Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Фармакологическая регуляция гемостаза некрахмальными полисахаридами
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Получение и характеристика экспериментальных образцов
2.2. Стандартизация полученных образцов .
2.3. Оценка анти- и проагрегантной активности некрахмальных полисахаридов и препаратов сравнения in vitro .
2.4. Характеристика экспериментальных животных
Глава 3. Анти- и проагрегантная активность некрахмальных полисахаридов in vitro
Глава 4 Влияние сульфатированных полисахаридов на гемостаз у экспериментальных животных .
Обсуждение
Выводы .предложения и рекомендации
Список литературы
- Фармакологическая регуляция гемостаза некрахмальными полисахаридами
- Оценка анти- и проагрегантной активности некрахмальных полисахаридов и препаратов сравнения in vitro
- Анти- и проагрегантная активность некрахмальных полисахаридов in vitro
- Влияние сульфатированных полисахаридов на гемостаз у экспериментальных животных
Введение к работе
Актуальность проблемы. Основным фактором риска нарушений деятельности сердечно-сосудистой системы является патологическая активация тромбоцитов, которая приводит к тромбоэмболическим осложнениям (Weyrich, Zimmerman, 2004; Gawaz et al. 2005).
Ключевым механизмом формирования тромба является повышенная склонность тромбоцитов к агрегации, и этот факт стал патофизиологическим обоснованием для создания и клинического применения антиагрегантных средств (Schneider, 2011; Smyth, 2011; Angiolillo, 2012). Механизм действия этих веществ может быть обусловлен угнетением синтеза простагландинов за счет ацетилирования циклоксигеназы арахидоновой кислоты с последующим снижением уровня тромбоксана А2 в тромбоцитах (ацетилсалициловая кислота), либо ингибированием P2Y12 рецепторов (клопи-догрель), либо подавлением самих гликопротеиновых рецепторов IIb/IIIa, расположенных на мембране тромбоцитов (абциксимаб, эптифибатид, тирофибан) (Gomes, Verheugt, 2003; Karha, Cannon, 2008; Hagemeyer, Peter, 2010; Ueno et al., 2010; Picker, 2013).
Имеющиеся в арсенале современной фармакологии ингибиторы агрегации тромбоцитов доказали свою эффективность при проведении первичной и вторичной профилактики инфаркта миокарда и ишемического инсульта и в лечении острого коронарного синдрома (Sanmuganathan et al., 2001; Boersma et al., 2002; Thiele et al., 2012; Aradi et al., 2013; Sutcliffe et al., 2013). Вместе с тем, применение антиагрегант-ных средств сопряжено с риском нежелательных эффектов и осложнений, таких как диспепсические расстройства, желудочно-кишечные кровотечения, поражение периферической нервной системы, аллергические реакции, тромбоцитопения (Cerbone, 2009; Chan et al., 2012; Tsai et al., 2012). Нередко встречаются случаи резистентности к аспирину и клопидогрелю (Musallam et al., 2011). Эти обстоятельства ставят перед фармакологами и фармацевтами актуальную задачу поиска новых и безопасных средств, предназначенных для лечения и предупреждения тромботических поражений сосудов.
Углеводные биополимеры, составляющие группу некрахмальных полисахаридов, характеризуются широким спектром фармакологических эффектов, низкой токсичностью и высокой степенью безопасности (de Andrade Moura et al., 2001; Mayer, Hamman, 2004; Mousa, 2010; Vilahur, Badimon, 2013). К таким соединениям относятся
пектины, альгинаты, фукоиданы, каррагинаны, хитозаны. Показано, что эти полисахариды обладают умеренной гипохолестеринемической, гипотриглицеридемической и гипогликемической активностью и способностью влиять на ключевые звенья регуляции гемостаза (Хотимченко и др., 2001а, б, 2005; Panlasigui et al., 2003; Оводов, 2009; Хотимченко, 2009; Ustyuzhanina et al., 2013). Некоторые высокосульфатирован-ные полисахариды, выделенные из морских водорослей, по антикоагулянтной активности не уступают гепарину (Farias et al., 2000; Cicala et al., 2007; Cipriani et al., 2009; de Azevedo et al., 2009) и рассматриваются в качестве перспективных источников прямых антикоагулянтов (Camara et al., 2011). Вместе с тем, опубликованные сведения в отношении эффектов растительных полисахаридов на процессы агрегации тромбоцитов противоречивы. В одних случаях образцы полисахаридов проявляли протромботические и проагрегантные свойства (de Azevedo et al., 2009; Hagimori et al., 2009; Rodrigues et al., 2011; Manne et al., 2013), в других, наоборот, оказывали ан-титромботическую и антиагрегантную активность (Zhu et al., 2010; Chen et al. 2011; Zhao et al., 2012; Bijak et al., 2013; Sokolova et al., 2013b). В настоящей работе на одних и тех же экспериментальных моделях проведена сравнительная количественная оценка проагрегантных и антиагрегантных свойств у представителей всех групп растительных некрахмальных полисахаридов: пектинов, альгинатов, каррагинанов и фу-коиданов.
