Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Краткая история иммуноферментного анализа (ИФА) 11
1.1.1. Изобретение радиоиммунологического анализа (РИА) 11
1.1.2. Возможность использования ферментной метки в иммунохимическом анализе 12
1.1.3. Открытие способа получения моноклональных антител методом слияния клеток 14
1.1.4. Краткий обзор последних достижений и дальнейшего развития иммуноферментного анализа 18
1.2. Особенности иммунохимических процессов в «классических» твердофазных ИФА 25
1.2.1. Скорость реакций 26
1.2.2. Формирование монослоя иммобилизованных молекул на твердой фазе 27
1.2.3. Вопрос о прочности прикрепления молекул к твердой фазе и друг к другу в твердофазных ИФА 29
1.2.4. Образование прочных циклических иммунных комплексов в сэндвич-методе 32
1.2.5. Иммунохимические факторы, определяющие аналитическую чувствительность твердофазных ИФА 32
1.2.6. Проблема инактивации антител при пассивной адсорбции на твердой фазе 37
Глава 2. Методы исследований и использованные материалы 43
2.1. Использованные материалы 43
2.2. Методы исследований 43
2.2.1. Получение гибридом - продуцентов моноклональных антител 43
2.2.2. Определение антигенсвязывающей активности моноклональных антител с антигеном, адсорбированным на поверхность планшетов из полистирола 44
2.2.3. Очистка моноклональных антител с помощью ионообменной хроматографии 45
2.2.4. Определение белка 45
2.2.5. Приготовление конъюгата р24ВИЧ с LC-LC-биотином 45
2.2.6. Адсорбция антител на поверхность планшетов для определения антигенсвязывающей активности антител 46
2.2.7. Определение оптимального рН адсорбции тестируемых антител 46
2.2.8. Определение оптимальной концентрации антител в адсорбционных растворах при иммобилизации моноклональных антител на поверхность планшетов 46
2.2.9. Определение антигенсвязывающей активности иммобилизованных моноклональных антител 47
2.2.10. Количественное определение относительной антигенсвязывающей активности антител 47
2.2.11. Приготовление антител и HBsAg, меченных 125I 47
2.2.12. Определение концентрации 125I-HBsAg 48
2.2.13. Определение количества антител, адсорбированных на поверхности планшетов из полистирола 48
2.2.14. Радиоиммунологическое определение количества антител, сохранивших антигенсвязывающую активность после адсорбции 49
2.2.15. Конъюгация антител с флуоресцентным красителем Су5 50
2.2.16. Определение количества меченых Су5 моноклональных антител, иммобилизованных на поверхность планшетов при использовании адсорбционных буферов с различными значениями рН 50
2.2.17. Определение поверхностной концентрации иммунных комплексов, образованных при различных условиях адсорбции антител 51
2.2.18. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-ПААГ) 52
2.2.19. Статистическая обработка данных 52
Глава 3. Результаты исследований 53
3.1. Получение гибридом – продуцентов моноклональных антител к белку р24 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) 53
3.2. Очистка моноклональных антител и их характеристика 53
3.3. Оценка чистоты моноклональных антител 54
3.4. Отбор моноклональных антител, пригодных для анализа в качестве адсорбируемых 57
3.5. Определение оптимального рН адсорбции иммобилизуемых антител в условиях избыточной насыщающей концентрации 59
3.6. Подбор оптимальных насыщающих концентраций тестируемых антител при оптимальном рН адсорбции 60
3.7. Определение относительной антигенсвязывающей активности антител после адсорбции на поверхность планшетов (при оптимальной насыщающей концентрации антител в адсорбционном буфере) 64
3.8. Определение доли активных антител в общем количестве моноклональных антител, адсорбированных на поверхность планшетов 70
3.9. Определение количества антител, адсорбированных на поверхности полистироловых планшетов при различных рН с использованием меченых 125I антител 78
3.10. Определение количества антител, сохраняющих активность после адсорбции на поверхность полистироловых планшетов при разных значениях рН 81
Обсуждение. 89
Выводы 102
Список сокращений 103
Список литературы 104
- Открытие способа получения моноклональных антител методом слияния клеток
- Проблема инактивации антител при пассивной адсорбции на твердой фазе
- Подбор оптимальных насыщающих концентраций тестируемых антител при оптимальном рН адсорбции
- Определение количества антител, сохраняющих активность после адсорбции на поверхность полистироловых планшетов при разных значениях рН
Открытие способа получения моноклональных антител методом слияния клеток
Важнейшее значение для развития ИФА сыграло открытие и описание в 1975 году Келлером и Мильштейном методов получения моноклональных антител (МКА) с помощью гибридомной технологии [64]. Это открытие, за которое авторов наградили Нобелевской премией, во-первых, позволило решить задачу получения практически неограниченных количеств однородных антител. Кроме того, этот метод позволил получать МКА к отдельным (разным) эпитопам на молекуле белкового антигена. Последнее создало условия для конструирования сэндвич-методов определения антигенов – наиболее широко применяемого метода ИФА белковых молекул.
