Содержание к диссертации
Введение
Часть 1. Обзор литературы 9
Глава 1. Фенотипические особенности субпопуляций В-лимфоцитов различной локализации в организме 9
1.1. Фенотип В-1 лимфоцитов 11
1.2. В-1 лимфоциты и IL-10 16
Глава 2. Регуляторные В-клетки 20
2.1. Фенотипическая характеристика регуляторных В-клеток (Вreg) 20
2.2. Происхождение Вreg 22
2.3. Роль поверхностных молекул в деятельности Вreg 24
2.4. Экспериментальные модели в изучении регуляторных В-клеток 30
2.5. Взаимосвязь и взаимодействие Вreg и Treg 41
Глава 3. Клеточные взаимодействия при иммунном ответе 45
3.1. Взаимодействие В и Т-лимфоцитов 45
3.2. Роль макрофагов при иммунном ответе В-лимфоцитов 49
3.3. Влияние стромальных клеток на ответ В-лимфоцитов 51
Часть 2. Экспериментальные исследования 54
Глава 4. Материалы и методы исследования 54
4.1. Животные и материалы 54
4.2. Методы 55
4.2.1. Приготовление клеточных суспензий 55
4.2.2. Постановка реакции цитотоксичности 55
4.2.3. Выделение субпопуляций лимфоцитов 56
4.2.4. Получение дендритных клеток (ДК) 62
4.2.5. Культивирование клеток in vitro 62
4.2.6. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) 63
4.2.7. Клеточный иммуноферментный анализ (ELISPOT) 64
4.2.8. Витальное окрашивание клеток CFDA-SE 65
4.2.9. Проточная цитометрия 66
4.2.10. Адоптивный перенос Breg мышей линии СВА мышам линии CBA/N 67
4.2.11 Статистическая обработка результатов 67
Глава 5. Результаты исследований 68
5.1. Разработка модельной системы для изучения межклеточных взаимодействий с использованием конгенных линий мышей СВА и СВА/N in vitro при ответе на ТН-2 АГ 68
5.1.1. Определение функциональной активности перитонельных и селезеночных клеток мышей линии СВА в смешанных культурах со спленоцитами мышей линии СВА/N 68
5.1.2.Определение клеточного состава смешанных культур до и после культивирования in vitro 71
5.1.3.Оценка функциональной активности выделенных В-1 и В-2 лимфоцитов мышей СВА в смешанных культурах при ответе на ТН-2 антигены 74
5.2. Изучение взаимодействий В-1, В-2, Т лимфоцитов и ДК при индукции иммунного ответа на ТН-2 АГ in vitro 78
5.2.1. Влияние ДК на жизнеспособность В-клеток 78
5.2.2. Влияние ДК на иммунный ответ В-1 и В-2 лимфоцитов на ТН-2 АГ в модельной системе 79
5.2.3. Влияние Т-клеток на иммунный ответ В-1 и В-2 лимфоцитов на ТН-2 АГ 81
5.2.4. Влияние ДК на иммунный ответ В-1 и В-2 лимфоцитов в присутствии Т-клеток 83
5.3. Роль Вreg клеток в гуморальном иммунном ответе 85
5.3.1. Изучение влияния IL-10 на иммунный ответ В-1 клеток мышей СВА и В-2 клеток мышей СВА и CBA/N на ТЗ и ТН-АГ в модельной системе in vitro 86
5.3.2. Фенотип и функциональная активность Вreg 89
5.3.3. Определение влияния Breg на иммунный ответ in vitro 92
5.3.4. Влияние Breg на иммунный ответ in vivo 96
Глава 6. Обсуждение результатов 98
Выводы 112
Благодарности 113
Список сокращений 114
Список литературы 116
- Роль поверхностных молекул в деятельности Вreg
- Взаимодействие В и Т-лимфоцитов
- Выделение субпопуляций лимфоцитов
- Определение влияния Breg на иммунный ответ in vitro
Введение к работе
Актуальность исследования. В-лимфоциты - основные клетки-эффекторы, синтезирующие антитела на патогены при гуморальном иммунном ответе. В то же время получены новые данные о регуляторных свойствах В-клеток при различных воспалительных, аутоиммунных и аллергических заболеваниях [Kamekura R at al, 2015; Braza F, at al, 2015]. Однако каковы механизмы реализации этих свойств В-клетками и роль их в регуляции гуморального иммунного ответа на разные антигены остается до сих пор не ясной [Tedder TF, 2015].
В-лимфоциты неоднородны, в настоящее время известно о существовании 4 субпопуляций В-клеток, отличающихся по своему фенотипу, локализации, механизму дифференцировки и свойствам: В-2, В-1а, В-1b и MZ-B лимфоциты [Сидорова Е.В., 2002; Baumgarth N, 2016]. Основной функцией В-2 клеток является синтез высокоспецифичных антител. В-1а, В-1b и MZ-B лимфоциты выполняют функцию первой линии защиты организма от попадающих в кровь патогенов и продуцируют основную массу нормальных антител [Сидорова Е.В., 2006; Hardy RR, 2006]. На развитие и селекцию В-1 клеток существенно влияют Т-независимые антигены 2 типа (ТН-2 АГ), к которым относятся бактериальные и некоторые вирусные антигены. Исследование механизмов взаимодействия В-1 лимфоцитов с другими лимфоидными клетками в ходе иммунного ответа на ТН-2 АГ может быть полезным при создании новых вакцин на основе этих антигенов.
