исследований 40
2.1. Характеристика исследованных групп 40
2.2. Лабораторные методы 44
2.3. Методы математической обработки полученных данных 48
Глава 3. Аутоантитела при ювенильном идиопатическом артрите и неуточненной реактивной артропатии у детей 49
3.1. Оценка частоты выявления антител к цитруллинированным пептидам 50
3.2. Оценка частоты выявления антинуклеарных антител 52
Глава 4. Цитокиновый профиль при ювенильном идиопатическом артрите и неуточненной реактивной артропатии у детей 59
4.1. Исследование спонтанной и стимулированной продукции провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-8, IL-17, TNF-, IFN- 60
4.2. Исследование спонтанной и стимулированной продукции противоспалительных цитокинов IL-1rа, IL-4, IL-10, TGF- 65
4.3. Концентрация цитокинов в супернатантах клеток периферической крови у больных с ЮИА в зависимости от наличия антител к модифицированному цитруллинированному виментину и антинуклеарного фактора 70
4.4. Сравнение уровня цитокинов IL-1, IL-8, TNF-, IFN-, IL-1rа и IL-10 в сыворотке крови и супернатантах культур клеток крови 70
Заключение 78
Выводы 90
Практические рекомендации 92
Список принятых сокращений 93
Список литературы 94
- Особенности этиологии и патогенеза ювенильного идиопатического артрита и реактивных артропатий у детей
- Цитокины в диагностике ювенильного идиопатического артрита и неуточненной реактивной артропатии
- Оценка частоты выявления антинуклеарных антител
- Сравнение уровня цитокинов IL-1, IL-8, TNF-, IFN-, IL-1rа и IL-10 в сыворотке крови и супернатантах культур клеток крови
Особенности этиологии и патогенеза ювенильного идиопатического артрита и реактивных артропатий у детей
К настоящему времени причины развития ювенильного идиопатического артрита во многом остаются не ясными. Известно, что механизмы развития разных вариантов течения ЮИА различаются [7, 72, 93]. В патогенезе ЮИА ключевую роль играет активация иммунной системы, что проявляется в пролиферации иммунокомпетентных клеток, продукции аутоантител и увеличении синтеза провоспалительных цитокинов [50, 99, 170, 238]. В настоящее время многочисленные исследования позволяют заключить, что в развитии ювенильного идиопатического артрита определнную роль играет генетическая предрасположенность [106, 208, 264] и средовые факторы, среди которых значимую роль имеет инфекция [13, 93, 214]. В пользу наследственной предрасположенности в развитии ЮИА свидетельствует выявление семейных случаев заболевания. Известно, что дети с ЮИА чаще имеют родственников, страдающих различными ревматическими заболеваниями, чем здоровые субъекты [74, 242].
Считается, что некоторые молекулярные структуры системы HLA (лейкоцитарные антигены человека) могут принимать участие в презентации «артритогенного антигена» как фактора индукции хронического воспалительного процесса [7, 118, 133, 140, 208, 263]. Существуют данные об ассоциации антигенов гистосовместимости системы HLA с различными вариантами ЮИА [32, 93, 140]. Так, HLA-A2, DRB1-08, DRB1-11, HLA-DR5, HLA-DR8 ассоциированы с развитием в раннем детском возрасте олигоартикулярного варианта ЮИА, антигены HLA-DW4, HLA-DR1, HLADR4 – с развитием полиартикулярного варианта [32, 58]. Обнаружена связь артрита, ассоциированного с энтезитом, с антигеном HLA-B27, который с высокой частотой обнаруживается у детей с данной формой ЮИА и является маркером риска развития ЮАаЭ у мальчиков школьного или подросткового возраста [58, 140].
Мутации генов цитокинов в большинстве случаев могут приводить к снижению функциональной активности цитокинов, нарушению регуляторных взаимодействий в цитокиновой сети и возникновению аутоиммунных, аутовоспалительных и лимфопролиферативных заболеваний [31]. В настоящее время имеется большое число работ, посвященных исследованию функционального полиморфизма генов цитокинов, который характеризуется заменами единичных нуклеотидов, что обуславливает количественные изменения функционирования соответствующих генов [31]. Известно, что эти изменения могут играть роль в развитии различных заболеваний, в том числе ревматоидного артрита у взрослых [16] и ювенильного идиопатического артрита у детей [80, 132, 161]. Так, по данным разных авторов полиморфные аллели IL-10 -1082 G/A [132], TNF-a 238 A/G [161], IL-1ra -889 C/T [265], IL-6 -174 GG [266] у больных с ЮИА встречаются чаще, чем у здоровых детей.