Принцип работы сэндвич метода в простейшем варианте изображен на рисунке 1. На поверхность твердой фазы (например, пластикового 96-лучного планшета) прикрепляют (путем адсорбции или другим способом) МКА, распознающие один из эпитопов анализируемого антигена (белка). В англоязычной литературе иммобилизованные антитела обычно называют «ловящими или улавливающими» («capture») антителами. После добавления образца, содержащего антиген, на поверхности твердой фазы образуются иммунные комплексы (ловящее антитело—антиген). После отмывок добавляют детектирующие МКА, направленные к другому эпитопу антигена. Эти антитела связаны с ферментом (чаще всего используют пероксидазу хрена). В результате образуются тройные комплексы («сэндвичи»), в которых молекула антигена оказывается "зажатой" между двумя молекулами МКА к разным эпитопам, при этом комплексы могут иметь различную конфигурацию, как линейную (рис. 1, а), так и циклическую (рис. 1, б, в). Для визуализации комплексов добавляют субстрат фермента, который дает цветную реакцию; интенсивность окрашивания регистрируется на спектрофотометре. Интенсивность реакции пропорциональна концентрации определяемого антигена в инкубационной смеси. Путем сравнения калибровочной кривой и сигнала в анализируемом образце определяют концентрацию тестируемого антигена. Системы ИФА, построенные по принципу сэндвич-методов, позволяют достигать более высокой чувствительности и специфичности (близкие к таковым для РИА), так как распознавание идет по двум различным эпитопам белковой молекулы, и, кроме того, при определенных условиях возможно образование циклических комплексов с более высокой авидностью (об этом подробнее сказано ниже, в разделе 2.2.4).
На основе гибридомной технологии развивается такое направление, как получение рекомбинантных антител [3]. Часто для этого в качестве основы используют ранее полученные моноклональные антитела, которым придают новые свойства. Например, часть молекулы мышиных МКА заменяют на последовательности человеческих антител («гуманизируют»), что делает МКА менее иммуногенными. Это важно с точки зрения применения подобных гибридных молекул в клинике.
Однако развивается и такое направление рекомбинантных технологий получения МКА, когда гибридомная стадия элиминируется. Например, недавно предложен следующий интересный метод «не гибридомной» технологии, позволяющий в течение 10 дней получать рекомбинантные МКА, причем без необходимости культивирования клеток в стерильных условиях [61]. Это метод включает следующие этапы [61]:
1) иммунизация животных (мышей, кроликов или кур) антигеном;
2) получение суспензии клеток иммунной селезенки;
3) обогащение суспензии иммунными лимфоцитами путем инкубации клеток с антигеном, которым насыщена поверхность 96-луночных планшетов: клетки прикрепляются к планшетам за счет реакции антител на их поверхности с антигеном;
4) отделение обогащенных иммунными лимфоцитами клеток от плашек, выделение из них нуклеиновых кислот, получение плазмид, содержащих различные сочетания легких и тяжелых цепей вариабельных и константных частей молекулы IgG;
5) кратковременная трансфекция полученными плазмидами культуры клеток китайского хомячка, растущей в 96-луночных планшетах, причем трансфекция производится таким образом, чтобы в каждую лунку попала примерно одна плазмида, что имитирует клонирование гибридом;
6) анализ культуральных супернатантов с помощью твердофазного ИФА с целью выявить лунку, в которой происходит экспрессия МКА к антигену;
7) использование обнаруженных трансфицированных клеток, экспрессирующих МКА нужной специфичности, для дальнейшего получения клона рекомбинантных антител.