В последние годы выяснилось, что В-клетки, помимо перечисленных, обладают еще и регуляторными функциями (Вreg) [ at al, 2011]. В основном их роль сводится к угнетению воспалительных и аутоиммунных процессов [Carter NA at al, 2011; at al, 2010; Mauri C at al, 2017; at al, 2010; at al, 2010]. Существуют различные виды Вreg, отличающиеся фенотипом и синтезируемыми цитокинами [ at al, 2015; Huang A at al, 2017]. Влияние Вreg на патологические процессы, главным образом, обусловлено
синтезом IL-10. Основным источником Вreg являются, по-видимому, В-1 лимфоциты [Margry В at al, 2014]. Они продуцируют IL-10, способный угнетать презентацию АГ, продукцию провоспалительных цитокинов, пролиферацию Т-лимфоцитов и функции некоторых других клеток at al, 2010]. До сих пор Вreg исследовали при воспалительных, аллергических и аутоиммунных заболеваниях, оценивая воздействие этих клеток на патологию по различным клиническим показателям [Floudas A at al, 2016]. Роль этих клеток в регуляции гуморального иммунного ответа даже не рассматривалась. Экспериментальные модели, позволяющие прямо оценить регуляторную функцию этих клеток, до сих пор не разработаны. Таким образом, исследование Вreg и влияние их на гуморальный иммунный ответ важно как с теоретической точки зрения, так и для клинической иммунологии.
Целью настоящей работы является исследование функциональной активности В-1 и Вreg клеток и их взаимодействия с иммунокомпетентными клетками организма при гуморальном иммунном ответе.
Задачи исследования:
-
Отработать выделение субпопуляций В-клеток мыши методом иммуномагнитной сепарации.
-
Разработать модельную систему in vitro для исследования иммунного ответа В-1 клеток на Т-независимые АГ.
-
Оценить влияние Т-лимфоцитов и дендритных клеток на функциональную активность В-1 лимфоцитов.
-
Определить роль регуляторных В-клеток в гуморальном иммунном ответе.
Научная новизна
Разработана оригинальная модельная система in vitro с использованием в качестве клеток «филлеров» спленоцитов xid-мышей СBA/N, не содержащих В-1 клетки и не отвечающих на ТН-2 АГ.
Впервые показано, что в модельной системе in vitro основное количество антител и тотальных иммуноглобулинов к ТН-2 АГ синтезируют В-1 лимфоциты.
Впервые установлено, что при контактном взаимодействии дендритные клетки способны угнетать ответ на ТН-2 АГ в культурах Т-клеток с В-1 лимфоцитами в системе in vitro.
Впервые в модельной системе in vitro показано угнетающее влияние IL-10 на иммунный ответ В-1 клеток на ТН-2 АГ и В-2 лимфоцитов при ответе на Т-зависимый и Т-независимый 1-го типа антигены (ТЗ и ТН-1 АГ соответственно).
Впервые установлено, что регуляторные В-клетки способны угнетать специфический и поликлональный иммунный ответ на ТЗ и ТН-1 АГ в модельной системе in vitro.
Настоящая работа относится к исследованиям фундаментального характера.
В то же время разработанная модельная система in vitro с применением в качестве клеток «филлеров» спленоцитов мышей линии СBA/N может быть использована для изучения клеточных взаимодействий минорных В-клеточных субпопуляций: В-1 и Breg-лимфоцитов. Поскольку В-1 лимфоциты отвечают в основном на Т-независимые антигены 2 типа, к которым относятся некоторые бактериальные и вирусные антигены, исследование клеточных взаимодействий В-1 клеток при ответе на ТН-2 АГ может быть полезным при оценке поствакцинального иммунитета на стадии разработки новых вакцин и противоинфекционных препаратов.
1. В модельной системе in vitro при ответе на Т-независимые антигены 2-го типа (ТН-2 АГ) основное количество антител и тотальных иммуноглобулинов образуют В-1 лимфоциты. Дендритные клетки угнетают
образование ИГ-продуцентов при ответе на ТН-2 АГ в культуре В-1 и
Т-лимфоцитов.
2. Breg клетки, синтезирующие IL-10, угнетают иммунный ответ
В-лимфоцитов на Т-зависимый и Т-независимый антигены, что также показано нами в модельной системе in vitro с использованием рекомбинантного IL-10.
Апробация материалов диссертации и публикации
Материалы диссертационной работы обсуждены на Международных иммунологических конференциях (Бостон, США, 2008; Сан-Франциско, США, 2009; Осака, Япония, 2010), на Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2008; 2015).
Апробация диссертации состоялась 28.03.2017 г. года на научной конференции отдела иммунологии ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова.
По теме диссертации опубликованы 20 печатных работ, из них 7 статей и 7 тезисов в изданиях, рекомендованных ВАК, 3 в иностранных изданиях.
Структура и объем диссертации
Материалы диссертации изложены на 137 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (три главы), главы «Материалы и методы», результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 18 рисунками.