Цель работы: установление закономерных связей структуры некрахмальных полисахаридов с их проагрегантной и антиагрегантной активностью, как теоретической основы для разработки новых лекарственных препаратов, предназначенных для применения в качестве антиагрегантных средств.
Задачи работы:
-
изучить влияние пектинов, альгинатов, каррагинанов и фукоиданов на спонтанную агрегацию тромбоцитов человека;
-
изучить влияние пектинов, альгинатов, каррагинанов и фукоиданов на агрегацию тромбоцитов человека, индуцированную АДФ, коллагеном и адреналином;
-
исследовать воздействие фукоиданов на агрегацию и коагуляцию крови у экспериментальных животных при парентеральном введении;
-
исследовать воздействие каррагинанов и фукоиданов на показатели агрегации и коагуляции крови у экспериментальных животных при пероральном введении;
5. оценить антитромботический потенциал образцов фукоидана на модели острого артериального тромбоза.
Научная новизна и теоретическое значение работы. Проведена сравнительная количественная оценка проагрегантной и антиагрегантной активности у представителей всех групп растительных некрахмальных полисахаридов: пектинов, альгина-тов, каррагинанов и фукоиданов. Проведен анализ зависимости уровня агрегационной активности некрахмальных полисахаридов от химической структуры и молекулярной массы. Установлены наиболее эффективные образцы некрахмальных полисахаридов в отношении антиагрегантной и проагрегантной активности.
Теоретическое значение работы заключается в установлении новых закономерных связей структуры и физико-химических свойств некрахмальных полисахаридов с их антиагрегантной и проагрегантной активностью.
Практическая значимость исследования. Препараты некрахмальных полисахаридов можно рассматривать в качестве дополнительных средств в комплексном лечении заболеваний, сопровождающихся тромбоэмболическими нарушениями. Полученные экспериментальные данные являются основой для более глубоких доклинических исследований и клинических испытаний новых фармацевтических субстанций, обладающих антикоагулянтной и антитромботической активностью.
Разработан точный, легко воспроизводимый и высокоэффективный в исполнении способ диагностики артериального тромбоза у лабораторных животных, основанного на анализе формы объемной пульсовой волны, регистрируемой фотоплетиз-мографическим методом.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Сульфатированные некрахмальные полисахариды способны оказывать двойной эффект на агрегацию: повышают спонтанную агрегацию и ослабляют индуцированную.
-
Механизм антитромбоцитарного действия сульфатированных полисахаридов при индуцированной агрегации обусловлен конкурентными взаимоотношениями с эндогенными агонистами рецепторов на тромбоцитах.
Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на отчетной конференции в рамках целевой комплексной программы фундаментальных научных исследований ДВО РАН (Перспективные направления развития на-нотехнологий в ДВО РАН): «Получение, исследование и моделирование биогенных и
биомиметических наноструктурированных материалов» (Владивосток, 2010), IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), Международной научно-практической конференции «Тенденции и инновации современной науки» (Краснодар, 2012), IX, X Дальневосточном региональном конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток, 2012, 2013), Юбилейном XX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2013), IX Международной научно-практической конференции «Новые достижения европейской науки» (София, 2013), V Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», (Санкт-Петербург, 2013), XVIII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека», (Самара, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 5 статей в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК.
Личный вклад автора. Лично автором проделан основной объем работ по выделению, очистке, характеристике экспериментальных образцов полисахаридов, разработке дизайна экспериментов, планированию и проведению опытов с животными и исследований in vitro, систематизации, анализу экспериментальных данных, статистической обработке результатов, обобщению литературных данных по теме диссертации. Оригинальный метод регистрации количественных параметров экспериментального тромбоза на крысах разработан совместно со старшим научным сотрудником лаборатории биофизики клетки Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН к.б.н. А.А. Карпенко.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 128 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, двух глав исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.