а. Комплекс между одним антигенсвязывающим сайтом адсорбированных антител, антигеном и антигенсвязывающим сайтом детектирующих антител (ансамбль);
б. Циклический комплекс между двумя молекулами антигена, двумя антигенсвязывающими сайтами адсорбированного антитела и двумя антигенсвязывающими сайтами детектирующего антитела;
в. Циклический комплекс между двумя молекулами антигена, двумя антигенсвязывающими сайтами разных молекул адсорбированных антител и двумя антигенсвязывающими сайтами молекулы детектирующих антител.
Антиген условно разделен на два эпитопа. Предполагаемая ценность описанного метода заключается в принципиальной возможности получения МКА различной специфичности и структуры (включая полноразмерные молекулы) достаточно быстро (в течение 10 дней) без использования «классической» гибридомной технологии, занимающей значительно больше времени [61].
Проблема инактивации антител при пассивной адсорбции на твердой фазе
При адсорбции антител на поверхность пластиковых планшетов большинство молекул антител теряет свою активность [23, 82, 97]. Это было особенно подробно изучено в работах группы Батлера [21, 23, 24, 25]. Было обнаружено, что около 75% ПКА и более 90% МКА утрачивали свою биологическую активность после того, как их подвергали обычной для ИФА процедуре – пассивной адсорбции на поверхность пластиковых планшетов в карбонатном буфере (рН 9,6) [24, 25]. Поэтому Батлер даже подчеркнул в некоторых из своих обзоров, что процесс адсорбции антител на полистироловые поверхности в твердофазных ИФА – есть процесс их денатурации [23, 25]. Потеря активности антител может быть связана как с их денатурацией при соприкосновении с твердой фазой, так и "неправильной" ориентацией при адсорбции. Считается, что наиболее (если не единственной) эффективной ориентацией антител является их прикрепление к твердой фазе через Fc-конец, так чтобы вариабельные области были обращены в раствор, оставаясь свободными для улавливания антигена [30, 67, 80, 86]. Большой вклад в изучение ориентации молекул на твердой фазе вносят такие сравнительно новые методы, как атомно-силовая микроскопия и т.п. [5, 34, 56, 84, 100].
Гибкость молекул также может определять возможность образования высокоавидных циклических комплексов [55]. Поэтому важнейшим этапом работы в процессе конструирования твердофазной системы являются усилия, направленные на увеличение дозы активных и правильно ориентированных молекул антител на твердой фазе.
К счастью, в большинстве случаев сохраняющейся активности антител на твердой фазе оказывается достаточно для проведения анализов [23]. Но в ситуациях, когда нужна особо высокая чувствительность, проблема повышения доли активных антител встает особенно остро. С учетом фактора инактивации антител при пассивной адсорбции был предложен ряд альтернативных способов иммобилизации, направленных на увеличение доли биологически активных антител на твердой фазе. В основе их лежит создание промежуточных звеньев между поверхностью полистирола и МКА, которые защитили бы иммобилизованные молекулы антител от денатурации и обеспечили пространственную ориентацию, наиболее выгодную для распознавания и захвата антигена.