Влияние средовых факторов, таких как, курение женщин во время беременности, агрессивная экологическая среда, могут увеличивать риск развития, как аутоиммунных заболеваний в целом, так и ЮИА [7, 119, 140]. Обсуждается «гигиеническая гипотеза» формирования различных аутоиммунных заболеваний. Согласно данной гипотезе, причиной развития болезней аутоиммунной природы является снижение микробной антигенной нагрузки на организм ребенка в связи с улучшением жизненных условий. В последние десятилетия среди населения развитых стран отмечается снижение заболеваемости различными инфекционными заболеваниями с более редкими переходами в эпидемии [113]. Уменьшение контакта иммунной системы с вирусными и бактериальными антигенами увеличивает вероятность ее направленности на элиминацию антигенов собственных тканей с развитием воспалительной реакции [113, 186]. Недостаток инсоляции и витамина D может также являться причиной развития аутоиммунных заболеваний, в том числе ЮИА у детей [109, 117]. В обзорной статье Е.А. Потроховой, посвященной анализу уровня витамина D при различных заболеваниях аутоиммунного генеза, показана ассоциация недостаточности витамина D с развитием таких аутоиммунных заболеваний, как рассеянный склероз, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, системная склеродермия, сахарный диабет 1 типа [52].
В развитии ЮИА, в качестве провоцирующих факторов, могут выступать различные инфекционные (вирусные и бактериальные) возбудители [50, 55, 140]. Например, у пациентов с ЮИА наблюдается более высокая частота инфицирования Mycoplasma pneumonia [191], Streptococcus [92], Parvovirus B19 [192], Epstein-Barr virus [172], чем у детей без суставной патологии. Есть предположение, что инфекционные агенты могут способствовать презентации аутоантигенов и играют роль в инициации воспалительных реакций, что в дальнейшем может привести к аутоагрессии [90, 113, 172]. Считается, что сходство аутоантигенов и антигенов некоторых микроорганизмов (молекулярная мимикрия) является одной из причин развития аутоиммунной реакции [113].
Вне зависимости от причин развития ювенильного идиопатического артрита, центральную роль в формировании всех вариантов ЮИА играют потеря иммунологической толерантности к собственным органам и тканям, гиперпродукция провоспалительных цитокинов и хемокинов активированными клетками иммунной системы и развитие хронического воспаления [7, 166]. Активация иммунокомпетентных клеток приводит к инфильтрации синовиальной ткани различными типами клеток: лимфоцитами, плазматическими клетками, моноцитами, нейтрофилами, которые вызывают формирование паннуса [50]. Синтезируемые активированными клетками цитокины усиливают остеокласт-опосредованную резорбцию хрящевой и костной ткани, способствуют гибели остеобластов и ингибированию продукции коллагена. Под воздействием цитокинов активизируется хемотаксис лейкоцитов, происходит пролиферация остеокластов и синовиоцитов, усиливается синтез металлопротеиназ, особенно коллагеназ и стромелезина, играющих роль в разрушении хрящевой и костной ткани [50].
В отличие от ювенильного идиопатического артрита, при реактивных артропатиях в большинстве случаев существует четкая хронологическая связь с острой или персистирующей инфекцией различной этиологии [5, 26, 50, 162]. По этиологическому фактору реактивные артропатии разделяют на две группы: постэнтероколитические и урогенитальные [54]. Среди кишечных патогенов значимыми являются Yersinia enterocolitica Salmonella, Shigella flexneri, Campylobacter jejuni. Ведущими возбудителями урогенитальных инфекций являются Сhlamidia trachomatis, а также Mycoplasma и Ureaplasma [26, 50, 54]. Вирусные артриты имеют хронологическую связь с предшествующей инфекцией, вызванной вирусами краснухи, гепатита В, герпес-вирусами различного типа, энтеровирусами, аденовирусами [50]. Длительная персистенция инфекционного агента приводит к иммунному ответу, как на специфический микроорганизм, так и на собственные измененные тканевые антигены, что может быть причиной активации цитотоксических Т-лимфоцитов [14, 35, 50]. Происходит инфильтрация синовиальной оболочки активированными иммунокомпетентными клетками, которые стимулируют остеокласты, принимающие участие в деструкции хрящевой и костной ткани [2]. Имеются свидетельства, что в основе развития воспаления в суставах при реактивных артропатиях, в том числе, лежит дисбаланс продукции цитокинов, с преобладанием синтеза клетками иммунной системы цитокинов провоспалительной направленности [14, 225].
