Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Атеросклероз как воспалительное заболевание 14
1.2. Противоречия биохимической концепции атерогенеза. 15
1.3. Альтернативная инфекционная (хламидофильная) концепция атерогенеза .19
1.4. Chlamydophila pneumoniae: биологические особенности, основы патогенеза инфекции .20
1.5. Хламидофильная инфекция дыхательных путей: клинические проявления, возможности лабораторной диагностики 24
1.6. Хламидофильная инфекция крови, возможности лабораторной диагностики 27
1.7. Атерогенез и хламидофильная инфекция клеток артерий 29
1.8. Возможности прижизненной диагностики хламидофильной инфекции коронарных артерий, поражённых атеросклерозом .36
1.9. Эндотелий: морфологические особенности, функции, реакции на патологические влияния 37
Резюме по главе .41
Глава 2. Материалы и методы исследования .43
2.1. Дизайн исследования .43
2.2. Соответствие исследования этическим нормам 43
2.3. Характеристика обследованных пациентов .44
2.4. Материалы исследования 46
2.5. Окрашивание препаратов по методу Май-Грюнвальда .47
2.6. Иммуноцитохимическое окрашивание 48
2.7. Приготовление мазков слизистой носовых ходов, задней стенки глотки, крови 49
2.8. Клиническая лабораторная диагностика инфекции Chlamydophila pneumoniae 50
2.8.1. Реакция непрямой иммунофлюоресценции 52
2.8.2. Иммуноферментный анализ 53
2.9. Методы оценки модифицируемых факторов риска сердечнососудистых заболеваний .55
2.10. Методы инструментальных обследований 58
2.10.1. Оценка тяжести коронарного атеросклероза 58
2.10.2. Ангиографические признаки тромбозов и стенозов 58
2.11. Представление результатов и их статистический анализ .60
Глава 3. Результаты исследования 63
3.1. Внутрисосудистая биопсия коронарных артерий .63
3.2. Биоптаты коронарных артерий 65
3.2.1. Клетки артериальной крови .65
3.2.2. Неклеточные элементы коронарных артерий .66
3.2.3. Эндотелиоциты поражённых атеросклерозом коронарных артерий и их апоптотические тельца .67
3.2.4. Типы цитограмм биоптатов коронарных артерий .74
3.2.5. Взаимосвязь разрывов атером с показателями цитограмм внутрисосудистых биоптатов .75
3.3. Биоптаты сонных артерий .76
3.4. Иммуноцитохимическое исследование внутрисосудистых биоптатов коронарных артерий .80
3.5. Лабораторная диагностика хламидофильной инфекции 82
3.5.1. Хламидофилы в эндотелиоцитах коронарных артерий .82
3.5.2. Хламидофилы в клетках верхних дыхательных путей и крови 85
3.5.3. Пути гематогенной диссеминации хламидофил 88
3.5.4. Антитела к хламидофилам .89
3.5.5. Суждение о хламидофильной инфекции на основании выявления бактерий в клетках и концентраций антител к ним .92
3.6. Лабораторная характеристика хламидофильной инфекции у больных ИБС и больных контрольной группы 93
3.7. Внутрисосудистое воспаление и системный воспалительный ответ 94
3.8. Взаимосвязь хламидофильной инфекции и системного воспалительного ответа 96
3.9. Модифицируемые факторы риска атеросклероза обследованных больных 99
3.10. Выраженность коронарного атеросклероз, частота его тромботических осложнений, структура клинических форм ИБС у больных с инфицированием коронарного эндотелия бактерией Cpn и больных без этого инфицирования .103
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 108
4.1. Внутрисосудистая биопсия среди других методов получения эндотелиоцитов 108
4.2. Препараты, содержащие эндотелиоциты, и способы визуализации этих клеток 110
4.3. Эндотелиоциты во внутрисосудистых биоптатах коронарных артерий 112
4.4. Инфицирование бактерией Chlamydophila pneumoniae коронарных эндотелиоцитов 116
4.5. Бактерия Chlamydophila pneumoniae в клетках верхних дыхательных путей и крови 116
4.6. Концентрация в крови антител к бактерии Chlamydophila pneumoniae 119
4.7. Внутрисосудистая биопсия в изучении инфицирования эндотелия коронарных артерий бактерией Chlamydophila pneumoniae 121
Заключение .122
Выводы .124
Практические рекомендации .125
Список литературы 126
- Chlamydophila pneumoniae: биологические особенности, основы патогенеза инфекции
- Методы оценки модифицируемых факторов риска сердечнососудистых заболеваний
- Биоптаты сонных артерий
- Эндотелиоциты во внутрисосудистых биоптатах коронарных артерий
Chlamydophila pneumoniae: биологические особенности, основы патогенеза инфекции
Хламидии – грамотрицательные бактерии семейства Chlamydiaceae, в котором выделяют роды Chlamydia (вид Chlamydia trachomatis, Chlamydia suis, Chlamydia muridarum) и Chlamydophila (виды Сhlamydophila pneumoniae, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus, Chlamydophila caviae, Chlamydophila felis) [3].