Роль поверхностных молекул в деятельности Вreg
Увеличение количества Вreg наблюдается при различных патологических процессах под действием разнообразных факторов. Поверхностные молекулы на регуляторных В-клетках и механизмы, приводящие к возрастанию числа Вreg, активно исследуются. Рассмотрим имеющиеся данные. 2.3.1.Toll-подобные рецепторы (TLR)
Toll-подобные рецепторы клеток, распознающие консервативные, повторяющиеся паттерн-структуры микроорганизмов, участвуют в защите от патогенов.
На важность передаваемых через TLR сигналов в формировании регуляторных функций В-клеток указывают эксперименты на мышах с дефицитом адапторного белка, необходимого для проведения сигнала через TLR2 или TLR4, MyD88. В-клетки, активированные Helicobacter felis через TLR2 и сигнальную молекулу MyD88, ограничивают развитие тяжелой гастрологической патологии, способствуя снижению Тh1 ответа [146]. У мышей, лишенных MyD88 или 2-х рецепторов TLR2 и TLR4 именно в В-клетках, развивается хроническая форма экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) [84]. При снижении экспрессии TLR9 в В-лимфоцитах такой эффект не наблюдался. Полученные данные свидетельствовали о том, что передача сигнала через TLR 2 или TLR4 на В-клетках необходима для выполнения Вreg противовоспалительных функций. Вместе с тем, CpG (лиганд для TLR9) увеличивает образование IL-10 В-лимфоцитами [19].
В CD5+ и CD5- неонатальных В-клетках передача сигнала через TLR9 стимулировала активацию различных программ [164]. Обе субпопуляции пролиферировали и секретировали IgM, но только CD5+ В-лимфоциты продуцировали IL-10. Высвобождение IL-10 CD5+ В-клетками в неонатальный период развития сдерживало способность дендритных клеток (ДК) секретировать IL-12 и увеличивать Th1 ответ. Таким образом, на ранней стадии развития CD5+ В-клетки являются частью микроокружения для ДК, защищающего от воспалений, вызываемых различными инфекционными агентами.
Напротив, при инфекции, вызванной Salmonella typhimurium, экспрессия MyD88 в В-клетках мыши угнетала защитный иммунитет [125]. Мыши, лишенные MyD88 в В-клетках, обладали большей устойчивостью к Salmonella typhimurium. Авторы обнаружили регуляторную роль CD138+CD19+ В-клеток, продуцирующих IL-10 во врожденном и адаптивном иммунитете. Вreg супресировали активацию нейтрофилов, натуральных киллеров и эффекторных Т-клеток. Таким образом, проведение сигнала через MyD88 в Вreg может способствовать как развитию защитной реакции организма, так и развитию заболевания.
2.3.2. CD80 – CD86
В-клетки обладают АГ-презентирующей способностью, которая зависит от взаимодействия экспрессирующихся на В-клетках ко-стимулирующих молекул CD80 и CD86 с молекулой CD28 на Т-клетках. Известно, что CD80 и CD86 обеспечивают различные ко-стимулирующие сигналы. Сигнал, передаваемый через CD86, в большей степени способствует дифференцировке Th2 лимфоцитов [83, 162]. Последнее было продемонстрировано при инфицировании мышей L3 Brugia pahangi, сопровождающееся увеличением экспрессии CD86 на В-клетках, которое, в свою очередь, способствовало экспансии Th2 лимфоцитов [61]. Кроме того, были выявлены В-лимфоциты, которые синтезировали значительное количество IL-10 наряду с CD4+ клетками, следовательно обладали регуляторными функциями. Блокирование рецептора IL-10 in vitro с помощью моноклональных антител (мАТ) увеличивало экспрессию CD80 и CD86 на В-лимфоцитах. Аналогичная картина наблюдалась in vivo в опытах на IL-10-/-мышах. Следовательно, АГ-презентирующая способность В-лимфоцитов, связанная с уровнем экспрессии молекул CD80 и CD86, снижалась в присутствии IL-10.
На участие CD86 в функциональной активности Вreg указывают данные, полученные Mizoguchi E и др. [117]. На мышах со спонтанными хроническими колитами (TCR -/-) было показано, что блокирование мАТ молекулы CD86, но не CD80, на В-клетках TCR -/- мышей перед переносом их двойным мутантам -/отменяет снижение числа патогенных Т-клеток у реципиентов. То есть экспрессия молекулы CD86 на Вreg необходима для выполнения ими регуляторных функций.
Перенос облученным МТ мышам костного мозга CD80 и CD86 дефицитных мышей не защищало реципиентных мышей от аутоиммунного энцефаломиелита после введения им энцефатолитогенных Т-клеток [98]. Авторами впервые было показано, что экспрессия CD80 и CD86 на В-клетках необходима для выздоровления при ЕАЕ, а также для образования IL-10 и Foxp3 Т-клеток в центральной нервной системе (ЦНС) при этом заболевании.
Из приведенных выше данных следует, что экспрессия CD86 и в меньшей степени CD80 на В-клетках необходима для выполнения ими регуляторных функций при различных заболеваниях.
2.3.3. CD40
Для регуляции адаптивного иммунного ответа принципиальное значение имеет CD40-CD154 взаимодействие между В и Т-лимфоцитами. Mizoguchi E с соавторами показали, что В-клетки, выделенные из CD40-/- мышей, также как и В-лимфоциты, обработанные анти-CD40 мАТ, теряют способность регулировать численность патогенных TCR -low Т-клеток, индуцирующих развитие колита в кишечнике -/- мышей (мыши дефицитные по TCR -/- и по Ig) [117]. Это позволяет предположить, что непосредственный контакт CD40 и CD154 (на В и Т-клетках соответственно) необходим для осуществления В-лимфоцитами регуляции экспансии Т-клеток при развитии колитов у TCR -/- мышей.
