Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Особенности гнойного раневого процесса 11
1.2 Клеточно-молекулярные механизмы заживления раны 13
1.3 Обмен веществ между органами и тканями в процессе ранозаживления 21
1.4 Общие принципы лечения гнойных ран 28
1.5 Использование сорбентов и растительных объектов для лечения и профилактики гнойных ран 30
1.6 Резюме по обзору литературных данных 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы 36
2.1 Характеристика объекта исследований 36
2.2 Моделирование гнойной раны 38
2.3 Подбор доз и дизайн исследования 39
2.4 Патоморфологическое исследование гнойных ран у экспериментальных животных 42
2.4 Исследование биологических жидкостей лабораторных животных 43
2.5 Методы статистического исследования 45
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 46
3.1 Патоморфологическая характеристика процесса ранозаживления фитоминералсорбентов (присыпка, гель) и спрея «Пантенол Фармстандарт», производства ОАО
«Фармстандарт-Лексредства» при моделировании гнойный ран у крыс 46 3.2 Морфологическое исследование кожи при моделировании гнойной раны 52
3.2. Динамика общего анализа и биохимических показателей крови у крыс на фоне моделирования гнойной раны и её коррекции ФМС 60
3.3. Исследование экссудата гнойной раны 85
3.4. Множественный регрессионный анализ морфологических и биохимических данных крови у экспериментальных животных.. 89
Обсуждение результатов 96
Заключение 100
Выводы 103
Список литературы
- Клеточно-молекулярные механизмы заживления раны
- Использование сорбентов и растительных объектов для лечения и профилактики гнойных ран
- Подбор доз и дизайн исследования
- Динамика общего анализа и биохимических показателей крови у крыс на фоне моделирования гнойной раны и её коррекции ФМС
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Раневые повреждения и возникающие в последствие гнойные процессы относятся к наиболее часто встречающимся патологиям в хирургии. Они имеют разную этиологию, широко распространены и сопровождаются различными осложнениями. Раневой процесс нельзя рассматривать, как чисто местное явление, так как при нём в большей или меньшей степени затрагиваются многие системы организма. Местная и общая инфекция приводит к самым разнообразным нарушениям систем и функций организма. Нарушается обмен веществ и кроветворение, меняется микроциркуляция, происходит угнетение функций печени.
На сегодняшний день в арсенале медиков имеется широкий спектр различных методов и средств лечения гнойных ран. При этом, метод местного лечения ран остаётся самым распространенным в силу своей доступности, дешевизны, а главное результативности. Со временем многие средства утрачивают свою эффективность вследствие выработки устойчивости патогенной микрофлоры к данному препарату (Блатун Л.А., 2011; Виденин В.Н., 2005; Веремей Э.И., и др. 2010, Кузин М.И., 2011; Grose R. et. al., 2004; Martin P. et. al., 2005).
Степень разработанности темы исследования
Исследования в области ранозаживляющих средств ведутся в течение многих десятилетий, в том числе изучается влияние сорбентов на раневой процесс. Сорбенты способны выводить из раны токсические вещества, гнойный экссудат, продукты клеточного распада, форменные элементы крови, а также патогенную микрофлору, усугубляющую тяжесть заболевания (Ермолаев В.А. и др., 2009; Касанов К.Н. и др., 2011; Dario G.M. et. al., 2014).
Ранее было доказано, что сорбенты на основе монтмориллонита обладают высокой сорбционной способностью, успешно справляются с нежелательной микрофлорой, оптимизируют процесс ранозаживления (Буханов Д.В. и др., 2014; Везенцев А.И. и др. 2012, 2014).
Однако, использование сухих форм сорбента затрудняет эпителизацию
раны, тем самым замедляя процесс регенерации ткани. Несмотря на высокую
степень детоксикации и дезинфекции на ранних стадиях процесса
ранозаживления, уменьшить время заживления представляется
затруднительным, т.к. возникают трудности удаления из тканей набухших гранул сорбента, что может привести к рецидиву гнойного процесса.
Гидрогелиевые и гидроколлоидные сорбенты на основе природных
полисахаридов обладают хорошо адгезирующими свойствами и образуют
непосредственно на ране эластичное паропроницаемое покрытие, не требующее
дополнительной фиксации. Однако, такие сорбенты являются не
эффективными в обильно экссудативных ранах.