Фармакологическая регуляция гемостаза некрахмальными полисахаридами
Некрахмальные полисахариды представляют собой макромолекулы, со-стоящие более чем из 10-ти мономерных единиц, соединенных друг с другом О-гликозидными связями. Они являются основными компонентами клеточных сте-нок и межклеточного вещества растений (Craigie, 1990; Cummings, Stephen, 2007). К некрахмальным полисахаридам высших растений относят целлюлозу, ге-мицеллюлозу, пектин, арабиноксиланы, -глюкан, глюкоманнаны и камеди. Не-крахмальные полисахариды водорослей включают агар, альгинат, каррагинан и фукоидан. Последние два являются сульфатированными полисахаридами. Суль-фатированные полисахариды – сложные гетерогенные полианионы, образованные из повторяющихся углеводных единиц, и отрицательно заряжены благодаря на-личию сульфатных групп (Rodrigues et al., 2010). Сульфатированные галактаны находятся в красных водорослях (Pereira et al., 2005; Silva et al., 2010; Amorim et al., 2011), сульфатированные фуканы содержатся в бурых водорослях (Berteau, Mulloy, 2003; de Azevedo et al., 2009; Fitton, 2011) и, наконец, арабино-галактаны наиболее часто встречаются в зеленых водорослях (Ciancia et al., 2007; Zhang et al., 2008). Хитозан является единственным представителем некрахмальных поли-сахаридов, который входит в состав скелета членистоногих, и его получают из панцирей ракообразных путем деацетилирования хитина (Knaul et al., 1999).
Некрахмальные полисахариды относятся к пищевым волокнам. Этот термин объединяет множество углеводов, обладающих физиологически полезным эффек-том на здоровье, а также определяет продукты, которые могут быть частью здоро-вой диеты. Комитет кодекса по питанию и пищевым продуктам для диетического питания (CCNFSDU, the Codex Committee on Nutriotion and Foods for Special Dietary Uses, 2009) определят пищевые волокна как углеводные полимеры с деся-тью или более мономерными остатками, которые не гидролизуются эндогенными энзимами в тонком кишечнике человека и находятся в составе потребляемой пи-щи, производятся из пищевого сырья, или являются синтетическими углеводными полимерами, имеющими доказанную физиологическую пользу для здоровья (Phil-lips, 2011). Некрахмальные полисахариды способствуют быстрому насыщению, снижению уровня холестерина и сахара в крови, увеличению объема химуса, а также обладают пребиотическими свойствами (Cummings, Stephen, 2007). Классификация пищевых углеводов основывается на размере молекул и оп-ределяется степенью полимеризации, типом связи и характеристикой отдельных мономеров. Химическая классификация необходима для согласованного измере-ния и маркировки, она создает основу для терминологии и понимания физиологи-ческих воздействий на организм. Некрахмальные полисахариды могут образовы-вать как линейные, так и разветвленные цепи. Важную роль в определении физи-ческих свойств и способности полисахаридов образовывать ассоциации с другими полисахаридами и белками играют боковые углеводные цепи и конфигурация их гликозидных связей (Хотимченко и др., 2005).
Некрахмальные полисахариды являются самыми разнообразными из всех групп углеводов и содержат смесь многих молекулярных форм, среди которых широко распространенной структурой является линейная цепочка 1-4–связанного глюкана (Phillips, 2011).
Пектины являются полимерами с наиболее изученной химической структу-рой. Они состоят из остатков D-галактуроновой кислоты, которые соединены друг с другом a(1-4)-связью (Рис. 1). Сложная структура пектина включает три основ-ные части: гомогалактоуронан, рамногалактоуронан I и рамногалактоуронан II (Ridley et al., 2001; Round et al., 2010). Гомогалактоуронан представляет собой -(1-4)связанные остатки D-галактуроновой кислоты с разнообразной степенью ме-тилэтерификации. Рамногалактоуронан I состоит из (1-2)--L-рамнозил-(1-4)-дисахаридных остатков -D-галактуроновой кислоты. Рамногалактоуронан II – это скелет гомогалактоуронана со сложными боковыми цепями (Ridley, 2001; Round et al., 2010). Часть остатков галактуроновой кислоты является метил-этерифицированной в положении С-6 и/или O-ацетилированной в положениях С-2 и С-3. Различают высокоэтерифицированные и низкоэтерифицированные пекти-ны, или высокометоксилированные и низкометоксилированные пектины, соответ-ственно (Рис. 1). Степень этерификации тем выше, чем больше групп этерифици-рованы метиловым спиртом в полимерной цепочке пектина. К высокоэтерифици-рованным пектинам относятся пектины со степенью этерификации более 50%, к низкоэтерифицированным – менее 50% (обычно 30-40%) (Schols, Voragen, 1996). В природных пектинах более половины карбоксильных групп галактуроновой ки-слоты этерифицированы метиловым спиртом, поэтому из растительного сырья получают высокоэтерифированные пектины. Для того, чтобы получить низкоэте-рифицированные пектины, природные полисахариды подвергают деэтерифика-ции. Таким образом можно получать препараты пектинов с заданными физико-химическими свойствами. Основными источниками коммерческого пектина являются яблочные вы-жимки и кожура цитрусовых плодов (Thakur et al., 1997). Молекулярная масса пектинов составляет около 80000 Да, что соответствует примерно 400 остаткам галактуроновой кислоты (Mohnen, 2008).
