Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Влияние структурной организации коллагенового материала, используемого для регенерации соединительной ткани, на М1/М2-поляризацию макрофагов Калмыкова Нина Владимировна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Калмыкова Нина Владимировна. Влияние структурной организации коллагенового материала, используемого для регенерации соединительной ткани, на М1/М2-поляризацию макрофагов: диссертация ... кандидата Биологических наук: 14.03.09 / Калмыкова Нина Владимировна;[Место защиты: ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации], 2018.- 158 с.

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы 14

1.1. Внеклеточный матрикс: структура, свойства и функции 14

1.2. Децеллюляризированный ВКМ 15

1.3. Применение очищенного ВКМ в медицине 20

1.4. Регенерация, репарация, процесс заживления ран 21

1.4.1. Регенерация и репарация 21

1.5. Ответ организма хозяина на введение очищенного ВКМ 27

1.6. Роль Мф в заживлении ран 30

1.6.1. Роль Мф в процессе заживления ран 30

1.6.3. Роль Мф М1 в заживлении ран 34

1.6.4. Роль Мф M2 в заживлении ран 35

1.7. Конструктивное ремоделирование 36

1.8. Th1 / Th2 ответ на биоматериалы при имплантации 38

1.9. Роль Мф M1 и M2 в РИТ 40

1.10. Поляризация Мф, зависящая от структурных свойств биоматериала 42

1.10.1. Топография поверхности биоматериалов 43

1.10.2. Пористость биоматериалов 46

1.11. Использование сигналов микроокружения для контролируемой 48

1.12. Заключение обзора литературы 49

2. Материалы и методы исследования 51

2.1. Очистка ВКМ и получение из него мембраны, порошка, суспензии и гидрогеля 51

2.1.1. Очистка ВКМ 51

2.1.2. Изготовление порошка ВКМ 52

2.1.3. Изготовление суспензии волокон ВКМ 52

2.1.4. Изготовление гидрогеля 53

2.2. Исследование структуры и свойств ВКМ в форме мембраны, порошка, суспензии, гидрогеля 53

2.2.1. Гистологическое исследование ВКМ 53

2.2.2. Сканирующая электронная микроскопия 54

2.2.3. Атомно-силовая микроскопия 55

2.2.4. Электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли 55

2.2.5. Количественное определение дцДНК в образцах очищенного ВКМ 56

2.2.6. Определение термомеханических свойств 56

2.3. Характеристика тканевой реакции при имплантации ВКМ 57

2.3.1. Подкожная имплантация порошка, суспензии, гидрогеля 57

2.3.2. Подкожная имплантация ВКМ в форме мембраны 58

2.3.3. Макроскопический анализ биодеградации 59

2.3.4. Гистологическое исследование образцов тканей 60

2.3.5. Характеристика тканевой реакции 60

2.4. Модель полнослойной кожной раны 63

2.4.1. Группа: суспензия, гидрогель 63

2.4.2. Группа: мембрана, порошок, гидрогель 65

2.5. Анализ маркеров Мф и Th-лимфоцитов 66

2.5.1. Иммуногистохимическое исследование 66

2.5.2. Анализ поляризации Мф по профилям М1 и М2 68

2.6. Статистическая обработка результатов 68

3.1. Общая схема работы 69

3.2. Очистка ВКМ и изготовление форм, соответствующих разным уровням организации 70

3.2.1. Очистка ВКМ 70

3.2.2. Получение форм, соответствующих разным уровням структурной организации ВКМ 77

3.3. Тканевая реакция на имплантацию исследуемых форм ВКМ 81

3.3.1. Имплантация ВКМ в форме порошка, суспензии и гидрогеля 81

3.3.2. Имплантация ВКМ в форме мембраны 92

3.4. Оценка влияния разных форм ВКМ на процесс заживления раны 95

3.4.1. Исследование форм: суспензия, порошок 95

3.4.2. Исследование форм: мембрана, порошок, гидрогель 101

3.5. Анализ маркеров Мф и Th-лимфоцитов 107

3.5.1. Исследование форм ВКМ: порошок, суспензия, гидрогель 108

3.5.2. Исследование форм ВКМ: суспензия, контроль 119

3.5.3. Исследование форм ВКМ: гидрогель, контроль 121

3.5.4. Исследование форм ВКМ: мембрана, контроль 122

4. Обсуждение 127

5. Заключение 135

7. Список литературы 138

Приложение 157

Данные анализа тканевой реакции 157

Введение к работе

Актуальность работы

Макрофаги (Мф) представляют собой гетерогенную популяцию клеток

иммунной системы, выполняющую разнообразные функции и

присутствующую в большинстве тканей организма. Данные клетки играют

центральную роль в регуляции многих биологических процессов,

включающих, поддержание тканевого гомеостаза, защиту от вторгающихся

патогенов, а также гистогенез и репаративную регенерацию тканей. В

физиологических условиях резидентные Мф принимают участие в

обеспечении гомеостаза путем выделения факторов, стимулирующих

процессы физиологической регенерации, а также фагоцитируя

апоптотические тельца погибших клеток. Однако при воздействии различных

стимулов микроокружения как тканевые Мф, так и мигрирующие из

кровотока моноциты, могут активироваться и поляризоваться в разные

функциональные фенотипы [Ariganello, 2011]. В настоящее время

общепризнано, что все фенотипическое разнообразие Мф можно

рассматривать как непрерывное множество [Mosser, 2008], состоящее из

нескольких различных функциональных состояний, каждый из которых

имеет свой уникальный профиль транскрипции генов [Gautier, 2012]. В

наиболее упрощенной форме выделяют два основных типа активации Мф:

классический (М1) и альтернативный (М2). Мф M1 выделяют оксид азота и

активные формы кислорода (ROS), которые являются цитотоксическими

медиаторами, помогающими бороться с инфекцией, а также различные

провоспалительные цитокины. Фенотип M2 подразделен на подкатегории

M2a, M2b и M2c, основываясь на их специфических функциях. Все три

подтипа обладают противовоспалительными свойствами, участвуют в

опосредовании Th-2 ответа и в ремоделировании внеклеточного матрикса

(ВКМ) [Mantovani, 2004]. Кроме того, Мф M2a и M2c также секретируют

факторы роста, которые способствуют ангиогенезу и регенерации тканей

[Jetten, 2014].

Мф обоих фенотипов играют важную роль в процессе репарации.
Переход от воспалительного типа ответа (M1 / Th1) к

противовоспалительному (M2 / Th2) проходит постепенно от ранних стадий
воспалительной фазы до поздних стадий пролиферативной. Пик активности
М1 Мф приходится на 1-2 сутки репаративного процесса, а М2 на 4-6. Таким
образом, переход от иммунной реакции 1 типа ко 2 типу отражает переход на
следующую стадию процесса репарации. Было показано, что

персистирование М1 Мф в области повреждения сопровождается развитием
длительно-незаживающих ран [Novak, 2014]. M2 Мф являются

доминирующим фенотипом на стадиях пролиферации и ремоделирования, однако могут быть причиной развития реакции на инородное тело, проявляющейся в формировании капсулы. Таким образом, при течение патологических процессов и восстановлении тканей после повреждения важное значение имеет соотношение М1/M2 субпопуляций и изменение его во времени.

Пластичность Мф проявляется в их способности изменять
фенотипическое состояние в ответ на постоянно меняющееся

микроокружение. Определенный характер фенотипической поляризации Мф
часто сопровождает различные физиологические и патологические состояния
[Lumeng, 2008]. Известно, что Мф играют важную роль в развитии
патофизиологических состояний, включающих рак, сердечно-сосудистые
заболевания, ожирение, заживление ран и реакцию на инородное тело.
Например, при развитии новообразований Мф M1 обладают

противоопухолевыми функциями, тогда как Мф M2 помогают опухолевым клеткам в уклонении от разрушения иммунными клетками хозяина и способствуют ангиогенезу, инвазии и метастазированию. Большинство опухолеассоциированных Мф принимают М2-подобный фенотип, и их присутствие в опухолях напрямую коррелирует с плохим прогнозом хода заболевания [Lewis, 2006]. Напротив, при атеросклерозе Мф M1 обычно

рассматриваются как атерогенные, в то время как Мф M2 рассматриваются как атеропротекторные.

Чтобы реализовать потенциал Мф в качестве терапевтической цели для
лечения различных патологий, требуется более глубокое понимание
воздействия факторов микроокружения на фенотипическую поляризацию
данных клеток. Одним из важнейших факторов является контакт клеток с
компонентами окружающего их внеклеточного матрикса (ВКМ). Основным
компонентом ВКМ соединительных тканей является коллаген I типа. Он
составляет около 30% всех белков организма. Принцип организации
коллагена иерархический: три альфа цепи образуют молекулу белка, которые
организуются в фибриллу, фибриллы формируют волокно, которые могут
образовывать пучки разных порядков. Пучки образуют трехмерную сеть
переплетающихся волокон, являясь каркасом ткани. Так, Мф, как и другие
клетки, постоянно контактируют с ВКМ, получая при этом множество
сигналов как химической, так и физической природы. Данные
взаимодействия, по-видимому, играют ключевую роль в реализации
репаративного действия различных медицинских изделий и препаратов,
изготавливаемых на основе очищенного от клеточных компонентов ВКМ
различных тканей. Однако вклад структурных особенностей биоматериалов в
их терапевтическую эффективность, опосредованную активацией,

пролиферацией, миграцией и дифференцировкой различных клеток остается до конца не охарактеризованным. Так был сформулирован фундаментальный вопрос: как структурная организация ВКМ влияет на профиль М1/М2-поляризации Мф. Проведено сравнительное исследование поляризации макрофагальных субпопуляций при подкожной имплантации различных инъекционных форм очищенного ВКМ у мелких лабораторных животных. В данной работе материалы на основе ВКМ были применены в следующих формах: порошка, суспензии, а также гидрогеля. Данные формы различаются степенью сохранности характера укладки волокон коллагена в их составе.

Так, ВКМ в форме порошка представлен частицами измельченных пучков

волокон коллагена. ВКМ в форме суспензии состоит из механически диспергированных до фибриллярного уровня коллагеновых волокон. В свою очередь гидрогель представляет собой термически солюбилизированный матрикс.

Цели и задачи

Цель работы: установить влияние структурной организации коллагенового

материала, используемого для регенерации соединительной ткани, на

М1/М2- поляризацию макрофагов, и определить взаимосвязь профиля с

процессом заживления ран.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1)Подобрать методику получения очищенного коллагенового материала.