Среди основных требований, предъявляемых к современным раневым
покрытиям, кроме функции защиты раны от инфицирования, следует отметить
необходимость обеспечения парогазопроницаемости и сорбционной
способности, достаточных для поддержания влажного состояния раны, а также способность поддерживать адгезию и рост клеток (Кабисова Г.С. 2013; Попов В.А. и др., 2013; Lpez-Galindo, A. et. al., 2004).
В связи с этим становится актуальным исследование экологически безопасных, биологически эффективных сорбционных композиций для лечения и профилактики гнойных последствий раневых повреждений на основе природного минерального и растительного сырья.
Цель работы: Изучение возможностей фармакологической коррекции течения гнойного раневого процесса с помощью различных лекарственных форм фитоминералсорбента на основе монтмориллонита.
Задачи исследования:
-
провести сравнительное изучение морфологических и функциональных характеристик организма на фоне моделирования гнойных ран у крыс и их фармакологической коррекции с помощью фитоминералсорбента на основе монтмориллонита;
-
изучить динамику общих клинических и биохимических маркеров крови экспериментальных животных на разных этапах течения гнойного раневого процесса и его фармакологической коррекции фитоминералсорбента на основе монтмориллонита;
-
провести биохимическое исследование экссудата гнойной раны у крыс с моделированием гнойного раневого процесса и его коррекцией с помощью фитоминералсорбента на основе монтмориллонита;
-
провести множественный корреляционный и регрессионный анализ морфологических и биохимических показателей крови экспериментальных животных.
Научная новизна
В работе впервые проведён сравнительный анализ морфологических,
гематологических и биохимических показателей тканей и биологических
жидкостей при лечении гнойных ран у крыс фитоминеральными сорбентами на
основе монтмориллонита месторождений Белгородской области. Впервые
получены оригинальные данные их влияния на течение раневого процесса и
скорость заживления раны. Впервые даны клиническая, гематологическая и
биохимическая характеристики течения раневого процесса при разных
способах лечения с использованием сухих и гелевых форм новых сорбционно-
активных композиций. Новыми являются данные о корреляционной
зависимости между процессами регенерации раневой поверхности и
морфологическими и биохимическими показателями крови.
Теоретическая и практическая значимость работы
Для специалистов в области гнойной хирургии даны обоснованные предложения об использовании морфологических и биохимических параметров крови для диагностики и контроля раневого процесса. Новые сорбционно-активные композиции в перспективе позволят расширить арсенал доступных отечественных раневых покрытий, имеющих более низкую стоимость по сравнению с зарубежными аналогами.
Методология и методы исследования
Диссертационное исследование выполняли на кафедрах фармакологии и
биохимии Медицинского института «НИУ БелГУ»; моделирование гнойных
ран, клинический осмотр, забор биологического материала у крыс линии
Вистар (четыре группы по 20 особей в каждой) осуществляли в центре
доклинических исследований «НИУ БелГУ», изучали течение раневого
процесса и сроки выздоровления при разных способах лечения;
морфологический и биохимический анализ крови животных осуществляли на сертифицированном оборудовании в биохимической лаборатории ОГБУЗ «Белгородской областной клинической больницы им. Св. Иосафа».
Основные положения, выносимые на защиту
-
Исследуемый фитоминералсорбент на основе монтмориллонита в форме геля и присыпки ускоряет заживление гнойных ран, уменьшает площадь раневой поверхности.
-
Исследуемый фитоминералсорбент на основе монтмориллонита на ранних стадиях раневого процесса способствует лимфогистиоцитарной инфильтрации и быстрому восстановлению соединительной ткани. Вторичное реинфицирование не происходит, за счёт высокой сорбционной способности изучаемого лекарственного средства.
-
Применение исследуемого лекарственного средства на основе монтмориллонита на фоне моделирования гнойной раны приводит к положительной динамике общего анализа и биохимических показателей крови у животных экспериментальных групп.
-
Применение фитоминералсорбента на основе монтмориллонита в экссудативную фазу процесса ранозаживления способствует снижению концентрации общего белка и стабилизации рН в ране, что благоприятствует течению процессов регенерации.