Shah S и др. исследовали роль В-клеток в анти-опухолевом иммунитете, сравнивая мышей дикого типа с IgМ-/-мышами, генетически лишенными В-клеток [151]. Мутантные мыши были более устойчивы к развитию опухолей. Удалось также показать, что В-лимфоциты мышей дикого типа угнетают секрецию INF- спленоцитов IgМ-/- мышей in vitro. В-лимфоциты CD40-/- мышей такой способностью не обладали. Однако восстановление CD40-/- В-клетками IgМ-/мышей приводило к возобновлению роста опухолей. Эти данные указывают на то, что хотя экспрессия CD40 на В-лимфоцитах необходима для проявления ими регуляторных свойств, приводящих к ингибированию анти-опухолевого Тh1 и цитотоксического ответов, в этот процесс вовлечены и другие факторы.
Аналогичные результаты были получены Inoue S с соавторами [72]. Исследователи ко-культивировали клетки селезенки мышей C57BL/6 или нокаутных по В-лимфоцитам мышей (ВКО) с облученными опухолевыми клетками. Было показано снижение образования INF- CD8 Т-лимфоцитами и NK клетками в культурах спленоцитов C57BL/6, по сравнению с таковым у ВКО мышей. Образование INF- коррелировало с экспрессией CD40L на опухолях и было обратно пропорционально продукции IL-10 В-клетками. В-лимфоциты C57BL/6 мышей синтезировали больше IL-10 по сравнению с В-клетками CD40-/-мышей. Таким образом, косвенно было показано, что синтезирующие IL-10 В-лимфоциты могут способствовать росту опухолей.
Отдельная серия работ посвящена исследованию влияния агонистов анти-CD40 на регуляторные свойства В-клеток. Blair P с сотрудниками на модели экспериментальной красной волчанки у MRL/lpr мышей показали, что агонисты анти-CD40 способствуют увеличению количества подобных транзиторным Вreg за 72 часа в культуре in vitro [24]. Полученные таким образом Вreg угнетали дифференцировку Th1 клеток и индуцировали дифференцировку Treg-1 лимфоцитов. Эти данные подтверждают полученные ранее in vivo результаты Mauri C и др., показавших, что введение агонистов анти-CD40 (мАт FG45 или 3/23) способно значительно снизить тяжесть коллаген индуцированного артрита у DBA/TcR- мышей [113]. Улучшение происходило за счет угнетения Th1 ответа и увеличения образования IL-10. Введение агонистов анти-CD40 до индукции заболевания к подобному эффекту не приводило.
Таким образом, для выполнения своих регуляторных функций Вreg необходимо взаимодействие CD40 – CD154, влияние агонистов анти-CD40 на В-лимфоциты приводит к увеличению числа Вreg и следовательно к возрастанию синтезируемого IL-10.
Взаимодействие В и Т-лимфоцитов
Взаимодействие В и Т-лимфоцитов необходимо при ответе на Т зависимые антигены (ТЗ АГ). К ТЗ АГ относятся растворимые пептиды и белки, а также корпускулярные АГ (вирусы, бактерии). АГ, попадая в фолликулы вторичных лимфоидных органов, взаимодействуют со специфическими рецепторами В-лимфоцитов (BCR), происходит интернализация и презентация АГ в комплексе с молекулой MНСII. В результате активированные В-клетки мигрируют на границу Т-В зоны в поисках “родственных” им Т-лимфоцитов. CD4+ Т хелперы, названные фолликулярными Т хелперами (ТFH), через TCR, CD28, CD40L и ICOS взаимодействуют с соответствующими поверхностными структурами на дендритных клетках (ДК): ТЗ АГ/MHC II, CD80/CD86, CD40 и ICOS-L. У получивших активационные сигналы ТFH увеличивается экспрессия транскрипционного фактора BCL-6 (репрессор В-клеточной лимфомы 6) и СХС хемокинового рецептора 5 (CXCR5) [43, 94, 179]. Увеличение экспрессии последнего способствует миграции ТFH на границу Т-В зоны, где они встречают активированные соответствующими АГ В-клетки. Распознавание комплекса ТЗ АГ/МНСII на поверхности В-лимфоцитов приводит к увеличению экспрессии CD40L на ТFH, и они начинают секретировать цитокины INF, IL-21 и IL-4[133]. В результате взаимодействия В и Т-лимфоцитов индуцируется дифференцировка В-клеток в плазматические клетки (ПК). Иммунный ответ на ТЗ АГ характеризуется образованием зародышевых центров (ЗЦ). Активированные В-клетки могут войти в фолликул и создать там ЗЦ или образовать экстрафолликулярный фокус. Судьба В-клеток определяется многими факторами: аффинитетом BCR, количеством и природой АГ, силой сигнала. В экстрафолликулярном пространстве идет дифференцировка в короткоживущие ПК (кПК) и пролиферация Blimp-1+, BCL-6- бластных В-клеток. В V-генах этих клеток почти отсутствуют соматические гипермутации, они секретируют большое количество низкоаффинных IgM антител (АТ) и погибают через 2-3 дня [131, 167]. В-лимфоциты с низкоаффинным BCR, экспрессирующие BCL-6, мигрируют в фолликулы [88]. Там они образуют