Оценка анти- и проагрегантной активности некрахмальных полисахаридов и препаратов сравнения in vitro
В качестве препаратов сравнения использовали раствор для инъекций дик-лофенака натрия в концентрации 25 мг/мл (Хемофарм, Болгария) и гепарин для инъекций 5000 ед./мл (Брынцалов, Россия). Получение обогащенной тромбоцитами плазмы Плазму крови получали от 79 условно здоровых добровольцев – мужчин в возрасте 18–30 лет. Взятие крови проводили утром натощак в вакуэтты, содер-жавшие в качестве антикоагулянта 3,8% раствор цитрата натрия (соотношение крови и антикоагулянта составило 9:1). Для получения плазмы, обогащенной тромбоцитами (ОТП), кровь центрифугировали в течение 15 мин при скорости 200 g и температуре 20С. Полученные образцы плазмы использовали в течение 3 ч. Описанная манипуляция была выполнена с соблюдением процедуры добро-вольного информированного согласия на участие в исследовании и одобрена Эти-ческим комитетом Тихоокеанского государственного медицинского университета (протокол № 3 от 27.12.2010).
Исследование агрегации тромбоцитов Спонтанная агрегация тромбоцитов. Спонтанная агрегация тромбоцитов и их концентрация измерялась на двухканальном лазерном анализаторе агрегации 230LA (НПФ "БИОЛА", Россия). Формирование микроагрегатов в ОТП было за-писано с использованием высокочувствительного метода, основанного на анализе флуктуаций светового потока в суспензии тромбоцитов (Gabbasov Z.A., 1989). На основе анализа кривой спонтанной агрегации изучали способность тромбоцитов к образованию агрегатов малого размера менее 100 клеток. Агрегацию измеряли при 37oC и постоянном перемешивании (800 об/мин) в течение 5 мин. 15 мкл не-крахмальных полисахаридов добавляли к ОТП в различных концентрациях за 5 мин до начала измерения агрегации. Определяли максимальный размер агрегатов R (уровень агрегации). Прибор был откалиброван по размеру отдельных тромбо-цитов, принятых за 1. Агрегацию тромбоцитов выражали в условных единицах (у.е.).
Индуцированная агрегация тромбоцитов. Индуцированная агрегация тромбоцитов регистрировалась турбидиметрически на основании световой агре-гатометрии на двухканальном лазерном анализаторе агрегации 230LA (НПФ "БИОЛА", Россия) согласно методу Борна (Born, 1962, O Brien, 1962). Методом световой агрегатометрии по Борну в ответ на высокие дозы индукторов оценива-ли образование агрегатов большого размера (свыше 100 клеток). 300 мкл ОТП предварительно нагревали при 37C 2 минуты в стеклянных кюветах, обработан-ных силиконом, и реакцию инициировали добавлением раствора агониста, содер-жащего АДФ, адреналин или коллаген в конечных концентрациях 5 мкМ, 0,5 мкг/мл, 0,1 мг/мл, соответственно. Реакция продолжалась как минимум 6 минут при перемешивании (800 об/мин). Агонисты добавлялись к обогащенной тромбо-цитами плазме через 10 с после начала регистрации и измерение проводилось в течение 5 мин 50 с после добавления индуктора. 15 мкл некрахмальных полиса-харидов добавляли к ОТП за 5 мин до добавления агониста. Процесс образования агрегатов визуализировали графически. Анализ агрегационных кривых включал максимальный уровень светопропускания (T%, макс).
Исследуемые образцы Образцы пектинов, альгинатов, каррагинанов и фукоиданов растворяли в физиологическом растворе натрия хлорида и добавляли в плазму в объеме 15 мкл. В качестве контроля использовали плазму, в которую вносили 0,9% раствор на-трия хлорида. Конечные концентрации фукоидана при внесении в плазму соста-вили 0,045, 0,09, 0,18 и 0,45 мг/мл. Рассчитывая содержание фукоидана, исходили из среднего содержания фукозы в фукоидане, которое равно 50%, для чего умно-жали выход фукозы на 2 (Усов и др., 2001). Конечные концентрации -, -, -каррагинанов составили 0,5 мг/мл, 1 мг/мл, 2,5 мг/мл. Конечные концентрации альгината натрия и пектинов составили 0,05, 0,125, 0,25 мг/мл.
Для контроля стерильности исследуемые образцы оценивали на микробио-логическую чистоту, которую оценивали путем посева на сахарный бульон.