-
При проведении корреляционного и регрессионного анализов установлена высокая степень зависимости течения гнойного раневого процесса от клинических и биохимических показателей крови.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
Статистический анализ экспериментальных данных был произведен с помощью метода дисперсионного анализа, вычисляли факториальную дисперсию (Dфакт.) и отклонение от средней линии (m). Достоверность результатов исследования определяли методом Фишера по критерию t-Стьюдента. Уровень значимости р<0,05 принимался за достоверный.
Корреляционный анализ проводили с определением коэффициента корреляции по критерию согласия Пирсона. Из наиболее статистически значимых показателей строили множественную регрессионную модель, в качестве результативного признака были выбраны данные по изменению раневого дефекта. Все вычисления проводили с помощью программного обеспечения MS Excel XP.
Материалы диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на V Всероссийской научной интернет-конференции с международным участием «Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии
животных» (Казань, 2013); Международной научно-практической конференции
«Современное общество, образование и наука», (Тамбов, 2014), Всероссийской
научной конференции с международным участием «Сорбционные и
ионообменные процессы в нано- и супрамолекулярной химии», (Белгород,
2014), Региональной научно-практической конференции молодых
исследователей «Перспективные инновационные разработки молодых
исследователей Белгородской области – развитию региона» (Белгород, 2014), Научной сессии Медицинского института НИУ БелГУ (Белгород, 2015).
Публикации результатов исследований
По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, пять из них в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, две в журнале, представленном в международной базе данных Scopus.
Личный вклад автора в проведённые исследования
Заключается в непосредственном участии на всех этапах работы:
постановки целей и задач исследования, поиску актуальной литературы, выборе материалов и методов изучения, проведении научных экспериментов, анализе полученных результатов, формулировании выводов и апробировании на научно-практических конференциях разного уровня.
Структура и объём диссертации
Работа изложена на 127 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 179 источников, в том числе 57 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 32 таблицами и 12 рисунками.
Клеточно-молекулярные механизмы заживления раны
Полиморфоядерные лейкоциты выполняют в организме большое количество физиологических функций: регулировка поведения клеток воспаления, а также разрушение и удаление патогенных агентов и повреждённых тканей [31, 114, 117, 132, 138]. В первые 12 часов после травмы в рану поступают и моноциты [114, 117], которые становятся макрофагами. В отличие от нейтрофилов, моноциты имеют относительно большую продолжительность жизни и сохраняют высокую активность на последней стадии воспалительного процесса. Основной функцией моноцитов и макрофагов является лизис нежизнеспособных тканей и выделение медиаторов воспаления [4, 5, 61, 67, 148]. Образование экссудата в окружающих тканях трактуется, как совершенная защитная местная реакция [109].
Стимулирующее влияние на формирование защитных реакций организма и течение раневого процесса оказывают продукты распада тканей. Нуклеиновые кислоты стимулируют фагоцитоз, лейкопоэз, повышают защитные силы организма, улучшают иммунологические реакции, стимулируют рост и размножение клеток, принимают участие в синтезе белка и оказывают другие разнообразные воздействия на ранние и поздние стадии воспаления вплоть до стадии завершения [129]. Вторая фаза раневого процесса характеризуется развитием малодифференцированной грануляционной ткани, постепенно восполняющая раневую поверхность. Новообразованная ткань состоит из соединительно-тканных, сосудистых и эпителиальных компонентов [138].
Во вторую стадию (4-10 день) преобладает влияние парасимпатической системы и увеличение действия таких гормонов и медиаторов, как минералокортикостероиды, альдостерон, ацетилхолин. Повышается масса тела, нормализуется белковый обмен и процессы регенерации [44, 60, 129, 148]. Грануляционная ткань всегда возникает на границе между живой и мёртвой тканью. Это сопровождается резким уменьшением числа лейкоцитов. Грануляционная ткань обычно формируется в виде отдельных мелких очагов в глубине раневого дефекта. Эти очаги характеризуются интенсивным новообразованием капилляров [152, 155, 158, 164, 167].