По мнению некоторых исследователей, особое место в этиопатогенезе реактивных артропатий занимает кишечный микробиом [218, 258].
Гиперколонизация бактерий (состояние дисбиоза) в микробиоме, в том числе, может играть роль в развитии реактивного артрита и поддержании воспалительного процесса [218]. При дисбиозе кишечника увеличивается проницаемость кишечной стенки для микроорганизмов, происходит стимуляция транслокации их молекулярных компонентов и клеток иммунной системы в суставы, что приводит к развитию и усилению воспалительной реакции при реактивных артропатиях [218].
О значении генетических факторов в развитии реактивных артропатий свидетельствует ассоциация РеА с антигеном гистосовместимости - HLA-B27, который выявляется в 50-90% случаев при урогенных и постэнтероколитических артритах [5, 50, 226]. Показано сходство аминокислотных последовательностей бактерий и HLA-B27 [12, 26]. Считается, что этот антиген может связывать отдельные пептиды микробного или собственного происхождения и затем презентировать их иммунокомпетентным клеткам [12, 26, 151]. Согласно теории микробной мимикрии, у различных микроорганизмов и HLA–B27 имеются сходные антигенные детерминанты, в результате иммунный ответ может быть направлен, как против инфекционного агента, так и против антигенов собственных тканей, оказывая на них повреждающее воздействие [35]. Однако при неуточненной реактивной артропатии (нРеА) отсутствует хронологическая связь с инфекционным процессом и лабораторное подтверждение артритогенной инфекции [50].
Цитокины в диагностике ювенильного идиопатического артрита и неуточненной реактивной артропатии
По современным представлениям, в основе патогенеза ювенильного идиопатического артрита, в том числе, лежит дисбаланс между продукцией провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (ЦК) с преобладанием синтеза первых над вторыми, что является причиной хронического воспаления суставов [50, 139, 141, 205]. Цитокины представляют собой низкомолекулярные белки, обладающие выраженной биологической активностью, участвующие в регуляции процессов гемопоэза, воспаления, пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток, реализации их эффекторных функций. Цитокины и соответствующие им рецепторы синтезируются клетками различных тканей, основными их продуцентами являются клетки иммунной системы, соединительной ткани, эпителия, эндотелия [3, 65]. По механизму действия в условиях воспаления цитокины разделяют на провоспалительные (инициирующие воспалительную реакцию) и противовоспалительные (подавляющие воспаление).
К основным провоспалительным цитокинам, играющим роль в патогенезе воспалительных заболеваний суставов относятся IL-1, IL-6, IL-8, TNF-, IL-17, INF- [50]. В ответ на воздействие экзогенных или эндогенных факторов происходит активация синтеза провоспалительных цитокинов, усиливающих остеокласт-опосредованную резорбцию хрящевой и костной ткани, способствующих гибели остеобластов и ингибированию синтеза коллагена. Под воздействием цитокинов происходит пролиферация синовиоцитов, остеокластов, усиливается синтез коллагеназы, стромелизина, активизируется хемотаксис лейкоцитов [50]. IL-1 – один из важнейших медиаторов воспаления. Его продукция осуществляется макрофагами, синовиоцитами, хондроцитами и остеокластами. Этот ЦК стимулирует выход нейтрофилов из костного мозга, рост и дифференцировку лимфоцитов, активирует макрофаги. В свою очередь, IL-1 способен индуцировать синтез многих цитокинов, хемокинов, матриксных металлопротеиназ и других ферментов, способствующих разрушению хряща и костной ткани [3]. Имеются работы, в которых показано, что у пациентов с ЮИА отмечается значительное увеличение концентрации IL-1 в сыворотке крови и синовиальной жидкости, что коррелирует с активностью заболевания [259, 237].