Сатер и Батлер в целях лучшего сохранения активности иммобилизованных МКА при конструировании твердофазных ИФА (сэндвич-методов) предложили прикреплять антитела к пластику с помощью биотин-авидиновых мостиков [21, 90]. Различные модификации предложенного ими метода до сих пор широко используются при конструировании твердофазных ИФА. В одном из своих первых исследований по разработке данного метода [90] авторы изучали влияние различных способов иммобилизации на антигенсвязывающую способность трех мышиных МКА, специфичных к флуоресцеину. Антитела прикреплялись к поверхности полистироловых иммунохимических (96-луночных) планшетов двумя различными способами: 1) с помощью прямой адсорбции и 2) через авидин-биотиновый мостик. Для создания такого мостика, использовали биотинилированные белки-носители, которые адсорбировали на пластике. В этой работе использовали, в качестве носителей, три белка: гемоцианин из створки моллюска, гамма-глобулин кролика и желатин. Для биотинилирования белки носители конъюгировали с NHS-LC-биотином. Затем биотинилированные белки адсорбировали в буфере на поверхности планшетов и после отмывок инкубировали с раствором стрептавидина. На следующей стадии планшеты инкубировали с биотинилированными МКА к флуоресцеину. Иммунные комплексы выявляли с помощью флуоресцеина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Было показано, что при использовании авидин-биотинового мостика антигенсвязывающая способность МКА повышалась в 5-500 раз (для разных антител) по сравнению с вариантом метода, при котором улавливающие МКА были непосредственно адсорбированы на пластике. Количество иммобилизованных МКА зависело от того, какой белок-носитель использовался.
При использовании упрощенной системы, в которой стрептавидин адсорбировали непосредственно на пластике (биотинилированные белки-носители не использовались), эффективность иммобилизации биотинилированных МКА ухудшалась в 10 - 100 раз по сравнению с методом, в котором использовался "полный" авидин-биотиновый мостик. Авторы назвали предложенный ими метод иммобилизации улавливающих антител «белок-ловящая авидин-биотиновая система» (англ.: the protein avidin-biotin capture (PABC) system).
В дальнейшем данная группа авторов более подробно изучила условия, влияющие на эффективность использования РАВС-системы в твердофазных двухсайтных ИФА (сэндвич-методах), используя тест-системы для определения других антигенов (например, IgG свиньи и пероксидазы). Была сделана попытка выяснить оптимальные стехиометрические соотношения различных компонентов при использовании РАВС-системы [91]. В целом были подтверждены выводы, сделанные в первом исследовании. При этом было показано, что наибольший выигрыш при использовании авидин-биотинового мостика для прикрепления ловящих антител получается в системах, в которых применяются МКА. Оказалось, что адсорбция на пластике меньше влияет на антигенсвязывающую способность поликлональных улавливающих антител (видимо эффекты авидности, о которых говорилось выше, частично компенсируют негативный эффект, связанный с денатурацией антител при адсорбции).
В настоящее время полная РАВС-система, включающая в качестве первого слоя биотинилированные белки-носители, используется редко. Однако практикуется использование коммерческих плашек с уже прикрепленным стрептавидином (например, связанным фотоаффинным методом). В ряде работ авторы сами адсорбировали стрептавидин прямо на плашки [30], в том числе, используя плашки с повышенной «липучестью» [93].
Среди других известных методов иммобилизации антител на твердой фазе следует упомянуть использование в качестве первого слоя антивидовых антител [23]. Наряду с этим применяются специально обработанные коммерческие пластиковые планшеты, приводящие к образованию ковалентных связей между активированными молекулами на поверхности пластика и антителами [13, 23]. Описано использование рекомбинантных технологий для создания пептидных «мостиков» между твердой фазой и антителами и др. [46, 97].
Вместе с тем, следует учитывать, что на практике эти методы оказываются более затратными по времени и средствам, чем пассивная адсорбция. Их результат часто не предсказуем. Поэтому пассивная адсорбция остается наиболее часто используемым методом иммобилизации антител при конструировании сэндвич-методов. Именно с пассивной адсорбции антител советуют начинать конструирование сэндвич-метода в специальных руководствах [23]. В этой связи особый интерес представляют приемы, позволяющие повысить эффективность метода пассивной адсорбции.