ЗЦ, при помощи высокоактивированных ТFH, характеризующихся фенотипом CXCR5hiPD1hi (рецептор программированной клеточной смерти) ICOS hi (индуцированный Т-клеточный стимулятор) Bcl-6hi, подвергаются соматическим гипермутациям, переключению изотипов ИГ и превращаются в долгоживущие ПК или клетки памяти [95]. Поддержание оптимального количества ТFH клеток в ЗЦ важно для контроля за появлением аутореактивных В-клеточных клонов. В механизм этого контроля вовлечены регуляторные фолликулярные Т-клетки (ТFR), отличительной особенностью которых является экспрессия транскрипционного фактора Foxp3. Контролируя количество ТFH, ТFR ограничивают появление неспецифичных к АГ ЗЦ и способствуют появлению более аффинных АТ [136] Долгое время считалось, что Т-независимые антигены (ТН АГ), которые подразделяются на Т-независимые АГ 1-го типа (ТН-1) и Т-независимые АГ 2-го типа (ТН-2), индуцируют образование АТ без участия Т-клеток. И действительно, для ответа на ТН-1 антигены, которые являются митогенами (бактериальные липополисахариды), не нужны дополнительные стимулирующие Т-факторы, поскольку сигнал В-клетке от митогенной части ТН-1 АГ заменяет помощьТ хелперов (Тh) [89].
В последние годы стало ясно, что при ответе на ТН-2 АГ независимость от Т-клеток является относительной. В иммунном ответе на ТН-2 АГ, главным образом, участвуют В-1 и В-клетки маргинальной зоны селезенки (MZ-В) лимфоциты. ТН-2 АГ представляют собой гетерогенную группу: бактериальные полисахариды, флагеллин, синтетический полимер – поливинилпироллидон с молекулярной массой 350 кДа, полипептиды из D-аминокислот и др. Считалось, что эти АГ не встраиваются в МНС II из-за особенностей своего строения [181]. В то же время полисахариды, обладающие двойным зарядом – цвиттер-ионы, могут индуцировать иммунный ответ, активируя Т-клетки через комплекс АГ/МНС II [39](однако, подавляющая часть ТН-2 АГ не относится к цвиттер-ионам). Есть данные о влиянии Т-клеточных цитокинов на образование ИГ при ответе на конъюгаты декстрана и анти-IgD АТ [182]; факторы, образующиеся при Т-В взаимодействии, способны стимулировать секрецию АТ к полисахаридам примированными В-лимфоцитами [28]. Известно об угнетении образования IgG АТ к (13)декстрану (ТН-2 АГ) Т регуляторными клетками [141]. На иммунодефицитных (SCID/SCID) мышах было показано, что IgM ответ на полисахариды у этих мышей после переноса им В-лимфоцитов и CD4+ Т-лимфоцитов был выше, чем у животных, репопулированных только В-лимфоцитами [74]. При восстановлении nu/nu мышей Т-лимфоцитами увеличивалось количество АТ к ТН-2 АГ [121]. Между тем, механизмы влияния Т-лимфоцитов на иммунный ответ, вызываемый ТН-2 АГ, до конца не выяснены.
iNКТ – это уникальный подкласс Т-лимфоцитов, которые несут на своей поверхности как Т-клеточный рецептор (TCR), так и маркеры NК-клеток (CD16, CD56, CD161). Особенностью iNКТ является экспрессия инвариантной V TCR (V14J18, V8.2 у мыши, V24J18 у человека) в паре с ограниченным разнообразием V TCR (V8.2, V7 или V2 у мыши, V11 у человека) [85].
Такой TCR распознает гликолипидный АГ в комплексе с МНС-I подобной молекулой CD1d, которая экспрессируется на моноцитах, ДК, В-клетках и некоторых негемопоэтических клетках [47]. Практически все iNКТ взаимодействуют с синтетическим гликолипидным АГ– -галактозилцерамидом (GalCer) в комплексе с CD1d, а также отвечают на другие гликолипиды из различных инфекционных патогенов: Sphingomonas, B. Burgdorferi, S. Pneumoniae, A. Fumigatus [12, 82, 176].
iNКТ могут взаимодействовать с В-лимфоцитами напрямую или опосредованно, помогая им превращаться в ПК. При опосредованном (непрямом) способе взаимодействия GalCer часто используется в качестве “адьюванта” с белковыми АГ [57, 178]. iNКТ-клетки оказывают помощь В-лимфоцитам через активацию паракортикальных CD8+ ДК или макрофагов субкапсулярного синуса, взаимодействуя с ними через комплекс GalCer-CD1d. В результате такого взаимодействия увеличивалась экспрессия CD40L iNКТ клеток, и они начинали синтезировать больше INF. Активированные iNКТ стимулируют CD8+ ДК к созреванию в эффективные антигенпрезентирующие клетки, которые в свою очередь примируют Тh [155]. В результате Тh клетки приобретают функции ТFH и взаимодействуют с подготовленными тем же АГ В-лимфоцитами, т.е. развивается типичный ТЗ ответ. Надо отметить, что в присутствии активированных GalCer iNКТ клеток отмечалось усиление иммунного ответа [58].
iNКТ клетки могут непосредственно взаимодействовать с В-лимфоцитами, помогая им превращаться в ПК без участия других клеток иммунной системы.