2)Подобрать способ получения форм, соответствующих разным уровням

организации коллагена I типа: тканевой, пучкам волокон, волокнам и

пептидам.

3)Исследовать тканевую реакцию при подкожной имплантации разных

уровней организации коллагена I типа

4)Проанализировать профиль поляризации макрофагов в зоне имплантации

путем полуколичественного анализа панмакрофагальных, М1 и М2 маркеров,

а также цитокинов Th1 и Th2 иммунного ответа.

5)Провести исследование влияния разных уровней организации коллагена I

типа на процесс заживления полнослойных кожных ран.

Научная новизна и практическая значимость работы

Научная новизна работы обусловлена, во-первых, проведением оценки профиля поляризации Мф на модели исследования, основанной на сравнении разных уровней организации фибриллярного компонента ВКМ, а именно коллагена I типа. Благодаря этому удалось установить, что уровень организации коллагена I типа, определяет поляризацию Мф в М1 и М2 фенотип: тканевая организация стимулирует смешанный тип ответа с равным

соотношением М1 и М2 Мф, а пучки волокон, волокна и пептиды стимулируют ответ со значительным преобладанием М2 Мф. Также удалось выявить, что волокна подавляют выработку IFN иммунокомпетентными клетками в области раневого дефекта, а пучки волокон, наоборот, стимулируют выработку IFN, а также IL-6, при этом выявлено, что увеличение уровня экспрессии IFN в области репарации ассоциировано с ингибированием роста грануляционной ткани. Во-вторых, в рамках работы впервые разработана новая форма очищенного фибриллярного компонента ВКМ, а именно суспензия волокон.

Практическая значимость исследования заключается в том, что показана
возможность использования биоматериалов, представляющих собой разные
уровни организации внеклеточного матрикса, в различных клинических
случаях для замещения тканевого дефекта (подтверждено актом о внедрении
ФГБУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и
репродуктологии им. Д.О. Отта»). Также была разработана суспензионная
форма волокнистого компонента ВКМ. Показано ее положительное влияние
на процесс заживления ран, посредствам стимуляции образования
грануляционной ткани. Было показано, что данная форма сдвигает профиль
поляризации Мф в преобладание М2 фенотипа на всех этапах репаративного
процесса. По результатам разработки оформлен патент РФ №2627844. 2017.
Бюл. № 23 (подтверждено актом о внедрении ООО

«БиоФАРМАХОЛДИНГ»).

Методы исследования

В ходе выполнения диссертационной работы использован комплекс физико-химических, микроскопических, гистологических, молекулярно-биологических, иммунохимических методов исследования. Очистка ВКМ была произведена общелабораторными методами. Для оценки свойств полученного ВКМ были проведены исследования, с применением

термомеханических методов. Структурные исследования были проведены с

применением методов световой, сканирующей и атомно-силовой

микроскопии. Уровень регенерации оценивался на нескольких уровнях. Оценку на органном уровне осуществляли с применение макроскопических методик, таких как оценка площади ран на макро и микрофотоснимках, оценка резорбции материалов. На тканевом уровне оценку регенерации проводили методом прямого подсчета клеточных популяций с применением методов микроскопии. Оценка профиля поляризации Мф и Th-Лф оценивалась на клеточном уровне с применением иммуногистохимического анализа.

Личный вклад автора

Автор принимал непосредственное участие в проведении исследований, в анализе, трактовке и обсуждении полученных данных, написании и оформлении работы. Все исследуемые образцы фибриллярного компонента внеклеточного матрикса были изготовлены автором. Все иммунологические и морфологические исследования были проведены автором самостоятельно. Обработка дермы кожи быка домашнего для получения очищенного внеклеточного матрикса проведена совместно с сотрудниками лаборатории медиаторов и эффекторов иммунитета ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи». Микроскопические исследования внеклеточного матрикса проводили совместно с сотрудниками лаборатории медиаторов и эффекторов иммунитета и сотрудниками лаборатории анатомии микроорганизмов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» под руководством д.м.н. Л.В. Диденко.

Положения, выносимые на защиту

1. Выявлено, что уровень структурной организации коллагена I типа,

определяет поляризацию макрофагов в М1 и М2 фенотип: тканевая организация стимулирует смешанный тип ответа с равным соотношением М1 и М2 макрофагов, а пучки волокон, волокна и пептиды стимулируют ответ со значительным преобладанием М2 макрофагов.

  1. Показано, что волокна подавляют выработку IFN иммунокомпетентными клетками в области раневого дефекта, а пучки волокон, наоборот, стимулируют выработку IFN, а также IL-6, при этом выявлено, что увеличение уровня экспрессии IFN в области репарации ассоциировано с ингибированием роста грануляционной ткани

  2. Показано, что при оценке количества активированных макрофагов предпочтительнее использовать в качестве пан-маркера CD68, а не F4/80.

  3. Впервые разработана новая форма очищенного фибриллярного компонента внеклеточного матрикса, а именно суспензия волокон.

  4. Разработана модель исследования влияния уровня организации фибриллярного компонента внеклеточного матрикса, а именно коллагена I типа, на миграцию, активацию и поляризацию клеток миелоидного ряда-провоспалительных (М1) и противовоспалительных макрофагов (М2).