К числу наиболее существенных факторов, влияющих на сохранение антигенсвязывающей активности антител, можно отнести состав и физико-химические свойства адсорбционных буферов.
В ряде работ был проведен подробный анализ влияния рН на адсорбцию разнообразных антигенов (вирусных белков, липосахаридов и др.) в твердофазном ИФА [14, 32, 47]. Но, как ни парадоксально, вопрос воздействия рН на биологическую активность адсорбированных антител в литературе освещен весьма слабо. Традиционно, в руководствах рекомендуют использовать два буфера - с рН около 7,5 и 9,5 - для адсорбции антител, как оптимальные [57, 60]. Однако при этом в некоторых работах были описаны поликлональные и моноклональные антитела, для сохранения антигенсвязывающей активности которых требовалось использование буферов с низким или высоким значением рН. Так, в работе Кювелье с соавторами [33] наблюдали увеличение активности поликлональных козьих антител, адсорбированных на планшеты из полистирола при рН 5,0 (по сравнению с рН 7,5). Кроме того, согласно неопубликованным в реферируемых журналах, но известным среди специалистов техническим заметкам [88], встречаются МКА, которые дают лучшие результаты при конструировании сэндвич-методов после адсорбции на полистироловую поверхность при кислых и щелочных значениях рН. Однако в указанной работе [88] не было представлено подробного анализа антигенсвязывающей активности МКА после их адсорбции при разных значениях рН.
Подбор оптимальных насыщающих концентраций тестируемых антител при оптимальном рН адсорбции
Важнейшим фактором, который позволяет достичь максимальной антигенсвязывающей активности адсорбируемых антител, является корректное определение их оптимальной насыщающей концентрации при оптимальном рН адсорбции. Как известно, использование избыточных концентраций антител, приводит к образованию множества слоев на твердой фазе, что может быть причиной артефактов в твердофазном ИФА (связанных с менее прочным взаимодействием антител и антигенов) [23].
Моноклональные антитела адсорбировали на поверхность полистироловых планшетов в концентрации 8 мкг/мл при указанных значениях рН и регистрировали связывание с биотинилированным белком р24-ВИЧ. Детали см. "Методы исследований".
(1) иммобилизация при рН 9,5; у=0,23х;
(2) иммобилизация при рН 11,9; у=0,16х;
(3) иммобилизация при рН 2,8; у=0,13х;
(4) иммобилизация при рН 7,5; у=0,12х;
(5) иммобилизация при рН 1,0; у=0,08х;
Для определения оптимальной насыщающей концентрации антител мы готовили разведения антител в буфере с оптимальным рН адсорбции в концентрациях: 1, 3, 6 и 10 мкг/мл и, после насыщения планшетов, определяли коэффициенты кривых связывания меченого антигена с иммобилизованными антителами. Результаты, полученные для МКА к HBsAg - 18С8 и G10 -представлены на рисунке 9. В этом эксперименте МКА 18С8 являлись контрольными антителами, так как оптимум рН их адсорбции был определен ранее [11]. Наблюдали, что для МКА 18С8 (оптимальный рН адсорбции 2,8) увеличение насыщающей концентрации с 1 мкг/мл (k=0,08) до 3 мкг/мл (k=0,17) приводило более чем к двукратному увеличению связывания – сравнить кривые (1) и (2). Дальнейшее увеличение концентрации насыщающих антител до 6 мкг/мл (k=0,17) и до 10 мкг/мл (k=0,15) не приводило к увеличению связывания меченого HВsAg c адсорбированными антителами: кривые (4) и (3) совпадают (рис. 9 а).