Основными функциями грануляционной ткани является защитная (предотвращение влияния факторов внешней среды, инфекции и интоксикации, инкапсуляция очагов некроза и инородных тел) и репаративная (восстановление анатомической и функциональной целостности путём полной и неполной регенерации). Восстановление соединительной ткани играет решающую роль в процессе заживления раны и ликвидации последствий структурного и ункционального характера. Соединительная ткань в регенерирующей ране содержит волокнистые структуры, клеточные элементы, промежуточное вещество, сеть кровеносных и лимфатических сосудов, нервы и рецепторы [60, 69, 90, 138, 148]. По данным О.Н. Сороколетова (2004), соединительная ткань обладает высокой регенеративной способностью. Регенерат соединительной ткани образуется путем мобилизации и деления фиброцитов. Из фибробластов, возникших при делении фиброцитов, формируется волокнин. Эластичные волокна возрождаются одновременно с коллагеновыми волокнами.
Грануляционная ткань постепенно заполняет дефект и затем дифференцируется в стойкую фиброзную соединительную ткань. В созревающей грануляционной ткани постепенно запустевают сосуды и уменьшаются фигуры деления клеток. Сохранившиеся клеточные элементы ложатся по ходу волокон, принимая вид фиброцитов и гистиоцитов. Со временем соединительная ткань еще более уплотняется, гиалинизируется и переходит в рубцовую ткань. Поверхность раны затем эпителизируется. Закрытие раны кожей знаменует завершение процесса заживления. В регенеративном процессе раны особая роль принадлежит фибробластам, способным образовывать соединительно тканные матрицы [138, 147, 148]. Фибробласт является основной клеткой, обеспечивающей заживление ран и других повреждений тела. После нанесения раны воспалительная реакция характеризуется увеличением количества фибробластов, их размеров, повышается активность клеток эндотелия сосудов грануляционной ткани, макрофагов и тучных клеток. При заживлении ран в цитоплазме зрелых фибробластов увеличивается количество рибонуклеиновой кислоты и крупных липидных включений. Источники происхождения раневых фибробластов до настоящего времени до конца не выявлены. Некоторые авторы [147], считают, что предшественником фибробластов в ране является около раневой камбий, а именно, малодифференцированная адвентициальная клетка соединительной ткани, а другие в качестве предшественника их называют мононуклеарную кровяную клетку. Помимо того, что они являются одними из основных элементов грануляционной ткани, в продуктивной фазе заживления фибробласты участвуют в продукции коллагена и гликозамингликанов, а также контролируют миграцию лимфоцитов из крови [138, 147].
По мере заполнения раневого дефекта соединительно тканными элементами происходит эпителизация поверхности раны. Третья фаза раневого процесса – фаза реорганизации рубца. По мере созревания грануляционной ткани количество воды и клеточных элементов в ней уменьшается, коллагеновые волокна формируются в более грубые пучки и вследствие этого – образование плотной рубцовой ткани [5, 18, 152]. Формирование рубца и реорганизация рубцовой ткани обычно продолжается длительное время после эпителизации раны. В формировании рубца происходят закономерные изменения и при естественном течении этого процесса можно различать 4 стадии [67]. Первая стадия – эпителизация. Раны с частичным по глубине повреждением кожи заживают путем эпителизации. При этом наблюдаются два основных феномена: миграция и пролиферация клеток эпителия. После разрушения эпителия формируется сверток крови. Когда он подсохнет, образуется струп, который защищает глубокие слои раны. Процесс заживления начинается с миграции эпителиальных клеток, которая не зависит от их пролиферации. Миграция является доминирующим процессом. Перемещающиеся клетки растут из эпителия края раны и эпителия волосяных фолликулов и сальных желез, оставшихся в дне раны.
Использование сорбентов и растительных объектов для лечения и профилактики гнойных ран
Исследование ранозаживляющих свойств фитоминералсорбентов в форме присыпки и геля, а также спрея «Пантенол Фармстандарт» осуществляли на белых линейных крысах Wistar (80 шт.), которые были выбраны в качестве биологической модели.
ФМС – это комплексный сорбционный композит, основанный на неорганических минералов группы монтмориллонита и экстракта лекарственного растения Thymus serpylum. За счёт высокой сорбционной способности данное средство оказывает угнетающее действие на патогенную микрофлору [22, 23] и является хорошим нейтрализатором кислотной среды [27]. Биологически активные вещества, входящие в состав экстракта Thymus serpylum обладают антисептическими свойствами и стимулируют процессы регенерации [34, 112]. Для удобства применения при аппликации ран ФМС использовали в двух формах: присыпка и гель.
ФМС получают путем измельчения монтмориллонит содержащей глины (далее МСГ) и лекарственного растения Thymus serpylum. Осуществляют седиментационное обогащение МСГ в воде, сушат и измельчают.