Апробация работы

Результаты проведенных исследований были представлены в виде стендовых докладов и тезисов на российских и международных конференциях: на XVI Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». (Санкт-Петербург – 2017); I Калининградском научном форуме (Калининград – 2016); III Национальном конгрессе по регенеративной медицине (Москва –2017).

Апробация диссертации состоялась 19.12.2017 г. на совместной научной конференции Отдела иммунологии и Отдела интерферонов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (Протокол № 2).

Публикации

Результаты диссертации опубликованы в 6 печатных работах, из них: статьи в журналах, рекомендованных ВАК - 2; патент Российской Федерации

на изобретение – 1; доклады и тезисы на международных и всероссийских конференциях – 3.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: список используемых сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы и приложение. Работа изложена на 158 страницах, содержит 47 рисунков и 21 таблицу.

Регенерация и репарация

Под регенерацией понимают процесс обновления и восстановления тканей. Регенерация также может быть физиологической, если она не связана с повреждением, а лишь является частью нормальной жизнедеятельности организма, при котором постоянно обновляются клетки и ткани. Так, за день в организме человека погибает около 1,2 кг клеток и столько же восстанавливается вновь, а в течение всей жизни это количество доходит до 20 тонн. Регенерация может быть репаративной, по-другому репарация, если она происходит в случае повреждения целостности органа или ткани и направлена на ее восстановление. Репарация может проходить по двум путям: реституция и субституция. При реституции происходит полное восстановление первоначальной ткани, а при субституции новообразованная ткань не идентична первоначальной и представлена рубцовой тканью. Также регенерация может быть патологической, если процесс восстановления поврежденных тканей нарушен. При этом возможна гиперрегенерация, гипорегенерация и метаплазия. При гиперрегенерации не образуется достаточного количества ткани, при гиперрегнерации, наоборот, образуется избыточное количество ткани. При метаплазии происходит процесс замещения ткани на родственную.

Важно отметить, что способностью к истинной реституции после повреждения или утери ткани обладают многие представители царства животных. Самые наглядные примеры- восстановление хвоста у ящериц Lacertilia или полное восстановление целого организма из небольшого фрагмента у гидры Hydra. Что касается человека, то к истинной реституции способны только эндометрий [Gargett, 2012], костная ткань, печень, почки [Song, 2013] и кончики пальцев (до первой фаланги). Остальные ткани не могут истинно регенерировать или нуждаются в дополнительных стимулирующих факторах. Исследования по открытию данных факторов и путей их воздействия сейчас активно ведутся в области регенеративной медицины.

На данном этапе развития науки наибольшее соприкосновение с прикладной медициной все же имеет область репаративной регенерации с образование замещенной ткани, то есть субституция. Субституция - относится к типу заживления, при котором поврежденные или нерегенерирующие ткани восстанавливаются путем укладки новой соединительной ткани. В то время как некоторые мелкие повреждения без потери тканей иногда могут заживать первичным натяжением, таким образом, что никакого постоянного повреждения не остается, большая часть травм приводит к формированию рубца. При репарации могут восстанавливаться некоторые из первоначальных структур поврежденной ткани (например, эпителиальный слой), но полного структурного восстановления не происходит, что может привести к нарушению функции органа (например, шрам, образованный при инфаркте миокарда).

Пойдет ли репарация по пути реституции или субституции зависит, в первую очередь, от ткани. Некоторые ткани организма обладают большим потенциалом к клеточной пролиферации (и, следовательно, к регенерации), чем другие. В связи с этим существуют три типа тканей: непрерывно пролиферирующие ткани, покоящиеся ткани и непролиферирующие ткани. Непрерывное пролиферирующие ткани (также известных как лабильные ткани, или стабильные) состоят из клеток, которые постоянно делятся, чтобы заместить погибшие клетки. Примерами таких тканей являются эпителий (такие как кожа, желудочно-кишечный эпителий и ткань слюнной железы) и гемопоэтические ткани. Эти ткани содержат пулы стволовых клеток, которые обладают огромной пролиферативной способностью.

Ассиметричная репликация, при которой каждая стволовая клетка порождает две дочерние клетки, одна из которых дифференцирует и созревает, а другая остается недифференцированной и будет участвовать в следующем цикле обновления ткани. Некоторые ткани, известные как лабильные ткани, состоят из клеток, которые обычно существуют в не делящемся состоянии, но могут входить в клеточный цикл в ответ на определенные раздражители, такие как повреждение клеток. Ткани, попадающие в эту категорию, включают паренхиматозные клетки печени, почек и поджелудочной железы, мезенхимальные клетки, такие как фибробласты и клетки гладкой мускулатуры, эндотелиальные клетки и лимфоциты. Следует отметить, что печень, в отличие от других покоящихся тканей, обладает относительно устойчивой пролиферативной способностью. Когда долю печени иссекают, например, для трансплантации донору, оставшиеся клетки печени размножаются с такой скоростью, чтобы печень достигла такого размера, который был до резекции, то есть наблюдается гипертрофия, а не гипертрофия. Хотя этот процесс обычно описывается как регенерация, он более точно рассматривается как компенсаторный рост, поскольку первоначальная доля не восстанавливается. Есть несколько тканей, которые не могут регенерировать вообще, так как клетки в их составе не могут пролиферировать, следовательно, при повреждении таких тканей всегда формируется фиброзная ткань [Laflamme, 2005]. К таким тканям относятся сердечная и скелетные мышцы. 1.4.2. Заживление ран

Процесс заживления ран относится к субституции и его результатом является формирование рубцовой ткани. Цель заживления ран - это как можно быстрее восстановить целостность органа. В проекции на кожные раны- это как можно быстрее восстановить барьерную функцию, а именно закрыть дно раны грануляционной тканью и сформировать эпителий, и лишь затем постепенно ремоделировать соединительно-тканные волокна. Весь процесс заживления раны представляет собой сложный скоординированный процесс, разделенный на четыре этапа: гемостаз, воспаление (иногда гемостаз относят к этапу воспаления) пролиферация, ремоделирование (Рисунок 2) [Gosain, 2004; Gonzalez, 2016].