2.4. Характеристика экспериментальных животных
Экспериментальные исследования были выполнены на 100 половозрелых белых нелинейных крысах-самцах массой 250-300 г. Животные были выведены и содержались в виварии Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток. Животных содержали в стандартных условиях, при естествен-ном освещении и постоянной температуре 20-22С согласно нормам содержания лабораторных животных (Западнюк и др., 1974) и с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Между-народные рекомендации Европейской конвенции по защите позвоночных живот-ных. Страсбург, 1986). Во время экспериментальных исследований крыс помещали в специальные пластмассовые клетки со стружечной подстилкой по 5-6 животных в каждой. Все животные помимо сбалансированного рациона получали хлеб, овес, свежие ово-щи и фрукты, мел, также в зимнее время к рациону добавляли комплексные поли-витаминные препараты. Содержание, выбор и подготовку животных для экспериментов осуществ-ляли по общепринятым рекомендациям. При разделении животных на группы проводили их ранжирование по массе тела с целью обеспечения идентичности указанных групп по данному показателю. Эксперименты проводили в соответст-вии с правилами бережного обращения с лабораторными животными и с разре-шения этического комитета при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государ-ственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Протокол № 3 дело № 13 от 27.12.2010 года). За время экспериментальных исследований не было случаев падежа крыс. Содержание животных, наркоз, декапитацию осуществляли в соответствии с тре-бованиями Рабочей группы Федерации Европейского Сообщества по науке лабо-раторных животных.
В первой экспериментальной модели мы исследовали воздействие -каррагинанов и фукоидана на показатели гемостаза крови у экспериментальных животных при пероральном введении. Во второй экспериментальной модели ис-следовали воздействие фукоидана на гемостаз крови у экспериментальных жи-вотных при парентеральном введении.
В эксперименте оценивали влияние сульфатированных некрахмальных по-лисахаридов на агрегацию тромбоцитов, коагуляцию плазмы и количественный и качественный состав клеток крови. Материалом для исследований служили кровь и ее фракции: обогащенная тромбоцитами плазма, бестромбоцитарная плазма. Кровь для исследования гемостаза в объеме 4,5 мл аккуратно смешивали с 0,5 мл 3,0% раствора цитрата натрия. Для исследования количественного и качественно-го состава клеток крови на автоматическом анализаторе кровь набирали в специ-ально подготовленные микроветы, содержащие 6% раствор ЭДТА.
Методика забора крови у лабораторных животных Кровь для исследования получали пункцией сердца. У наркотизированного животного выстригали шерсть в предполагаемом месте укола и дезинфицировали кожу. Пальпаторно определяли место конечного толчка сердца. На 1 см крани-альнее от установленной точки, отступив 1-2 мм латеральнее от левого края гру-дины, делали укол, держа иглу вертикально (Западнюк и др., 1974). Методика получения обогащенной и бедной тромбоцитами плазмы В качестве стабилизатора использовали 3,0%-ный раствор цитрата натрия в соотношении антикоагулянта и крови 1:9 (Закревская, 1990). Кровь центрифуги-ровали при 200 g в течение 20 мин для получения обогащенной тромбоцитами плазмы. Верхний слой плазмы аккуратно отбирали, оставшуюся часть пробы цен-трифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин для получения бестромбоци-тарной плазмы.
Анти- и проагрегантная активность некрахмальных полисахаридов in vitro
Исследование спонтанной агрегации тромбоцитов при внесении растворов несульфатированных полисахаридов выявило их способность образовывать агре-гаты малого размера (табл. 2, 3, 9). Так, при концентрации высокоэтерифициро-ванного пектина 0,05 мг/мл степень агрегации повышалась в 2,3 раза, а в дозе 0,125 и 0,25 мг/мл – в 2,7 и 3,8 раз, соответственно (рис. 12). Под влиянием низко-этерифицированного пектина со степенью этерификации 9,6% уровень агрегации повышался, но в меньшей степени, чем под влиянием высокоэтерифицированного пектина. Пектин со степенью этерификации 9,6% в концентрации 0,05 мг/мл по-вышал степень агрегации в 1,4 раза, при концентрации 0,125 мг/мл – в 1,5, а при концентрации 0,25 мг/мл – в 3,6 раз.
По оси абсцисс – образование агрегатов тромбоцитов в реальном времени, мин; по оси ординат – уровень спонтанной агрегации выраженный в условных единицах (у.е.), где за 1 у.е. принимается диаметр одного тромбоцита.
Исследование спонтанной агрегации тромбоцитов при внесении растворов низкомолекулярных пектинов с молекулярной массой 1,3 кДа и 9,8 кДа не выяви-ло способности образовывать агрегаты: различия не были статистически значи-мыми (табл. 4, 5).
Зависимость изменения степени светопропускания коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов (%) от концентрации высокоэтерифици-рованного пектина. Здесь и на рис. 14: по горизонтали – концентрация полисахарида, мг/мл, по верти-кали – степень светопропускания, %. На гистограмме значения анализируемого показателя выражены в виде в виде среднего значения (М) и стандартного откло-нения (SD).
АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов под действием высокоэтери-фицированного пектина со степенью этерификации 60,2%, искусственно деэтери-фицированного пектина со степенью этерификации 9,6%, низкомолекулярных пектинов с молекулярной массой 1,3 кДа и 9,8 кДа не изменялась: различия не были статистически значимыми (рис. 15, табл. 7, 8).