Для человека патогенны хламидии видов Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci, Сhlamydophila pneumoniae. У первых двух имеется множество серологических вариантов, что обусловлено различиями в структурах белков клеточной стенки и наружной клеточной мембраны. Вид Сhlamydophila pneumoniae представлен одним серологическим вариантом – TWAR. Сhlamydophila pneumoniae была впервые выделена в 1965 году в Тайване от ребёнка, больного трахомой, а серологический вариант этого микроорганизма получил наименование TW-183. В 1983 году идентичная бактерия была получена в США от студента, болевшего фарингитом, и обозначалась как AR-39. В 1986 году серологический вариант TWAR, название которого произошло от слияния TW-183 и AR-39, стал общепризнанным в обозначении одной из Chlamydophila psittaci [110]. В последующем серологический вариант TWAR был выделен в отдельный вид бактерий – Chlamydophila pneumoniae [43; 45].
Заболевания, вызываемые Cpn, относятся к абсолютным антропонозам. Cpn передаётся воздушно-капельным путём, механизм передачи – аэрозольный. Источником Cpn является больной, реконвалесцент или носитель бактерии.
Хламидофила – облигатная внутриклеточная бактерия с двухфазным циклом развития. В нём чередуются две морфологические формы возбудителя – элементарное (ЭТ) и ретикулярное тельце (РТ). Переходные формы в цикле развития называются промежуточными тельцами. ЭТ – сферическая клетка диаметром 200-300 нм. Она способна стимулировать собственный эндоцитоз чувствительными клетками инфицированного организма, ингибировать слияние лизосом с вакуолью, содержащей ЭТ, что препятствует образованию эндосомы [10].
Хламидофилы, визуализированные в атероме методом электронной микроскопии, схожи с липопротеинами. Среди ЭТ, обнаруженных в атероме хламидофил, выделяют грушевидные формы, плотные тельца, атипичные тельца и «тельца-призраки» [162].
РТ – внутриклеточная метаболически активная форма возбудителя размерами 400-1000 нм. Благодаря ей хламидофилы размножаются бинарным делением в инфицированных клетках [10]. Для РТ хламидофил, обнаруженных в атеросклеротических бляшках, описаны фибриллярные формы с центральным плотным ядром. Они способны размножаться как спорообразованием, так и почкованием [162].
В отличие от исключительно внутриклеточного цикла развития Cpn в цитоплазме инфицированных клеток дыхательных путей или на клеточных культурах, в атероматозной массе атеромы Cpn способны к внеклеточному циклу развития, для которого РТ не характерны. В этих условиях бактерии делятся и почкуются, образуя ЭТ, типичные, атипичные и миниатюрные тельца. Хламидофилы способны делиться, находясь как в вакуолярной мембране, так и вне её [162].
Клинические проявления хламидофильной инфекции зависят от массивности инфицирования (количества инфицирующих ЭТ), патогенности, вирулентности бактерии, иммунного статуса инфицированного человека. Под действием этих факторов реализуется один из четырех вариантов внутриклеточного цикла развития хламидофил. Первый (наиболее редкий) вариант проявляется разрушением и гибелью хламидофил в фаголизосомах. Это возможно при полной активации интерфероновой, цитокиновой систем и реализации антимикробного потенциала инфицированной клетки. Второй (наиболее частый) вариант характеризуется репродуктивным циклом развития хламидофил (Рисунок 1. 1).