Было показано, что на поверхности iNКТ увеличивается экспрессия CXCR5 после их взаимодействия с В-лимфоцитами, которые интернализировали гликолипидный АГ и представили его в комплексе с CD1d. Это способствовало переходу iNКТ в фолликулы, у них увеличивалась экспрессия BCL-6, в результате iNКТ дифференцировались в iNКТFH с фенотипом CXCR5hiPD1hiICOS hiCD40Lhi и начинали синтезировать больше IL-21 [33]. Взаимодействие iNКТFH с В-клетками ЗЦ приводило к индукции синтеза ИГ IgG класса, однако, не происходило созревания высокоаффинных АТ, не образовывались долгоживущие плазматические клетки и клетки памяти [33, 81]. Взаимодействие iNКТ и В-клеток может происходить и в экстрофолликулярном пространстве, что приводит к образованию главным образом АТ IgM класса [20]. Надо отметить, что иммунный ответ, вызываемый прямым взаимодействием iNКТ и В-лимфоцитов, развивается быстрее, чем опосредованный Т-клетками и ДК. Пик иммунного ответа в результате прямого контакта наступает на 5 сутки, заканчивается на 28 день [81]. Взаимодействие поверхностных структур CD40/CD40L, CD28/CD80 или CD86 на iNКТ и В-лимфоцитах соответственно, также как и синтез iNКТ клетками интерлейкинов IL-21, INF является обязательным для развития иммунного ответа [86].
Выделение субпопуляций лимфоцитов
Для изучения функциональной активности субпопуляций В-лимфоцитов in vivo и исследования их взаимодействий с другими клетками (в т. ч. с Т-лимфоцитами), в модельной системе in vitro необходимо было выделить отдельные популяции лимфоцитов. Для этого использовались различные подходы, описанные ниже. В-1 клетки выделяли из селезенки и брюшной полости мышей, В-2 – из селезенки. В процессе работы были подобраны и отработаны методы разделения клеток, позволившие получить субпопуляции В-1, В-2 и Т-лимфоцитов в наиболее обогащенном виде. Разработанные методы представлены ниже.
Разделение спленоцитов мыши на В-2 субпопуляцию и смесь клеток, включающую В-1 лимфоциты В-1 лимфоциты – минорная субпопуляция В-клеток в селезенке. Поэтому на первом этапе мы получали В-2 клетки и обогащенную В-1 лимфоцитами суспензию клеток селезенки. Разделение В-клеток селезенки проводили методом иммуномагнитной сепарации с использованием кита Mouse B cell Negative Isolation kit (Dynal, Норвегия). Для этого готовили суспензию клеток селезенки мыши (см. раздел 4.2.1.), ресуспендировали их в ФСБ рН-7.4 с 0,1% БСА в концентрации 100 млн/мл в обрабатывали «коктейлем» АТ крысы к поверхностным маркерам CD43, СD4 и Ter-119 мыши с добавлением ЭТС в конечной концентрации 7% и инкубировали 20 минут при +4оС. Клетки отмывали буфером и инкубировали с магнитными бусами, содержащими АТ барана к IgG крысы (Dynabeads Sheep anti-Rat IgG, Dynal, Норвегия), в течение 25 мин при температуре 18-25С при постоянном перемешивании на ротаторе (BIOSAN, Multi RS-60) с частотой 5 об/мин. Используемый метод относится к методу негативной сепарации, поэтому после инкубации «В-2» клеточная популяция оставалась свободной от магнитных бус, тогда как остальные клетки селезенки: В-1, Т, макрофаги и другие лейкоциты, были связанными с магнитными бусами.
Для дальнейшего использования В-1 клеток в эксперименте необходимо было освободить их от бус. Для этого суспензию клеток, содержащую в т.ч. В-1 лимфоциты, инкубировали 7 мин при +37оС при постоянном перемешивании с разведенным до концентрации 0,2% трипсином (Gibco) и отмывали 10 мл среды RPMI1640 при центифугировании .
Полученные «В-2» клетки разделяли на субпопуляцию СD23high (В-2 клетки) и CD23 low (смесь МZ и B-2 клетки). Для этого «В-2» клетки последовательно инкубировали вначале с АТ крысы к CD23 мыши (клон В3В4, BD Рharmingen), а затем с магнитными бусами покрытыми АТ барана к IgG крысы (Dynabeads Sheep anti-Rat IgG, Dynal, Норвегия). Это позволило анализировать функциональную активность различных субпопуляций В-лимфоцитов при иммунном ответе на ТН-2 антигены in vivo [1].