TNF- вырабатывается преимущественно активированными Т лимфоцитами, моноцитами и макрофагами, фибробластами, эндотелиальными и эпителиальными клетками [3]. Основными патогенетическими эффектами TNF- при воспалительных заболеваниях суставов является увеличение продукции фактора дифференцировки остеокластов, отвечающего за резорбцию костной ткани, индукция синтеза коллагеназы и металлопротеиназ [42]. На моделях in vitro показано, что TNF- является индуктором продукции других провоспалительных цитокинов, включая IL-1, IL-6, IL-8 [20]. Рядом авторов выявлено повышение концентрации TNF- в синовиальной жидкости и в сыворотке крови у детей с ЮИА [124, 202].
IL-6 является гликопротеином, который синтезируется лимфоцитами, моноцитами, нейтрофилами, эндотелиальными клетками, синовиальными фибробластами и макрофагами. Этот цитокин активизирует продукцию острофазовых белков, хемокинов, выработку антител В-лимфоцитами, может вызывать пролиферацию синовиальных фибробластов и активировать остеокласты [3]. IL-6 принимает участие в развитии околосуставного остеопороза и суставной деструкции через влияние на дифференцировку остеокластов и увеличение активности различных ферментов [3]. В исследованиях ряда авторов было показано увеличение уровня IL-6 в различных биологических средах (сыворотка крови, синовиальная жидкость, супернатанты клеточных культур) у пациентов с системным вариантом ЮИА, высокие уровни IL-6 коррелировали с клинической активностью заболевания [98, 124, 259].
Синтез IL-8 осуществляется нейтрофилами, моноцитами и макрофагами, лимфоцитами, фибробластами, клетками эпителия и эпидермиса. [3]. Этот ЦК усиливает экспрессию молекул межклеточной адгезии и вызывает активацию и привлечение нейтрофилов к месту воспаления [20, 71]. Роль IL-8 в развитии ЮИА у детей до конца не ясна. Повышенный уровень IL-8 в сыворотке крови у детей с ЮИА был выявлен De Benedetti F. с соавт., высокое содержание этого хемокина коррелировало с активностью заболевания [110]. Этими же авторами показана корреляция концентрации IL-8 в синовиальной жидкости с количеством лейкоцитов и уровнем IL-1 и IL-6 в сыворотке крови. Однако M. Yilmaz с соавт. не выявили разницы по концентрации этого ЦК в сыворотке крови у пациентов с ЮИА и контрольной группой [259].
IL-17 вырабатывается в основном Т-хелперами 17 типа, участвует в развитии ранней стадии воспаления, стимулирует фибробласты и продукцию IL-1, IL-6, IL-8, TNF-, металлопротеиназ [29, 82, 212]. Кроме того, индуцируя выработку оксида азота хондроцитами, IL-17 может непосредственно участвовать в разрушении хрящевой ткани [86]. Известно, что IL-17 играет роль, в том числе, в развитии воспалительного процесса в синовиальной оболочке [97, 104, 103]. На модели коллаген-индуцированного артрита у мышей была выявлена ассоциация высоких уровней IL-17 с развитием эрозивных изменений в костной ткани [184]. Повышенные концентрации IL-17 обнаруживались у пациентов с РА в синовиальной жидкости и сыворотке крови [42]. У детей с ЮИА уровни IL-17 в сыворотке крови также были значительно выше, по сравнению с контрольной группой [237]. Имеются работы, в которых выявлено, что, как у взрослых пациентов с РА [177], так и у больных с ЮИА [250] уровень сывороточного IL-17 коррелирует с клиническими параметрами активности заболевания.
IFN- синтезируется Т-лимфоцитами, преимущественно Т-хелперами 1-го типа, является макрофаг-активирующим фактором, влияет на дифференцировку Т- и В-лимфоцитов, активирует нейтрофилы и натуральные киллеры, усиливает цитотоксические реакции, опосредованные Т-лимфоцитами и натуральными киллерами [3]. Данные о роли IFN- в развитии синовита противоречивы. Внесение этого цитокина в смешанную культуру Т-клеток и моноцитов пациентов с ревматоидным артритом приводило к стимуляции синтеза TNF- [219]. С другой стороны, IFN- способен снижать продукцию IL-1, матриксных металлопротеиназ и пролиферацию синовиоциотов при ревматоидном артрите у взрослых [180].