При третьем варианте взаимодействия с клеткой-хозяином хламидофилы преобразуются в L-формы, среди которых выделяют внутриклеточное ЭТ, промежуточное тельце, зрелое РТ и критическое тельце. Третий вариант встречается при неадекватной (без учета антибиотикорезистентности хламидофил) этиотропной терапии. Характерными чертами L-форм хламидофил являются слабая способность к антигенному раздражению иммунокомпетентных клеток и способность передаваться дочерним клеткам при делении клетки-хозяина. Четвертый вариант – персистенция хламидофил, к которой приводят дефицит метаболитов и слабый иммунный ответ макроорганизма [1; 10].
Одновременно множество ЭТ может находиться в инфицированной клетке. На протяжении 4-8 часов после инфицирования еще не наблюдается нарушений её функционального состояния. За это время ЭТ претерпевают изменения: в них увеличивается количество рибосом и полирибосом, обнаруживается бактериальный нуклеотид, они увеличиваются в размерах, появляются признаки их бинарного деления. Затем ЭТ через промежуточные тельца преобразуются в РТ – вегетативные формы бактерии. РТ начинают клеточный цикл, в котором делятся бинарно (8 – 12 циклов деления). С увеличением числа промежуточных телец, РТ микроколонии хламидофил уплотняются и образуют характерную полулунную мантию вокруг ядра клетки-хозяина. Дочерние РТ преобразуются в промежуточные тельца и далее в ЭТ. В итоге из одного ЭТ может возникнуть от 200 до 1000 новых ЭТ. Цикл развития новых ЭТ из первичного ЭТ завершается в течение 48-72 часов. При наличии благоприятных условий ЭТ заполняют цитоплазму клетки, что закономерно приводит к ее разрушению [10; 13].
Патологическое действие хламидофил сопровождается повреждением окружающих тканей гидролитическими лизосомальными ферментами инфицированных и разрушенных клеток. Например, если первичный очаг инфекции локализован в дыхательных путях, то нарастают отек и гиперемия слизистых оболочек, вследствие частичной десквамации нарушается целостность эпителия, происходит лимфоцитарная субэпителиальная и более глубокая инфильтрация, появляется воспалительный экссудат [10; 13]. Описанные патологические эффекты Cpn могут проявляться не только при инфицировании этими бактериями клеток дыхательных путей, но и клеток артерий, к которым также тропна данная бактерия.
Методы оценки модифицируемых факторов риска сердечнососудистых заболеваний
Руководствуясь положениями V пересмотра Российских рекомендаций «Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза» (2012 г.), у обследованных больных были охарактеризованы такие модифицируемые факторы риска атеросклероза, как курение, гипертоническая болезнь, сахарный диабет, ожирение, хроническая болезнь почек.
Курение табака признано одним из основных факторов риска развития сердечнососудистых заболеваний [86]. К курильщикам были отнесены обследованные больные, которые не отрицали наличия зависимости от курения табака, продолжали курить к моменту поступления в ФГБУ ВЦЭРМ им. А. М. Никифорова либо имели стаж курения в прошлом. При активном расспросе эти больные подтверждали, что выкуривали по 10-20 сигарет в день, а стаж курения составлял 5 лет и более.
Гипертоническая болезнь характеризуется влиянием на органы-мишени, в частности, на сердце. Гипертрофия миокарда левого желудочка (ЛЖ) является более строгим предиктором сердечно-сосудистых осложнений и смерти, нежели, например, уровень артериальной гипертензии [58]. Прогностическим признаком возрастания риска развития сердечнососудистых осложнений является даже небольшое, в пределах нормальных значений, увеличение массы миокарда ЛЖ (ММЛЖ) [122]. Поэтому, с целью сравнения вклада гипертонической болезни в развитие сердечно-сосудистых осложнений у больных был избран такой критерий, как индекс ММ ЛЖ (ИММ ЛЖ). Ультразвуковое исследование сердца выполняли на аппарате Vivid 9, произведенном компанией General Electric (США). Для определения ИММ использовали формулу ИММ (г/м2) = ММ ЛЖ (г)/площадь поверхности тела (м2). ММ ЛЖ (г) рассчитывали по формуле ММ ЛЖ = 1,04 ((межжелудочковая перегородка (см) + задняя стенка левого желудочка (см) + конечный систолический размер (см))3 – конечный диастолический размер (см)3) – 14 [59], а площадь поверхности тела определяли по формуле Дюбуа [16]: площадь поверхности тела = масса тела (кг)0,425 рост (м)0,725 71,84. Нормальные значения ИММ ЛЖ для мужчин были от 71 до 94 г/м2, для женщин – от 71 до 89 г/м2. Эхо КГ была выполнена 17 из 26 больным с тромбозами, 25 из 30 больным с хроническими окклюзиями коронарных артерий, а также 29 из 33 обследованным из группы сравнения.