Кривые влияния низкоэтерифицированного пектина на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Кривые спонтанной агрегации тромбо-цитов в норме (1), под действием низкоэтерифицированного пектина в дозах 0,05 мг/мл (2), 0,125 мг/мл (3) и 0,25 мг/мл (4).
Низкие концентрации раствора альгината натрия вызывали бльшее повы-шение агрегации по сравнению с пектинами (рис. 16). Альгинат в концентрации 0,05 мг/мл достоверно повышал степень агрегации в 2,7 раз, а в дозе 0,125 мг/мл – в 4 раза, увеличение концентрации до 0,25 мг/мл вызывало незначительное повы-шение агрегации и было недостоверным (табл. 9). Это может быть связано с тем, что рабочий диапазон концентраций альгината натрия составляет 0,05-0,125 мг/мл. Таким образом, независимо от используемого полисахарида происходило повышение агрегации, но количество клеток в агрегатах не превышало 10. Рис. 16. Агрегатограммы спонтанной агрегации тромбоцитов под влиянием альгината натрия. Кривые спонтанной агрегации тромбоцитов в норме (1), под влиянием альгината натрия в дозах 0,05 мг/мл (2), 0,125 мг/мл (3) и 0,25 мг/мл (4).
По оси абсцисс – образование агрегатов тромбоцитов в реальном времени, мин; по оси ординат – уровень спонтанной агрегации выраженный в условных единицах (у.е.), где за 1 у.е. принимается диаметр одного тромбоцита.
АДФ-, коллаген и адреналин-индуцированная агрегация тромбоцитов под действием альгината натрия не изменялась: различия не были статистически зна-чимыми (табл. 10, рис. 17, 18, 19).
Внесение 0,5 мг/мл раствора -каррагинана не вызывало статистически зна-чимых изменений степени агрегации тромбоцитов. При добавлении в плазму 1 мг/мл -каррагинана наблюдали достоверное снижение агрегации тромбоцитов, вызванной 5 мкМ АДФ, процент ингибирования составил 67,7%. При увеличении дозы -каррагинана до 2,5 мг/мл понижение агрегации составило 94,4%. Добавле-ние 0,5 мг/мл раствора -каррагинана за 5 мин до введения индуктора коллагена вызвало достоверное снижение агрегации на 27,8% по сравнению с контролем. При внесении в плазму 1 мг/мл -каррагинана наблюдали снижение коллаген-индуцированной агрегации на 74,2%, при добавлении 2,5 мг/мл полисахарида в ОТП регистрировали снижение агрегации на 98,1%. Под действием индуктора ад-реналина -каррагинан в дозе 0,5 мг/мл статистически значимых отличий в агре-гации тромбоцитов не вызывал. -каррагинан в дозе 1 мг/мл снижал адреналин-индуцированную агрегацию на 63,3%, а при увеличении дозы -каррагинана в 2,5 раза снижал агрегацию на 94,5% (табл. 11). -Каррагинан удлинял латентную фа-зу коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов в 1,5 раза (рис. 21). Нор-мальная агрегация тромбоцитов под действием агониста коллагена характеризу-ется достаточно выраженной латентной фазой. Агрегация тромбоцитов после вне-сения раствора -каррагинана характеризуется удлинением лаг-фазы по сравне-нию с контролем. При внесении -каррагинана в количестве 0,5 мг/мл в ОТП происходило снижение агрегации тромбоцитов на 37,6 % под действием индуктора АДФ, при повышении концентрации полисахарида в 2 раза наблюдали достоверное сниже-ние АДФ-индуцированной агрегации на 72,9%, при увеличении концентрации по-лисахарида еще в 2,5 раза степень ингибирования составила 95,8%. І-каррагинан в концентрации 0,5 мг/мл снижал процент светопропускания коллаген-индуцированной агрегации на 25,4%, в дозе 1 мг/мл понижал на 80,7%, при до-бавлении 2,5 мг/мл -каррагинана регистрировали снижение агрегации на 94,5%. При добавлении -каррагинана в дозе 0,5 мг/мл степень ослабления адреналин-индуцированной агрегации составил 19,3% по сравнению с контролем, -каррагинан в концентрации 1 мг/мл снижал степень агрегации на 61,4 %. При внесении 2,5 мг/мл мкг -каррагинана наблюдали достоверное снижение агрега-ции тромбоцитов, вызванной адреналином, процент ингибирования составил 91,2% (табл. 12).