Все этапы заживления раны проходят в строгой последовательности и занимают определенное время [Stein, 2013; Sun, 2014]. Инициацией процесса заживления служит контакт тромбоцитов с фибриллами коллагена в составе поврежденных стенок сосудов или внеклеточного матрикса соединительной ткани. Таким образом, начало процесса -это сворачивание крови. В течении нескольких минут после повреждения, тромбоциты, находящиеся в крови, начинают прикрепляться в месте повреждения. При этом тромбоциты активизируются, что вызывает возникновение нескольких явлений. Они приобретают аморфную форму, более приспособленный к процессу сворачивания и подают химические сигналы, способствующие дальнейшему свёртыванию. Это приводит к активизации фибрина, который образует сетку и играет роль клея, связывая тромбоциты друг с другом. При этом образуются тромбы, которые перекрывают разрывы кровеносных сосудов, предотвращая дальнейшее кровотечение (Рисунок 3) [Chow, 2014; Rasche, 2001; Versteeg, 2013; Stein, 2013]. (Рисунок 3) [Chow, 2014; Rasche, 2001; Versteeg, 2013; Stein, 2013].

Затем начинается этап воспаления, во время которого повреждённые и мёртвые клетки вычищаются, наряду с бактериями, болезнетворными микроорганизмами и дебрисом. Это происходит посредством процесса фагоцитоза. Также на этом этапе в рану выделяются тромбоцитарные факторы роста, стимулирующие миграцию и деление клеток во время пролиферативной фазы. Следующий этап-пролиферация. На этом этапе происходит рост новой ткани: ангиогенез, отложение коллагена, формирование грануляционной ткани, эпителизация и сокращение раны, то есть контракция [Midwood, 2004]. Грануляционная ткань представляет собой новый тканевой матрикс, который заполняет всю поверхность раны.

Характеристика тканевой реакции

Образцы иссеченных участков кожного лоскута, содержавших имплантированный образец, фиксировали 10% формалином на фосфатном буфере (pH 7,2) (Россия, Биовитрум) в расправленном состоянии в течение 24-х часов. Ткани обезвоживали по стандартной методике и заливали в заливочную среду на основе парафина Histomix Extra (Россия, Биовитрум). На микротоме Microm HM 325 (США, Thermo Scientific) изготавливали гистологические срезы толщиной 3 мкм. Срезы монтировали на предметные стекла. Для общеморфологического исследования срезы кожи и лимфатических узлов окрашивали гематоксилином и эозином и заключали под покровное стекло в заливочную среду Bio-Mount (Италия, Bio Optica).

Для проведения морфометрического исследования получали микрофотоснимки срезов с помощью камеры Leica DFC295 (Германия, Leica) на микроскопе Leica DM1000 (Германия, Leica).

На микрофотографиях при помощи программы imageJ измеряли в мм2 площадь, занимаемую грануляционной тканью на срезе. Для оценки скорости регенерации эпидермиса рассчитывали в % степень эпителизации раневой поверхности, как отношение измеренных на срезе суммарной длинны пластов регенерирующего эпидермиса и общей протяженности поверхности раневого дефекта.

Для характеристики клеточного инфильтрата и тканевых реакций в зоне введения препаратов применяли полуколичественные системы оценки, описанные в ГОСТ ISO 10993-6-2011, приложение Е (Таблица 4, Таблица 5). При этом характеризовали соединительную ткань, располагающуюся между panniculus carnosus и имплантатом. Если же фрагменты введенного материала на срезе не выявляли, то анализировали соединительную ткань под panniculus carnosus в произвольных участках среза области введения. Дополнительно полуколичественно оценивали выраженность отека соединительной ткани (Рисунок 10) вокруг имплантата или в зоне его введения (в случае отсутствия его фрагментов на срезе). Исследовали по два среза каждой области имплантации, на каждом из которых анализировали по три поля зрения при увеличении микроскопа 400х. Таким образом, для каждого животного оценивали 12 полей зрения.

Для анализа раздражающего действия применяли систему по ГОСТ ISO 10993-6–2011. Данная система заключается в суммировании для каждой исследуемой группы средних баллов всех показателей (Таблица 4), с последующим умножением этой суммы на 2. Получившееся значение суммируется с суммой средних баллов из Таблица 5. Из окончательной суммы опытного образца вычитается окончательная сумма, полученная для контрольного образца. Исходя из величины полученной разности, выносится заключение о признании исследуемого образца не раздражающим (0,0 – 2,9), легким раздражителем (3,0 – 8,9), умеренным раздражителем (9,0 – 15,0), тяжелым раздражителем ( 15) по сравнению с контрольным образцом.