Сахарный диабет (СД) – состояние, определяемое как повышение уровня глюкозы крови. Диагноз СД у обследованных больных устанавливался согласно критериям рекомендаций по диабету, предиабету и сердечно-сосудистым заболеваниям Европейского общества кардиологов в сотрудничестве с Европейской ассоциацией по изучению диабета [155] либо на основании анамнеза, по данным которого указанное заболевание было выявлено ранее, до момента настоящей госпитализации.
Ожирение – превышение индекса массы тела (ИМТ) более 30 кг/м2. Расчёт ИМТ производился после измерения веса больного в кг и роста в м.
Хроническая болезнь почек (ХБП) – наднозологическое понятие, объединяющее всех пациентов с сохраняющимися в течение 3 и более месяцев признаками повреждения почек и/или снижением их функции.
Диагноз ХБП у обследованных больных устанавливался согласно критериям, сформулированным в рекомендацях «Сердечно-сосудистый риск и хроническая болезнь почек: стратегии кардио-нефропротекции», на основании классификации ХБП в зависимости от скорости клубочковой фильтрации [12] либо, как и в некоторых случаях с СД, на основании анамнеза, если ХБП было выявлено ранее, до момента настоящей госпитализации.
Липидный обмен у больных охарактеризовывали на основании результатов определения концентраций в венозной крови общего холестерина, триглицеридов, липопротеинов высокой плотности, очень низкой плотности, липопротеинов низкой плотности.
Биоптаты сонных артерий
Цитологические препараты иссечённых атером сонных артерий 6 больных каротидным атеросклерозом дополнительной контрольной группы готовили для определения качественного соответствия внутрисосудистых биоптатов, полученных при ангиопластике коронарных артерий, цитологическим образцам пораженных атеросклерозом артерий, а также для изучения происхождения полигональных безъядерных клеток при атеросклерозе.
Иссечённые в ходе эверсионных каротидных эндартерэктомий по границе медиа/адвентиция изменённые участки артерий помещали в контейнер с фосфатно-солевым буферным раствором и доставляли в лабораторию, где наружные поверхности и внутренние просветы биоптатов промывали при помощи шприца стерильным фосфатно-солевым буфером.
Клетки эндотелия сонных артерий получали несколькими способами. Сначала их забирали с поверхностей интимы универсальными зондами, предназначенными для взятия урогенитальных образцов. После этого, прокатывая щёточки зондов по поверхностям предметных стекол, готовили препараты мазков эндотелия. Затем инцизионные биоптаты ножницами рассекали вдоль и производили отпечатки продольных срезов атеросклеротически изменённых артерий на предметных стёклах.
Для подтверждения соответствия материала, получаемого при внутрисосудистой биопсии коронарных артерий, клеткам и неклеточным элементам атеросклеротических бляшек, были изучены медиа-интимальные комплексы сонных артерий, пораженных атеросклерозом, служившие препаратами сравнения.
Цитоморфологическое исследование 6 медиа-интимальных комплексов, иссеченных в ходе эверсионных каротидных эндартерэктомий, показало, что в них также представлены эндотелиоциты – полигональные безъядерные и ядросодержащие клетки, апоптотические тельца. Эндотелиоциты окрашивались как оксифильно, так и базофильно, апоптотические тельца – только базофильно.
Полученные в ходе описательного статистического анализа данные о количественных показателях перечисленных клеток, апоптотических телец в 6 препаратах медиа-интимальных комплексов сонных артерий представлены в Таблице 6.