Наряду с синтезом провоспалительных цитокинов и активацией воспаления при хронических заболеваниях суставов, изменяется продукция противовоспалительных и регуляторных ЦК. Наиболее значимыми противовоспалительными цитокинами являются: рецепторный антагонист интерлейкина 1 (IL-1rа), IL-4, IL-10, трансформирующий фактор роста бета (TGF-) [3]. Противовоспалительные цитокины осуществляют контроль за эффектами провоспалительных цитокинов, они способны подавлять транскрипцию генов провоспалительных цитокинов в клетках-продуцентах, индуцировать синтез рецепторных антагонистов интерлейкинов, усиливать образование растворимых рецепторов и снижать плотность мембранных рецепторов провоспалительных цитокинов [3].
IL-1rа является естественным антагонистом IL-1, он гомологичен IL-1 и IL-1, взаимодействует с теми же рецепторами, что и IL-1, но не вызывает дальнейшего проведения внутриклеточного сигнала [3]. То есть, IL-1rа выступает в качестве ингибитора и является важным физиологическим регулятором эффектов IL-1. IL-1rа продуцируется моноцитами и макрофагами, Т- и В-лимфоцитами, нейтрофилами, фибробластами и эндотелиальными клетками. Значительное количество IL-1rа синтезируют гепатоциты, этот цитокин всегда присутствует в сыворотке крови, для предотвращения негативных последствий системного действия IL-1, вырабатываемого в значительных количествах при остром воспалении [3]. Доказательством противовоспалительного действия IL-1rа служит то, что в опытах на knockout мышах удаление гена IL-1rа приводило к нарушению нормального баланса ЦК семейства IL-1, проявлению действия агонистов и, как следствие, способствовало спонтанному развитию эрозивного артрита. [66].
Оценка частоты выявления антинуклеарных антител
При анализе частоты встречаемости антинуклеарных антител, антинуклеарный фактор (АНФ) обнаруживался при всех вариантах ювенильного идиопатического артрита. Однако, чаще АНФ определялся у детей при олиго- и полиартикулярной формах ЮИА и артрите, ассоциированном с энтезитом (63%, 68% и 60%, соответственно) (таблица 4). Положительные титры АНФ были обнаружены у 38% больных с псориатическим ювенильным артритом, реже всего (в 9% случаев) антинуклеарный фактор выявлялся у детей с системным вариантом ЮИА. Больше, чем одна треть пациентов с неуточненной реактивной артропатией имели титры АНФ выше нормальных значений. В контрольной группе частота встречаемости АНФ составила 18% (таблица 4). На момент обследования у здоровых субъектов отсутствовали признаки аутоиммунных заболеваний.
Гораздо реже антинуклеарные антитела обнаруживались методом ИФА. Частота выявления экстрагируемых нуклеарных антител в группе детей с ЮИА варьировала в зависимости от варианта течения ЮИА (таблица 4). Несколько чаще ЭНА выявлялись у детей с пЮИА и оЮИА (20% и 17%, соответственно). У пациентов с артритом, ассоциированном с энтезитом, положительные уровни ЭНА обнаруживались в 15% случаев, при системном и псориатическом ЮИА выявляемость экстрагируемых нуклеарных антител не превысила 13% (таблица 4). Реже всего ЭНА выявлялись у больных с нРеА, 7,7% больных имели уровни выше нормальных значений. Повышенные концентрации ЭНА были обнаружены у 9% условно здоровых детей (таблица 4). В исследованиях E.B. Nordal и соавт., посвященной одновременному определению ЭНА и АНФ, также обнаружена низкая выявляемость ЭНА у детей с ЮИА – 4%, при этом, частота встречаемости АНФ составила 68% [189]. Соответственно, определение антинуклеарного фактора более информативно для диагностики, как ювенильных артритов в целом, так и для отдельных вариантов ЮИА.