Очистка ВКМ

Обработка щелочными растворами известна как одна из наиболее эффективных методик очистки ВКМ из плотных волокнистых соединительных тканей [Кеапе, 2015]. Проведено сравнительное исследование влияния простой и многокомпонентной методик щелочной очистки ВКМ на его основные морфологические, биохимические и термомеханические свойства. В качестве однокомпонентного метода применяли обработку раствором 1М NaOH. Ранее применение данного раствора в сочетании с обработкой трипсином было успешно использовано для очистки соединительной ткани [Zhang, 2009]. В качестве многокомпонентного сложного метода использовали методику [Патент № 2353397 РФ], включающую (1) обработку фрагментов ткани слабощелочным раствором 0,35 М NaOH, (2) обработку фрагментов ткани высокощелочным раствором 1,25М NaOH и 1,5М Na2SО4, обработку слабокислыми растворами (3) 1,3 М Na2SO4 и (4) 1 М HЗВОЗ. Подобранная методика очистки ткани оказалась более эффективной в сравнении с классическим методом простой щелочной обработки. Особенность данной методики заключалась в добавлении соли сульфата натрия после обработки щелочью для уменьшения набухания волокон.

Согласно данным литературным, чаще всего в качестве источника ВКМ используют ксеногенную дерму кожи, перикард и ПОСК [Cornwell, 2009]. В настоящей работе в качестве источника был выбран сетчатый слой дермы кожи быка домашнего Bos taurus в связи с простотой его получения и доступностью. При работе с дермой из других источников, отмечалось менее ровное распределение слоев дермы и хаотичное расположение волосяных луковиц, что затрудняло очистку на предварительных стадиях. В дерме быка таких сложностей не отмечалось.

Гистологическое исследование образцов ВКМ не выявило наличия в них клеток или же клеточных фрагментов как после многокомпонентной, так и после однокомпонентной щелочной очистки (Рисунок 12, Рисунок 13).

Морфологический анализ двух групп показал, что ВКМ, полученный многокомпонентным способом в большей степени сохраняет структуру тяжей волокнистого компонента.

Литературные данные свидетельствуют о том, что наличие остаточных клеточных фрагментов в очищенном ВКМ при его имплантации может способствовать развитию РИТ [Keane, 2012]. Так, среднее значение содержания дцДНК в образцах составило соответственно 13,1 и 7,2 нг/мг сухой массы (Рисунок 14). В то же время, количество дцДНК в сетчатом слое дермы до очистки ВКМ составило в среднем 3295 нг/мг сухой массы (данные не представлены). Стоит отметить, что не существует четко документированных требований по максимально допустимому количеству остаточной дцДНК в составе материалов, применяемых в клинической практике. Однако, после проведения ряда исследований по оценке РИТ при имплантации материалов с разным содержанием остаточной дцДНК, было принято правило, что содержание остаточной дцДНК не должно превышать 50 нг/мг сухой массы материала [Crapo, 2011; Gilbert, 2009]. домашнего (а) и ВКМ группы 2 (б). Окраска по Ван-Гизону. Синими стрелками обозначены пучки коллагеновых волокон, желтыми – фиброциты.

Таким образом, результаты как биохимического, так и гистологического исследования свидетельствуют об эффективности удаления клеток и их компонентов из ВКМ дермы кожи обоими методами. Также, статистический анализ полученных результатов позволил выявить достоверное снижение количества дцДНК в ВКМ, очищенном многокомпонентным методом по сравнению с однокомпонентным. Это свидетельствует о более эффективном удалении остаточных клеточных компонентов. Известно, что высокая ионная сила раствора способствует диссоциации белков и ДНК [Cox, 2006]. В связи с этим, можно сделать предположение, что наблюдаемое снижение количества остаточной дцДНК может быть обусловлено повышением ионной силы растворов за счет внесения в них сульфата натрия.

Анализ результатов электрофоретического разделения полученных образцов очищенного ВКМ в ПААГ в денатурирующих условиях (Рисунок 15) показал наличие на электрофореграммах полос, характерных для димеров ( полоса - ocloc2 или a loci) и мономеров молекул а цепей тропоколлагена (осі и осг полосы), возникающих при разделении коллагена I типа [Deyl, 2000]. Полученные данные свидетельствуют о значительном преобладании данного белка в ВКМ, очищенном при помощи обеих методик. Кроме того, в обоих случаях электрофореграммы указывают на отсутствие значительного гидролиза цепей, составляющих молекулы тропоколлагена. Таким образом, используемые методы щелочной децеллюляризации обеспечивают сохранение целостности цепей основного структурного белка ВКМ сетчатого слоя дермы.

Анализ боковых поверхностей срезов исследуемых образцов методом СЭМ показал «разрыхления» сети волокон ВКМ после однокомпонентной очистки в большей степени относительно многокомпонентной (Рисунок 16).

Морфологическая структура ВКМ, очищенного обоими методами, была представлена разнонаправленными тяжами пучков коллагеновых волокон, толщина которых значительно варьировала в диапазоне от 10 до 300 мкм. В образце ВКМ, очищенном многокомпонентным методом, в составе тяжей были хорошо различимы волокна диаметром 1-10 мкм (Рисунок 16), что соответствует диаметру волокон коллагена [Ushiki, 2002; Shoulders, 2009].