Сходная картина наблюдалась при определении оптимальной насыщающей концентрации антител клона G10 при оптимальном рН адсорбции 7,5. Для антител этого клона увеличение насыщающей концентрации с 1 мкг/мл – кривая (1), k=0,06 до 3 мкг/мл (кривая (4), k=0,1) приводило к увеличению антигенсвязывающей активности в 1,7 раза. Дальнейшее увеличение насыщающих концентраций до 6 мкг/мл (k=0,1) и 10 мкг/мл (k=0,1) не приводило к увеличению антигенсвязывающей активности: кривые (2), (3) и (4) совпадают (рис. 9 б).
Таким образом, независимо от оптимального рН адсорбции (рН 2,8 или рН 9,5), оптимальная насыщающая концентрация МКА составляла 3 мкг/мл. Сходные данные были получены для всех антител нашей панели. В дальнейшем при определении антигенсвязывающей активности мы использовали насыщающую концентрацию антител равную 3 мкг/мл. (4,3) yL (2)
Антитела адсорбировали на поверхность полистироловых планшетов в концентрациях от 1 до 10 мкг/мл и регистрировали связывание с HBsAg, меченым пероксидазой. Ниже приводятся коэффициенты кривых связывания.
а. Антитела 18С8, рН адсорбции 2,8:
(1) насыщающая концентрация 1 мкг/мл; y=0,08х;
(2) насыщающая концентрация 10 мкг/мл; y=0,15х;
(3) насыщающая концентрация 6 мкг/мл; y=0,17х;
(4) насыщающая концентрация 3мг/мл; y=0,17х;
б. Антитела G10, рН адсорбции 7,5:
(1) насыщающая концентрация 1 мкг/мл; y=0,06х;
(2) насыщающая концентрация 3мкг/мл; y=0,10х;
(3) насыщающая концентрация 10 мкг/мл; y=0,10х;
(4) насыщающая концентрация 6 мг/мл; y=0,10х;
Определение количества антител, сохраняющих активность после адсорбции на поверхность полистироловых планшетов при разных значениях рН
Для определения количества активных антител после адсорбции в насыщающих буферах с различными значениями рН были выбраны МКА 18С8 и МКА D5B4. Как следует из табл. 1, эти антитела характеризовались максимальной антигенсвязывающей активностью при рН адсорбции 2,8 и 11,9, соответственно. Кроме того, МКА D5B4, обладающие максимальным связыванием с антигеном после адсорбции при рН 11,9, также проявляли высокую степень связывания и при рН 2,8 (табл.1). При этом максимальное общее количество молекул МКА 18С8 и МКА D5B4 прикреплялось к твердой фазе после адсорбции при рН 7,5 ( 290 и 255 нг/на лунку, соответственно), а минимальное ( 154 нг/мл для обоих МКА) – после адсорбции при рН 2,8 (табл. 5).
Количество активных антител для МКА 18С8 определяли после адсорбции при двух значениях рН: 2,8 и 7,5. Для МКА D5B4 анализировали вариации этого параметра при трех значениях рН адсорбционных буферов: 2,8; 7,5 и 11,9.
Для расчета количества антител на твердой фазе, которые сохранили антигенсвязывающую активность, использовали значения радиоактивного сигнала после выхода кривых связывания 125I-HBsAg с антителами на стационарный участок при трех различных значениях pH (рис. 13). Эти значения далее соотносили с концентрацией меченного HBsAg, полученной из параллельно поставленной калибровки (рис. 12).
Молекулярная масса HBsAg равна 23000, а молекулярная масса антител равна 160000. С учетом этих значений мы рассчитывали (как описано в разделе «Методы исследований») количество антител в лунке, которые сохранили свою антигенсвязывающую активность. Поскольку большинство антител при иммобилизации теряет свою антигенсвязывающую активность, при расчетах делалось допущение, что более 99% молекул антител, сохранивших активность, могли связать только одну молекулу HBsAg.
Поверхностную концентрацию активных антител вычисляли исходя из того, что 100 мкл раствора занимают в лунке NUNC MaxiSorp площадь равную 0,94 см [44]. Окончательные результаты этих расчетов представлены в таблице 6.