Как уже было сказано в главе 1.3, у взрослых больных для диагностики раннего ревматоидного артрита проводят определение антител к антигену RA-33, выявляемость этих антител у взрослых пациентов достаточно высока [171]. Для оценки частоты выявления анти-RА-33 у детей с хроническими заболеваниями суставов различной этиологии было проведено определение уровня данных антител у больных с ЮИА и нРеА. Анти-RA-33 не определялись ни у одного человека, как у больных с ЮИА, так и у пациентов с неуточненной реактивной артропатией. В одной из немногочисленных работ, посвященных исследованию уровня анти-RA-33 у детей с ЮИА, выявлено, что 66,7% пациентов с ювенильным артритом имели положительный результат по антителам к антигену RA-33, их уровень коррелировал с активностью заболевания и рентгенологическими данными – уровнем резорбции костной ткани [244].
Для оценки ассоциации АНФ с клиническими и рентгенологическими параметрами, больные с ЮИА были разделены на две группы – АНФ-позитивные и АНФ-негативные пациенты. Между группами АНФ-положительных и АНФ-отрицательных больных не выявлено различий по активности и длительности заболевания, количеству пораженных суставов, рентгенологической стадии и функциональному классу (таблица 5).
В единичных публикациях, посвященных анализу взаимосвязи клинических параметров с наличием АНФ, имеются противоречивые сведения. Так, в работе X. Ма с соавт. показано, что у серопозитивных по АНФ пациентов отмечается большее количество пораженных суставов, чаще поражаются тазобедренные, плечевые и лучезапястные суставы, чем у серонегативных по АНФ больных [165]. Однако, в другой работе выявлено, что у АНФ-положительных больных отмечалось меньшее количество пораженных суставов и тазобедренные суставы не были вовлечены в патологический процесс, по сравнению с АНФ-отрицательными пациентами [210].
Среди 139 пациентов с ЮИА, серопозитивных по АНФ, у 6 детей был диагностирован увеит (таблица 5). Четверо из них имели олигоартикулярный, а два пациента – полиартикулярный варианты ЮИА. В большинстве своем у больных наблюдались умеренные титры АНФ: 1/320 (2 человека), 1/640 (2 человека), 1/1280 (2 человека). Необходимо отметить, что у одного ребенка с олигоартикулярным вариантом ЮИА и результатом АНФ ниже диагностического (титр 1/160) также был диагностирован увеит. Все пациенты с увеитом имели отрицательные результаты при определении антител к модифицированному цитруллинированному виментину.
Анализ типов флюоресценции субстрата при определении АНФ в реакции непрямой иммунофлюоресценции показал, что наиболее распространенными типами свечения были гомогенный и гранулярный. При ЮИА выявляемость этих типов флюоресценции в целом составила 73% и 21%, соответственно, от числа АНФ-позитивных пациентов, при нРеА – 70% и 30%, соответственно (таблица 6). Однако, пропорция типов свечения несколько отличалась при разных вариантах ЮИА. Гомогенный тип свечения превалировал во всех группах с ЮИА, кроме ЮАаЭ, у которых гранулярный тип свечения наблюдался несколько чаще, чем гомогенный. Нуклеолярный, цитоплазматический, а также смешанные типы свечения (например, гранулярный в сочетании с цитоплазматическим) у пациентов с заболеваниями суставов встречались в единичных случаях. В группе условно здоровых детей частота встречаемости гомогенного и гранулярного типов флюоресценции составила 40% и 40%, соответственно, другие типы свечения наблюдались у единичных субъектов (таблица 6).
Сравнение уровня цитокинов IL-1, IL-8, TNF-, IFN-, IL-1rа и IL-10 в сыворотке крови и супернатантах культур клеток крови
Как уже говорилось выше, наиболее часто уровень цитокинов определяют в сыворотке или плазме крови (глава 1.4). Однако концентрация ЦК в крови может быть низкой или иметь нулевые значения в связи с коротким временем циркуляции этих белков, присутствием антител к цитокинам и рядом других факторов [63, 70]. Альтернативным подходом является определение уровней цитокинов в супернатантах культур клеток периферической крови (см. главу 1.4), что может давать более стабильные результаты. Для сравнения информативности определения цитокинов в сыворотке крови и в супернатантах клеток цельной крови проведена оценка концентрации IL-1, IL-8, IL-17, TNF-, INF-, IL-1rа и IL-10 внутри двух обследованных групп: пациентов с ювенильным идиопатическим артритом и условно здоровых детей.