Морфометрическое исследование верхней поверхности образцов ВКМ методом СЭМ позволило визуализировать отдельные коллагеновые волокна в составе образца ВКМ после многокомпонентной очистки (Рисунок 17), тогда как пучки в составе ВКМ после однокомпонентной очистки имели преимущественно аморфную структуру (Рисунок 17). Анализ СЭМ-микрофотографий верхней поверхности образцов ВКМ позволил выявить значительные отличия между двумя экспериментальными группами по размерам и количеству пор в материале. Так, средняя величина диаметра пор в образцах, обработанных многокомпонентным методом (79,9 мкм), была более чем в 2 раза меньше, чем в образцах, обработанных однокомпонентным методом (218,6 мкм), а количество пор на единицу площади, наоборот – в среднем в 2 раза больше (Рисунок 14). Согласно данным литературы жизнеспособность клеток, выращиваемых на матриксах с меньшим диаметром пор, больше. Так было показано, что оптимальным является размер пор около 60 мкм [O Brien, 2004].

Исследование форм ВКМ: порошок, суспензия, гидрогель

Результаты подсчета и первичного анализа данных для групп порошок, суспензия, гидрогель и контроль представлены в Таблица 10. Суммарные данные по всем статистически значимым отличиям по экспрессии маркеров среди групп представлены в Таблица 11. Данные по оценке динамики изменения экспрессии маркеров приведены в Таблица 12.

Было вычислено соотношение M1/M2 для всех групп, на всех сроках исследования и для всех маркеров. Так как в работе применялось иммуномечение по двум маркерам для каждой группы, то отношение вычисляли для каждой пары маркеров: CD80/CD163, CD80/CD206; CCR7/CD163, CCR7/CD206. Первичные данные анализа соотношения М1/М2 представлены в Ошибка! Источник ссылки не найден..

С применением критерия Краскела-Уоллиса и Манна-Уитни была оценена динамика соотношения М1/М2 маркеров как в рамках одного срока (Опытные группы - Контроль), так и в рамках одной пары сравнения (М1/M2 в одной группе на 1 и 5 сутки). Все достоверно значимые отличия по выявлению динамики во времени в рамках одной группы представлены в Таблица 13.

При сравнении соотношения М1/М2 между группами было выявлено только одно достоверное отличие: в паре маркеров CD80/CD163 на первые сутки после имплантации в соединительной ткани соотношение M1/M2 было меньше в группе «Порошок», чем в группе «Гидрогель». Остальные все множественные сравнения не привели к выявлению отличий между группами.

При анализе данных, полученных методом ИГХ, обращались к результатам тканевой реакции. Так, при оценке тканевой реакции, а именно инфильтрации Мф в ответ на имплантацию, отличие от контроля было выявлено у групп «Порошок», «Суспензия» и «Гель» на 5 сутки, а на 1 сутки все группы и опытные и контрольные были примерно на одном уровне значений. В этом опыте в качестве маркера использовали F4/80. Данные из опыта по оценке поляризации подтверждают это, а именно отсутствие каких-либо отличий между группами по маркеру F4/80. Но, на этом же сроке подсчет по маркеру CD68 показал два достоверных отличия опытных групп («Порошок» больше в среднем в 10 раз, а «Суспензия» в 6 раз) относительно контроля (Таблица 11). Именно формы, используемые в этих группах, на первых сутках в опыте по оценке тканевой реакции оказывали легкое раздражающее действие. К тому же было неясно, почему 2 классических пан-макрофагальных маркера демонстрируют разные результаты (Рисунок 45). Предположительно это могло быть связано с корреляцией степени активации или поляризации Мф и экспрессией данных маркеров. Оказалось, что в литературе имеются данные, что CD68 является маркером активированных Мф как резидентных так и рекрутированных [Kim, 2017], а F4/80 экспрессируется на достаточно высоком уровне только в резидентных клетках [Gordon, 2014; Wu, 2013]. Несмотря на это и CD68 и F4/80 широко применяются как пан-макрофагальные маркеры [Murray, 2011]. Более того, экспрессия F4/80 может меняться под воздействие множества факторов, в том числе ингибироваться под действием IFN [de Visser, 2005]. Все эти данные говорят о том, что для оценки количества активированных Мф следует использовать маркер CD68, F4/80 использовать для оценки тканевых локальных реакций.

Более того, в литературе имеются данные, что CD68 экспрессируется не только на клетках миелоидного происхождения [Gottfried, 2008; Kunz-Schughart, 2003]. Авторы сравнивали экспрессию белка комплекса CD68 и его мРНК в фибробластах и моноцитах/макрофагах с методами ИГХ, ПЦР с обратной транскрипцией и проточной цитометрии. Выяснилось, что фибробласты, выделенные из нормальной кожи, нормальной ткани молочной железы, ткани опухоли молочной железы и воспалительного выпота при остеоартрите, экспрессировали белок CD68 на уровнях, сравнимых с Мф. Это очень важно для экспериментальных и диагностических целей, поскольку антитела против CD68 используются как общепринятые идентификации Мф. Также есть данные об экспрессии CD68 на поверхности CD19+ B лимфоцитов и CD4+ T лимфоцитов, конечно, на гораздо более низком уровне, чем на макрофагах [Chistiakov, 2017]. Инфильтрация лимфоцитами при введении суспензии и порошка была выше, чем у контрольной группы. Таким образом, возможен также вклад лимфоцитов и фибробластов при подсчете маркера CD68.