Проанализированы и представлены в Таблице 7 количественные показатели клеток эндотелия и апоптотических телец в зависимости от характера их окрашивания (оксифильного или базофильного).
Неклеточные элементы некротических ядер атером (соединительнотканные волокна, клеточный детрит, сплошь покрывавшие поля зрения) были в каждом из 6 препаратов.
Таким образом, внутрисосудистые биоптаты пораженных атеросклерозом коронарных артерий качественно соответствуют описанным в этом разделе биоптатам контроля – инцизионным биоптатам сонных артерий с атеросклеротическими изменениями.
Эндотелиоциты во внутрисосудистых биоптатах коронарных артерий
Согласно полученным нами данным, при ангиопластике к поверхностям баллонных катетеров адгезирует в среднем 64 эндотелиоцита (включая их пласты). Можно считать, что получаемый таким способом клеточный материал эндотелия скуден, например, для культивирования in vitro, но позволяет выполнять клиническую лабораторную диагностику инфекций, ассоциированных с атеросклерозом.
Эндотелиоциты во внутрисосудистых биоптатах коронарных артерий представлены преимущественно (84%) полигональными безъядерными, реже ядросодержащими (4%) клетками и апоптотическими тельцами (12%). Их принадлежность к эндотелию была подтверждена экспрессией антигенов CD31, CD34, CD105, а также сходством с образцами соответствующих структур в инцизионных биоптатах сонных артерий, поражённых атеросклерозом.
Результаты анализа биоптатов породили важные вопросы. Почему эндотелиоциты в биоптатах преимущественно безъядерные? Является ли это свидетельством естественной гибели эндотелиоцитов при атеросклерозе или следствием механического давления баллонных катетеров, химического действия рентгенконтрастного вещества?
Чтобы ответить на поставленные вопросы, нами было выполнено иммуноцитохимическое исследование эндотелиоцитов, полученных при инцизионной биопсии медиа-интимальных комплексов сонных артерий, поражённых атеросклерозом (гл. 3, разд. 3.2). Поскольку при данной операции (каротидная эндартерэктомия) не выполняются манипуляции с давлением на клетки внутренней выстилки артерий и введением рентгенконтрастного вещества, как это происходит при баллонной ангиопластике, влияния на клетки сонных артерий механического (давление) и химического (контрастное вещество) факторов были исключены.
В некоторых препаратах были обнаружены многоядерные пласты, экспрессирующие на своей поверхности эндотелиальные маркёры (Рисунок 4.1).
От описанных пластов сепарируются цитоплазма полигональной формы (Рисунок 4.2).
Складывается впечатление, что в конце жизненного цикла эндотелиоцит представляет собой полигональную безъядерную клетку.
Дегенерация её ядер носит диффузный характер. Дегенерацию антигенов можно наблюдать на примере точечной экспрессии поверхностного антигена CD34 у эндотелиоцита, завершающего жизненный цикл, в сравнении с относительно юными клетками (Рисунок 4.3).
Вместе с ядросодержащими клетками, в биоптатах можно наблюдать безъядерные полигональные клетки с точечной экспрессией поверхностных эндотелиальных антигенов (Рисунок 4.4).
Как во внутрисосудистых биоптатах коронарных артерий, так и в инцизионных биоптатах медиа-интимальных комплексов сонных артерий, пораженных атеросклерозом, были обнаружены апоптотические тельца.
Таким образом, при внутрисосудистой баллонной биопсии возможно получать цитологический материал внутренней выстилки коронарных артерий, в частности клетки, идентифицированные как эндотелиоциты. Описано образование пластов в эндотелии артерий, поражённых атеросклерозом. Как во внутрисосудистых биоптатах коронарных, так и инцизионных биоптатах сонных артерий, полигональные безъядерные клетки являются эндотелиоцитами. При атеросклерозе коронарных и сонных артерий возможно наблюдать апоптоз эндотелиоцитов. Образование безъядерных эндотелиоцитов, апоптотических телец происходит и вне связи с давлением баллонными катетерами или химическим влиянием рентгенконтрасного веществ на стенки артерий при ангиопластиках, в ходе которых были получены внутрисосудистые биоптаты.