При сравнительной оценке содержания цитокинов в сыворотке крови и супернатантах клеток крови в группе условно здоровых детей выявлено, что достоверные различия были обнаружены для IL-1, IL-8 и IL-10, спонтанные уровни которых были выше в культуральной жидкости, по сравнению с сывороткой крови (таблица 13). У пациентов с ювенильным идиопатическим артритом спонтанная концентрация IL-1, IL-8, TNF- и IFN- также была выше в супернатантах клеточных культур, чем в сыворотке (таблица 13). Нулевые медианные концентрации исследованных ЦК в культуральной жидкости наблюдались лишь в трех случаях: IL-17 в группах УЗД и ЮИА, IFN- – у здоровых детей. Тогда как в сыворотке крови нулевые значения выявлены в семи случаях: IL-1, TNF-, IFN- у детей из контрольной группы и ЮИА, IL-10 – у больных с ЮИА (таблица 13). Как уже было показано в главе 4.1, при стимуляции митогеном уровни всех исследованных цитокинов превышали нулевое значение, что значительно облегчает интерпретацию результатов исследований. Отсутствие определимых концентраций IL-1 и TNF- в сыворотке крови практически здоровых детей, выявленное в нашей работе, согласуется с данными авторов, которые также не выявили детектируемых уровней ряда цитокинов в сыворотке крови, включая IL-1 [20, 152, 197] и TNF- [20, 163], как у больных с ЮИА, так и у здоровых лиц.
При сравнении сывороточных концентраций цитокинов между группами с ЮИА и здоровых детей различия обнаружены только по уровню IL-10 и TNF-, который был выше у больных с артритом (таблица 13). В то же время в культуральной жидкости, даже при спонтанном варианте инкубирования, различия выявлены для четырех ЦК - IL-1, IL-8, TNF- и IFN- (таблица 13). Обращает на себя внимание, что концентрация IL-1rа, как в сыворотке крови, так и в супернатантах культур цельной крови, в несколько сотен раз превышала значения других исследуемых цитокинов (таблица 13). В работе G. Kleiner с соавт. также выявлен самый высокий уровень IL-1rа в сыворотке крови среди ряда исследуемых цитокинов (IL-1, IL-5, IL-12, IL-15, IFN-, TNF-) у здоровых детей и взрослых [152]. Этот феномен объясняется тем, что совокупная продукция IL-1rа различными типами клеток крови (моноцитами и нейтрофилами) может давать высокие уровни в культуральной жидкости [66]. Высокие концентрации этого цитокина в сыворотке крови обусловлены его спонтанной выработкой тканевыми макрофагами и гепатоцитами [3]. Следует отметить, что стимулированный уровень IL-1rа в супернатантах культур клеток крови также был больше, чем других цитокинов (глава 4.2).
Значения концентраций IL-8, как в культуральной жидкости, так и в сыворотке крови у обследованных нами детей также характеризовались более высокими уровнями, чем для других исследованных цитокинов. В опубликованных работах разных авторов сообщается о том, что в группе больных с травматической болезнью [23], у взрослых с РА [245], также у здоровых субъектов, спонтанная и стимулированная выработка ИЛ-8 значительно превосходила уровень IL-1, IL-4, IL-10 и IFN- [23, 245]. Одним из объяснений этого феномена является то, что IL-8 продуцируют многие популяции клеток крови: моноциты, лимфоциты и нейтрофилы [31]. Общая продукция IL-8 перечисленными типами клеток может обуславливать наличие высоких концентраций этого цитокина в супернатантах культур цельной крови. Известно, что IL-8 является активатором нейтрофилов, стимулирует их направленное движение в очаг воспаления, усиливает продукцию активных форм кислорода [3].
Таким образом, определение цитокинов в культуральной жидкости после инкубации клеток цельной крови более информативно, чем выявление этих белков в сыворотке крови. Это подтверждается тем, что при исследовании супернатантов клеточных культур между группами больных с ЮИА и здоровых детей различия выявлены для большего количества цитокинов, а нулевые значения этих белков в супернатантах культур клеток крови наблюдались в меньшем проценте случаев.