Исследуемые полисахариды в малой концентрации преимущественно по-давляли вторую фазу АДФ-индуцированной агрегации (рис. 22). Нормальная аг-регация тромбоцитов характеризуется первой волной, индуцированной агонистом АДФ, за которой следует вторая волна, в результате выброса тромбоцитарного пула. Кривая агрегации тромбоцитов после внесения раствора -каррагинана ха-рактеризуется только первой волной, индуцированной агонистом АДФ, который не вызывал вторую волну агрегации тромбоцитов. С увеличением концентрации растворов каррагинанов исследуемые вещества ингибировали и первую фазу АДФ-индуцированной агрегации.
Влияние сульфатированных полисахаридов на гемостаз у экспериментальных животных
Наиболее физиологичным способом приема лекарственных веществ являет-ся пероральный путь, особенно при длительном приеме лекарственных средств или в качестве профилактики заболеваний. В настоящей главе приведены данные по сравнительной оценке эффективности образцов лямбда-каррагинана и фукои-дана на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз в организме экспериментальных жи-вотных.
Объектом исследований явились 26 крыс-самцов. В эксперименте оценива-ли влияние сульфатированных некрахмальных полисахаридов на агрегацию тромбоцитов, коагуляцию плазмы и количественный и качественный состав кле-ток крови. Для этого крыс массой 200 г разделяли на группы. Первой группе – контрольной – ежедневно вводили внутрижелудочно 1-1,5 мл дистиллированной воды с помощью металлического зонда. Вторую группу со-ставляли животные, которым с помощью металлического зонда вводили в желу-док растовор лямбда-каррагинана в дозе 250 мг/кг массы тела один раз в сутки в течение 28 дней. Третью опытную группу составляли животные, которым с по-мощью металлического зонда вводили в желудок растовор фукоидна в дозе 500 мг/кг массы тела (фукоидана в препарате 50%) один раз в сутки. Опыты продол-жались 28 дней. На 29-й день у животных под легким эфирным наркозом произ-водили внутрисердечный забор крови. Материалом для исследований служили кровь и ее фракции: обогащенная тромбоцитами плазма, бестромбоцитарная плазма. Кровь для исследования гемостаза в объеме 4,5 мл аккуратно смешивали с 0,5 мл 3,0% раствора цитрата натрия. Для изучения агрегации тромбоцитов по-лучали багатую тромбоцитами плазму, для чего ее центрифугировали при скоро-сти 1000 об/мин в течение 15 минут, полученную плазму аккуратно отбирали. По-сле чего оставшуюся кровь центрифугировали при скрости 3000 об/мин для полу-чения бестромбоцитарной плазмы, которую использовали для изучения коагуля-ционного гемостаза. Для исследования количественного и качественного состава клеток крови на автоматическом анализаторе кровь набирали в специально подго-товленные микроветы, содержащие 6% раствор ЭДТА. Определяли активирован-ное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое время, тромбиновое время, фибриноген, агрегацию тромбоцитов, а также проводили анализ количест-венного и качественного состава клеток крови: количество эритроцитов, гемогло-бина, средний объем эритроцитов, среднее содержание и среднюю концентрацию гемоглобина в эритроцитах, гематокрит, количество тромбоцитов, средний объем тромбоцитов, тромбокрит, количество лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, гра-нулоцитов.
В результате эксперимента, при пероральном приеме лямбда-каррагинана у экспериментальных животных отмечали снижение индуцированной агрегации тромбоцитов крыс на 17,4% по сравнению с контролем (p 0,05) (табл. 14). По результатам исследования общего анализа крови наблюдали достоверное повы-шение количества тромбоцитов на 16,3% (рис. 27), лейкоцитов на 39,5% (рис. 28), тромбокрита на 17,3% (рис. 29), при этом изменений остальных показателей не было обнаружено. У крыс, которым вводили фукоидан, было обнаружено сниже-ние индуцированной агрегации тромбоцитов на 15,6% по сравнению с контролем (p 0,05) (табл. 14). При пероральном приеме фукоидана достоверных изменений в формуле крови крыс не было обнаружено. При оценке коагуляционного звена не было
Эксперименты выполняли на 60 крысах-самцах, массой 300 - 350 гр., полу-чавших стандартную виварную диету. Перед введением исследуемых препаратов крыс наркотизировали золетилом (11,4 мг/кг) и ксилазином гидрохлоридом (9,1 мг/кг). Фукоидан вводили в яремную вену в дозах 0,31, 1,25 и 2,5 мг/кг, а в каче-стве препаратов сравнения использовали антиагрегант диклофенак в дозах 1,25, 2,5 мг/кг и прямой антикоагулянт гепарин в дозах 0,67, 1,15, 2,4 и 4,8 мг/кг. Кон-трольным животным вводили изотонический раствор натрия хлорида. Фукоидан оказывал достоверный дозозависимый антикоагулянтный эффект (табл. 15). Исследуемый полисахарид в концентрации 0,31 мг/кг удлинял АЧТВ в 1,66 раза по сравнению с контролем, в концентрации 1,25 мг/кг – в 3,24 раза, а в дозе 2,5 мг/кг – в 3,6 раз (p 0,05) (рис. 31). Фукоидан в концентрации 1,25 мг/кг увеличивал тест тромбинового времени в 1,74 раза, а в дозе 2,5 мг/кг не вызывал свертываемости плазмы (рис. 30). Фукоидан изменял тест протромбинового вре-мени в плазме крыс только в высоких дозах (рис. 32). Концентрация фибриногена в плазме не изменялась при всех исследуемых дозах (рис. 33).