Выделение СD5+ В лимфоцитов из селезенки мышей методом позитивной сепарации
Для изучения особенностей иммунного ответа В-1 и В-2 лимфоцитов на ТН-2 антигены in vitro необходимо было выделить «чистыми» не только В-2 и MZ-B , но и В-1 клетки. Для получения последних было решено использовать метод позитивной сепарации при помощи кита Сellection biotin binder kit (Dynal, Норвегия). При использовании данного кита биотинилированные АТ связываются с соответствующим поверхностным маркером на поверхности клетки, затем к ним прикрепляются магнитные бусы, соединенные со стрептавидином через «ДНК мостик». После разделения клеток, разрушая «ДНК мостик», можно получить свободные от магнитных бус клетки, В-1 клетки выделяли из селезенки мышей CBA. Моноклеточную суспензию спленоцитов, обогащенную В-лимфоцитами, получали, последовательно удаляя эритроциты и Т-лимфоциты, как описано в разделах 4.2.1 и 4.2.2. Затем клетки последовательно инкубировали с биотинилированными АТ крысы к поверхностным рецепторам СD43 и CD5 мыши (Pharmingen) 10 мин при +4 оС, и с магнитными бусами, покрытыми стрептавидином (Dynal, Норвегия), на ротаторе 20 мин при +4 оС. В результате получали «розетки» В-1 клеток, связанных с несколькими магнитными бусами. На последнем этапе В-1 клетки отделяли от магнитных бус, инкубируя «розетки» с ДНКзой (Dynal) в присутствии Са2+ и Мg2+ (RPMI1640, 1% ЭТС,1 мМ СаСl2, 4 мМ MgCl2, рН=7,0–7,4) в течение 15мин при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Чистота выделенных В-лимфоцитов согласно данным проточной цитометрии составляла от 60 до 80% CD19+ клеток. Однако таким способом удалось выделить не более 0.05 млн В-1 клеток из 100 млн клеток селезенки мыши. Поэтому было решено выделять В-1 лимфоциты из перитонеальной полости.
Выделение В-1 лимфоцитов из перитонеальной полости мышей методом негативной сепарации.
Так как В-1 лимфоциты мыши составляют большинство клеток брюшной полости, было решено выделять их именно из этого компартмента организма. Для этого сначала клетки вымывали из брюшной полости мышей СВА, как описано в разделе 4.2.1., и отделяли макрофаги на чашках Петри, инкубируя их в среде RPMI 1640 c 5% ЭТС в течение 10 час при +37оС в СО2 инкубаторе. Неприлипшие клетки переводили в ФСБ с 0,1% БСА и удаляли из них Т-лимфоциты, инкубируя с магнитными бусами panT (Dynal) 30 мин при +4оС на ротаторе. Для освобождения от В-2 клеток и оставшихся макрофагов, полученную клеточную суспензию обрабатывали антителами крысы к CD23 и F4/80 BD (Рharmingen) мыши в течение 20 мин при +4оС, затем клетки инкубировали 20-25 мин при комнатной температуре на ротаторе с магнитными бусами, покрытыми антителами барана к IgG крысы. Выделенные клетки оценивали по экспрессии поверхностных маркеров: CD19+ 90% (В-клеточный маркер), CD23+ 5% (маркер, характерный для В-2 лимфоцитов), CD3+ 1,5% (маркер Т-клеток), CD5+ 35-40% (маркер Т и В-1 клеток), CDllb+ 60% (маркер, характерный для перитонеальных В-1 клеток и макрофагов), F4/80+ - не более 5% (маркер макрофагов). Из этих характеристик следовало, что полученные таким способом В-1 клетки обладают достаточной чистотой для использования в исследовании их функциональной активности в системе in vitro.
Выделение В-1 клеток брюшной полости, В-2 и Т-клеток селезенки мыши методом позитивной сепарации
Используемый выше метод позволил получить В-1 лимфоциты высокой степени чистоты, однако длительные манипуляции в отдельных случаях снижали жизнеспособность клеток. Для того чтобы сократить время получения В-1 клеток и уменьшить количество стадий выделения была использована методика позитивной сепарации с использованием магнитных бус фирмы Miltenyi Biotec (Германия), покрытых антителами крысы к CD 19 мыши. Эти магнитные бусы значительно меньше клетки, поэтому они не мешают исследованию выделенных клеточных популяций на цитофлуориметре.
Для получения В-1 клеток у мышей СВА делали смыв из перитонеальной полости, как описано в разделе 4.2.1. Клетки отмывали 2 раза буфером и готовили суспензию с концентрацией 100 млн/мл. Затем их инкубировали с магнитными бусами, покрытыми антителами крысы к CD 19 мыши, в течение 15 мин при +4оС. Перитонеальные В-лимфоциты (смесь В-1 и В-2) выделяли на МS колонке (Miltenyi, Германия). В-2 популяцию отделяли, последовательно инкубируя перитонеальные В-клетки вначале с биотинилированными антителами к CD23 мыши (20 мин при +4оС), а затем со стрептавидиновыми магнитными бусами Dynal (30 мин при +4оС на ротаторе). После инкубации получали свободную от магнитных бус В-1 клеточную популяцию и В-2 клетки в виде «розеток» с магнитными бусами. При таком способе выделения были получены В-1 клетки со следующими фенотипическими характеристиками: СD19+ 93%; CD5+ 20-30%; CD3+ 3%; CD23+ 4%; F4/80+ 5% (рисунок 4А). Данный метод не только позволил сократить время выделения, но и повысил чистоту В-1 субпопуляции.