Данные, представленные в таблице 6, показывают примерно двукратное статистически достоверное увеличение количества активных антител МКА D5B4 и МКА 18С18 после адсорбции при рН 2,8 по сравнению с адсорбцией при 7,5 ( с 15 – 18 нг/на лунку до 31 – 36 нг/на лунку). Еще большее увеличение (почти в 2,5 раза) количества активных антител наблюдалось после адсорбции МКА D5B4 при рН 11,9 по сравнению с рН 7,5 ( с 15 нг/на лунку до 37 нг/на лунку).
Сопоставление этих результатов с данными таблицы 5 (относительно общего количества адсорбированных молекул антител) позволило определить, какую долю (в %) активные антитела составляли от общего пула иммобилизованного IgG при разных рН адсорбции. Оказалось, что после адсорбции при рН 7,5 (когда наблюдалось прикрепление максимального количества молекул IgG, то есть 250 – 290 нг/на лунку) активные антитела (15 – 18 нг/на лунку) на твердой фазе составили только 6% общего пула IgG для обоих МКА (табл. 6).
В противоположность этому, при рН 2,8 на пластик адсорбируется минимальное количество МКА 18С8 и МКА D5B4 (около 150 нг на лунку, табл. 5). При этом активные молекулы МКА 18 С8 ( 36 нг/на лунку) и МКА D5B4 ( 31 нг/на лунку) после адсорбции при рН 2,8 составляли 24% и 20% от общего пула IgG на твердой фазе, соответственно (табл. 6).
После адсорбции МКА D5B4 в щелочном буфере общее количество антител на твердой фазе, как показывает таблица 5, снизилась c 290 нг/на лунку (при рН 7,5) до 203 нг/на лунку (при рН 11,9). Активные антитела (37 нг/на лунку) составили 18 % от общего пула IgG.
В целом, после адсорбции МКА 18С8 и МКА D5B4 в жестких условиях (рН 2,8 и рН 11,9) доля активных антител в общем пуле иммобилизованных молекул IgG возрастала примерно в 3 - 4 раза (по сравнению с 6% после адсорбции при рН 7,5), то есть жесткие условия адсорбции способствовали лучшему сохранению активности иммобилизованных антител.
Это привело к увеличению (в 2 – 2,5 раза) абсолютного количества активных антител на твердой фазе, несмотря на наблюдавшееся уменьшение общего количества иммобилизованного IgG.
Эти результаты, полученные с использованием меченых 125I антител и антигена (HBsAg), хорошо согласуются с описанными в разделе 4.8 данными, полученными для МКА 18 С8 с помощью несколько иных подходов, а именно: определения общего количества адсорбированных молекул с помощью флуоресцентного красителя и оценки количества активных антител на твердой фазе по взаимодействию адсорбированных МКА с избытком меченого пероксидазой антигена.
Следует обратить внимание на приблизительную пропорциональность количества активных антител на поверхности лунок пластиковых планшетов (табл. 6) и величин угловых коэффициентов линейных участков кривых связывания («k») меченого антигена с адсорбированными антителами (табл. 1). Например, сравнение данных табл. 1 и табл. 6 показало, что для МКА 18С8 количества активных антител на поверхности полистирола при рН 2,8 ( 36,4 нг/на лунку) и рН 7,5 ( 18,0 нг/на лунку) соотносились как 2 : 1. При тех же значениях рН адсорбции отношение угловых коэффициентов кривых связывания "k" составляло 2,6 : 1 (1,08 : 0,42). При этом не наблюдалось такой пропорциональности в отношении общего количества антител. Так их отношение для МКА 18С8 при рН 2,8 и 7,5 составляло 1 : 2 (табл. 5).