Влияние фукоидана, выделенного из бурой водоросли Saccharina japonica, и препаратов сравнения на коагуляцию крови у крыс.
Примечание: 100 – отсутствие свертываемости плазмы более 100 с; ПВ – про-тромбиновое время; АЧТВ – активированное частичное тромбиновое время; ТВ – тромбиновое время. Достоверное отличие (p 0.05) по сравнению с контролем. Данные представлены в виде медианы (Ме) и значений квартильного диапазона (25%; 75%).
Фукоидан уменьшал АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов дозоза-висимо. В концентрации фукоидана 1,25 мг/кг агрегация тромбоцитов снижалась на 14,4%, а в концентрации 2,5 мг/кг – на 27,3%. Фукоидан в дозе 1,25 и 2,5 мг/кг сокращал время наступления дезагрегации на 11,2 и 29 %, соответственно (рис. 34). Антиагрегантный эффект полисахарида был сопоставим с активностью дик-лофенака (табл. 16). Рис. 34. Изменение времени наступления дезагрегации АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов крыс при введении фукоидана, выделен-ного из бурой водоросли Saccharina japonica, и препаратов сравнения. По горизонтали – концентрация полисахарида, мг/кг, по вертикали – время наступления дезагрегации, с. На гистограмме значения анализируемого показате-ля выражены в виде в виде среднего значения (М) и стандартного отклонения (SD), – p 0,05.
В группе животных, которым вводили фукоидан в дозе 2,5 мг/кг, количество тромбоцитов периферической крови уменьшилось на 23% по сравнению с кон-трольной группой (p=0,0428). Однако изменение данного показателя в группе фу-коидана было меньше, чем в группе животных, которым вводили гепарин (рис. 35). Рис. 35. Изменение количества тромбоцитов в периферической крови крыс под действием фукоидана, выделенного из бурой водоросли Saccharina japonica, и препаратов сравнения. По горизонтали – концентрация полисахарида, мг/кг, по вертикали – количество тромбоцитов крови крыс, 109/л. На гистограмме значения анализируемого показа-теля выражены в виде в виде среднего значения (М) и стандартного отклонения (SD), – p 0,05.
Таким образом, фукоидан, выделенный из бурой морской водоросли Sac-charina japonica, влияет на гемостаз крови крыс. В низких дозах фукоидан инги-бирует внутренний путь свертывания крови, а при увеличении вводимой дозы ин-гибирует и внешний, и внутренний пути гемостаза. Удлинение теста тромбиново-го времени под действием фукоидана свидетельствует о способности полисахари-да влиять на завершающий этап процесса свертывания. Проведенные исследова-ния показали, что степень антикоагулянтной активности фукоидана может быть сопоставима с таковой у гепарина. В то же время фукоидан в отличие от гепарина лишен такого побочного эффекта, как тромбоцитопения.
Современные способы регистрации экспериментального тромбоза пред-ставлены ультразвуковым, электромагнитным, микроскопическопическим и гра-виметрическим методами (Иванов и др., 2010; Kurz et al., 1990; Eitzman et al., 2000; Tang et al., 2003; Van Giezen et al., 1997; Vogel, 2008). Первые два способа регистрации наиболее доступны для исследования у крупных животных: кроли-ков, кошек, собак, приматов, но трудно воспроизводимы у мелких грызунов: крыс и мышей, хотя именно эти животные широко используются в экспериментальной фармакологии. Ультразвуковой способ оценки времени образования тромба тре-бует специальных навыков работы в узи-диагностике и высоких материальных за-трат. Измерение массы тромба в качестве единственного способа оценки степени тромбоза является недостаточно точным и требует применения дополнительных методов регистрации.
Для разработки точного, легко воспроизводимого и простого в исполнении способа регистрации артериального тромбоза у мелких животных использовали модель тромбоза с аппликацией хлорида железа трехвалентного (FeCl3) в качестве химического агента, индуцирующего тромбоз. Известно, что тромб, индуциро-ванный окисным железом в сонной артерии крыс, состоит из тромбоцитов и эрит-роцитов, опутанных фибриновым сгустком (Kurz et al., 1990). Эта модель исполь-зуется в качестве теста для изучения антитромботических (Tang et al., 2003) и профибринолитических свойств фармакологических субстанций (Van Giezen et al., 1997).