Сведения о том, что F4/80 является маркером в основном резидентных Мф, позволяет переформулировать заключение о тканевой реакции на имплантацию очищенного ВКМ. На первые сутки суспензия и порошок в большей степени рекрутировали Мф, нежели чем гидрогель и контроль. А на резидентные Мф на первые сутки никакая группа значительного влияния не оказывала. На пятых сутках порошок в большей степени, чем контроль активировал и рекрутированные и резидентные Мф.

Необходимо также учитывать, что при анализе временной динамики количества пан-макрофагальных маркеров (Таблица 12) было выявлено их снижение от 1 к 5 суткам. Так их количество в дерме во всех группах достоверно уменьшалось к 5 суткам, то есть вся реакция на имплантацию приобретала локальный характер. Это заключение подтверждает и результаты оценки раздражающего действия, при котором на 5 сутки ни одна форма не оказывала такового. При сравнении соединительной ткани на 1 и 5 сутки при имплантации порошка не было выявлено достоверных отличий, то есть порошок поддерживает макрофагальный ответ на стабильном уровне как на ранних, так и на поздних этапах реакции. В группе, где вводили гидрогель и суспензию, к пятым суткам уменьшалось количество Мф по маркерам F4/80 и CD68 соответственно.

Суммарно картина иммуномечения Мф говорит о том, что исследуемые формы ВКМ в форме порошка и суспензии на 1 сутках стимулируют активацию Мф как в соединительной ткани, так и в дерме, а порошок продолжает поддерживать активированный уровень Мф и на 5 сутки.

Среди важных результатов также необходимо отметить, что суспензия - это единственная форма, в которой наблюдалась достоверная разница с контролем по маркеру М1 профиля CCR7.

IFN является маркером провоспалительного иммунного ответа. Он участвует сразу в нескольких путях активации: он стимулирует дифференцировку Мф в М1 фенотип, затем он секретируется М1 Мф создавая перекрестную активацию с Th1-лимфоцитами и ингибирует Th2 ответ. Такая реакция происходит при нормальном процессе репарации и уровень экспрессии при этом должен снижаться во времени, чтобы весь процесс переключился на Th2 путь. Единственная группа, которая продемонстрировала достоверное снижение выработки IFN во времени это суспензия (Рисунок 46, Таблица 12). Это может означать, либо что в данной группе на первых сутках экспрессия была завышена, либо на 5 сутках занижена, по сравнению с другими образцами, либо, третий вариант, во всех группах идет снижение экспрессии, но только в группе суспензии это снижение значимое. Так как уровень экспрессии IFN в группе суспензии не отличался от других групп на 1 и 5 сутках, то возможным остается только третий вариант. Обращаясь к первичным данным (Таблица 10) видно, что экспрессия снижается почти в 10 раз. При оценке реакции окружающих тканей, то есть дермы, выявлено, что уровень снижается от 1 к 5 суткам в контроле. Но при оценке экспрессии маркеров видно, что даже это сниженное значение больше, чем в группе суспензии. Следовательно, можно заключить, что суспензия вызывает локальное снижение выработки IFN на поздних сроках воспалительного этапа заживления ран. Эти данные соотносятся с данными литературы, где было показано, что Мф, высаженные на поверхность, покрытую фибриллами диаметром около 2 мкм снижают выработку IFN [McWhorter, 2015].

IL-6 - многопрофильный маркер. С одной стороны, он является одним из ключевых цитокинов иммунного пути 1 типа [Diehl, 2002; Tidball, 2010], а с другой стороны он экспрессируется и М2b Мф. Также известно, что IL-6 обладает хемоаттрактантными свойствами и привлекает моноциты и Мф в область раны. Показано, что блокировка IL-6 в рамках процесса репарации приводит к тому, что весь процесс в целом не запускается [Brown, Ratner, 2012]. Следовательно, его экспрессия необходима для инициации определенного уровня воспаления. Таким образом значение экспрессии данного маркера должно коррелировать с F4/80 и CD68 (маркером активированных Мф). Но результаты проведенного эксперимента выявляют только рост экспрессии IL6 к 5 суткам в группе порошка относительно контроля и гидрогеля. При этом результаты оценки тканевой реакции говорят о том, что к 5 суткам в этой группе наоборот снижается раздражающее действие в целом. А оценка динамики маркеров во времени показывает уменьшение суммарного количества Мф к 5 суткам (Таблица 12). Можно предположить, что тот IL-6, который увеличивает количество этого маркера к 5 суткам, экспрессируется М2 Мф. В пользу этого предположения говорит общий характер поляризации Мф: фенотип М2 преобладает на всех этапах эксперимента во всех опытных группах. Увеличение экспрессии относительно контрольной группы было выявлено у суспензии на 5 сутки в соединительной ткани (Таблица 14). Делать заключение на основании экспрессии данного маркера не предоставляется возможным, ввиду неоднозначности полученных результатов. Для верной интерпретации уровня экспрессии IL-6 необходимо провести дополнительное исследование по маркеру IL-10, который является однозначным цитокином M2 Мф, а также IL-4, который является цитокином, обуславливающим взаимодействие Th2 лимфоцитов и М2 Мф.