Та же закономерность имела место для МКА D5B4: количество активных антител на поверхности после адсорбции при рН 2,8, рН 7,5 и рН 11,9 равнялось 34,1, 15,1 и 37,2 нг/на лунку, то есть их отношение было 2,3 : 1 : 2,5. Величины угловых коэффициентов «k» при тех же трех значениях рН составляли 1,04, 0,63 и 1,24, то есть их отношение было 1,7 : 1: 2,0. При этом пропорция общих количеств адсорбированных антител при рН 2,8; 7,5 и 11, 9 была другой: 1 : 1,7 : 1,3 ( 154, 256 и 204 нг/на лунку, соответственно).
Другими словами, аналитическая чувствительность метода, достигаемая с одними и теми же антителами при разных рН адсорбции, была приблизительно пропорциональна количеству активных антител на твердой фазе. Таким образом, метод анализа сравнительной антигенсвязывающей активности иммобилизованных антител, основанный на определении угловых коэффициентов линейных участков кривых связывания с тестируемыми антигенами, можно полагать простым и эффективным способом отбора качественных адсорбируемых антител. Такой пропорциональности не наблюдалось в отношении изменений количества общего IgG на твердой фазе и антигенсязывающей способности.
В целом, приведенные выше данные предполагают, что повышение активности МКА при оптимальных рН адсорбции связано не просто с некоторым увеличением количества этих антител на твердой фазе (с пропорциональным возрастанием сайтов связывания антигена), а с лучшим сохранением активности МКА (то есть, возрастанием доли активных антител в общем пуле IgG на твердой фазе). Это конечно не исключает, что определенные вариации в общем количестве прикрепленных антител также могут вносить свой вклад в результирующее значение аналитической чувствительности метода.
Эти тонкие взаимоотношения можно проиллюстрировать следующим примером. Сохранность МКА D5B4 (доля активных молекул в общем пуле IgG) после адсорбции при рН 2,8 и 11,9 оказалась примерно одинаковой: 18 – 20%, что примерно в 3 раза выше, чем при рН 7,5 (6%). При этом максимум абсолютного количества активных антител на твердой фазе (табл. 6) и пик антигенсвязывающей активности (табл. 1) приходятся на рН адсорбции 11,9, при котором адсорбируется в 1, 4 раза больше МКА D5B4, чем при 2,8 ( 208 и 154 нг/на лунку, соответственно).
Таким образом, проведенный в настоящей работе анализ двадцати восьми МКА к двум вирусным антигенам показал, что антигенсвязывающая активность МКА, секретируемых различными гибридомами, значительно варьирует в зависимости от рН адсорбционных буферов, которые используются для их иммобилизации на поверхность пластиковых планшетов в ИФА. Для шести МКА (21,5 %) оптимальный результат (в отношении антигенсвязывающей способности адсорбированных антител) можно было получить, используя, наряду с «классическими» буферами (с рН 7,5 и 9,5), адсорбционные буферы с кислым значением рН (2,8). При этом еще шесть МКА (также 21,5%) демонстрировали максимальную антигенсвязывающую способность исключительно после адсорбции при жестких значениях рН (2,8 или 11,9). Для этих «инвариантных» (в отношении оптимальных рН адсорбции) антител было характерно статистически достоверное возрастание антигенсвязывающей активности (в 1,25 – 3,6 раз) после адсорбции при рН 2,8 или рН 11,9 по сравнению с активностью после адсорбции в обоих «классических» буферах (с рН 7,5 и рН 9,5). Данные эффекты оказались связанными с лучшим сохранением активности МКА после их адсорбции на твердую фазу. Полученные результаты показывают важность тестирования антигенсвязывающей способности антител для отбора наилучших комбинаций МКА для ИФА с учетом оптимальных рН адсорбции. Если антигенсвязывающую способность МКА нашей панели оценивали бы только после адсорбции в «классических» буферах с рН 7,5 или 9,5 (обычно используемых в ИФА), то некоторые потенциально наиболее эффективные МКА (например, МКА 18С8) ошибочно могли быть отнесены к числу неэффективных.