Определение влияния Breg на иммунный ответ in vitro
Влияние Breg на иммунный ответ на ВРАБЭ in vitro
Выделение Breg высокой чистоты позволило перейти к изучению влияния этих клеток на гуморальный иммунный ответ. На первом этапе определяли влияние Breg на иммунный ответ спленоцитов мышей линии CBA/N. Breg выделяли из активированных перитонеальных В-лимфоцитов мышей линии СВА. Поскольку Breg сами синтезируют большое количество ИГ (это затрудняет определение ИГ-продуцентов в смешанной клеточной культуре методом ELISPOT), использовали культивирование Вreg и спленоцитов мышей линии CBA/N, разделенных полупроницаемой мембраной (в трансвеллах). Спленоциты мышей CBA/N помещали в нижнюю (5млн/мл), а Breg в верхнюю камеру (1млн/мл). Клетки культивировали в течение 4 суток при добавлении ВРАБЭ или без него и определяли содержание АОК и ИГОК в культурах. В качестве контроля использовали неактивированные перитонеальные Breg мышей СВА, помещенные в верхнюю камеру, прошедшие все стадии получения Вreg, за исключением добавления активаторов (контрольные В-клетки, Вконтр) (рисунок 15).
Прирост числа АОК и ИГОК, индуцированный при внесении ВРАБЭ, рассчитывали как разность между их средними значениями в клеточных культурах с добавлением антигена и без него.
Из данных представленных на рисунке 15 видно, что внесение в верхнюю камеру контрольных В-лимфоцитов приводило к увеличению прироста числа АОК к ВРАБЭ в суспензии спленоцитов мышей линии CBA/N в 2 раза. На число ИГОК контрольные В-лимфоциты влияли незначительно. Напротив, культивирование Breg, помещенных в верхнюю камеру, со спленоцитами мышей линии CBA/N приводило к снижению прироста числа АОК к ВРАБЭ в 2,5раза и ИГОК в 5–6 раз. Полученные результаты свидетельствуют о том, что Breg угнетали образование ИГОК при иммунном ответе на ВРАБЭ в культуре спленоцитов мышей линии CBA/N.
На следующем этапе определяли влияние Вконтр и Breg на вносимые в нижнюю камеру В-2 и В-1 лимфоциты в разработанной нами ранее модельной системе in vitro, в которой «филлерами» выступали спленоциты мышей линии CBA/N (рисунок 16). На графиках указаны приросты числа АОК и ИГОК, индуцированные при внесении ВРАБЭ, которые рассчитывали как разность между их средними значениями в культурах при добавлении АГ и без него. Как видно из данных представленных на рисунке 16, добавление ВРАБЭ индуцировало иммунный ответ в смешанных культурах: прирост числа АОК для культуры с В-2 клетками составил – 478±190/106 клеток, а числа ИГОК – 3745±2565/106 клеток. Для культуры с В-1 лимфоцитами соответствующие показатели составили для АОК – 345±186/106, а для ИГОК – 13133±6023/106 клеток. Внесение в верхнюю камеру Вконтр в культуре с В-2 лимфоцитами приводило к увеличению прироста АОК и ИГОК до значений 1037±339/106 и 8178±3347/106 соответственно, то есть примерно в 2 раза. Добавление Вreg значительного влияние на прирост АОК и ИГОК не оказывало.
На культуру, содержащую В-1 клетки, Вконтр и Вreg воздействовали по-другому. Внесение в верхнюю камеру Вконтр почти не влияло на образование АОК и ИГОК, индуцированных ВРАБЭ. В то же время, добавление в верхнюю камеру Breg уменьшало в смешанной культуре с В-1 лимфоцитами прирост АОК и ИГОК с 344±185/106 и 13133±6023/106 клеток до значений 201±94/106 и 7045±1924/106 клеток соответственно.
Таким образом, Вreg угнетали индуцированный ВРАБЭ специфический и поликлональный иммунный ответ в культурах спленоцитов мышей линии CBA/N и смешанных культурах с В-1 лимфоцитами. Так как основным критерием при отборе Вreg было образование IL-10, и ранее нами было показано угнетающее воздействие IL-10 на иммунный ответ, вероятнее всего – это влияние Вreg в значительной степени обусловлено выделяемым ими IL-10.
Влияние Breg на иммунный ответ на LPS in vitro
Интересно было выяснить, какое воздействие оказывают Breg на иммунный ответ, индуцированный ТН-1 АГ – LPS (антиген использовали в иммуногенной дозе 1нг/мл). Также как и в опытах с ТЗ АГ – ВРАБЭ проводили раздельное культивирование Breg и спленоцитов мышей линии CBA/N (в трансвеллах). В качестве контрольных клеток использовали Вконтр, которые также как Breg вносили в верхнюю камеру (получение Вreg и Вконтр см. в разделе 4.2.3.). Данные представлены на рисунке 17. На графиках указаны приросты числа АОК и ИГОК, индуцированные LPS, которые рассчитывали как разность между их средними значениями в клеточных культурах при добавлении АГ и без него.
Как видно из данных, представленных на рисунке 17, Вконтр влияли в основном на количество АОК – их число возрастало в 2 раза, число ИГОК менялось незначительно. Напротив Вreg оказывали влияние на образование как АОК, так и ИГОК: прирост числа АОК снижается в 2 раза, а ИГОК в 6 раз. Таким образом, Вreg угнетали специфический и поликлональный ответ на ТН-1 АГ – LPS в системе in vitro.