Для получения экстракта ингредиенты используют в соотношении: сухое лекарственное растение к 40-70%-му этиловому спирту 1:10. Процесс экстракции ведут не менее 18 часов при температуре 18-25C. Однако, при повышении температуры до 60C процесс экстракции сокращается до 9 часов.
Для получения ФМС ингредиенты перемешивают в соотношении: экстракт лекарственного растения к обогащенной МСГ 3:1. Сушку полученного ФМС проводят при температуре не более 60C и измельчают до порошкообразного состояния.
Для получения гелевой формы ФМС в диспергатор последовательно загружают воду, гидроксиэтилцеллюлозу (ГЭЦ), сухой порошок ФМС, при необходимости ПВП, в следующих соотношениях масс.%: ГЭЦ 3,0 - 4,0 фитоминералсорбент 5,0 - 20,0 ПВП 0 - 1,0 Вода до 100 Диспергирование смеси в воде проводят при температуре 36-40С в течении 15 мин, затем при необходимости к полученной дисперсной системе добавляют ПВП и диспергируют еще в течение 15 минут. Внесение в композицию ГЭЦ более 4,0 масс.% препятствует равномерному диспергированию системы, менее 3,0 масс.% - не дает образования гелиевой фракции и получается слишком жидкая и неустойчивая дисперсионная система, которую невозможно зафиксировать на гнойной ране (заявка на патент №2015151461). Изучение влияния препаратов на процесс заживления гнойно некротических поражений кожных покровов проводилось на белых крысах с исходной массой 180-200 г обоего пола. Для исследования применялись здоровые животные с чистыми кожными покровами, прошедшие карантин в течение 14 суток и после карантина были рандомизированы по полу и массе тела. Условия содержания во время проведения исследования: температура воздуха – 22±2 С, влажность 40-70 %, световой режим 12 часов день, 12 часов ночь, по 6 крыс одного пола в клетке площадью 1600 см2. В качестве корма использовали экструдированный комбикорм для лабораторных животных (сертификат № РОСС RU/ПО81.ВОО.365 ГОСТ 50258-92), для питья – фильтрованную воду. Доступ к воде и пище свободный на всём протяжении эксперимента. За 1-2 дня до эксперимента кожу животных освобождали от шерсти с помощью крема для депиляции. Поверхность освобожденного от шерсти участка кожи составляла приблизительно 5x5 см, что составляет около 10 % от общей поверхности тела животных. 2.2 Моделирование гнойной раны Крысам были смоделированы гнойные раны. За 4 часа до операции отменялся прием корма и воды. Наркоз осуществлялся хлоралгидратом (300 мг/кг) и золетилом (150 мг/кг) внутрибрюшинно. Раны наносили в межлопаточной области средним диаметром 2,83 см2, что составляло 1% от всей поверхности кожи животных. В область ранения, с помощью кисетного шва, вшивали специальный порт (для сбора экссудата и локального исследования раны), в него вносили определённое средство, соответствующее экспериментальным группам. Далее на область раны наносили штамм Escherichia coly в фиксированной заражающей дозе 2108 микробных тел (рис. 2.1.).
Все исследования выполнялись с соблюдением требований «Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», принятой Советом Европы (Strasbourg, Франция, 1986) и Директивой Совета 86/609/ЕЕС от 24.11.1986
В рамках данной работы было проведено исследование динамики процесса ранозаживления исходя из изменений морфологической картины, общих клинических и биохимических показателей крови и экссудата.
Все животные были разделены на пять экспериментальных групп (табл. 2.1.), начиная со вторых суток, после нанесения модельной раны, осуществляли перевязки. В ходе лечения ежедневно до седьмых суток всем крысам очищали рану от гнойно-некротического секвестра, обильно промывали ранение и наносили определённое средство согласно схеме лечения.
Анализ экссудата В ходе проведения исследовательской работы изучали ранозаживляющее действие ФМС в формах присыпки и геля. В качестве препарата сравнения использовали «Пантенол Фармстандарт» Перевязку с помощью ФМС (присыпка, гель) осуществляли путём наложения 0,1 г препарата на повреждённую область ежедневно в течении всего периода эксперимента один раз в сутки. «Пантенол Фармстендарт» наносили ежедневно на пораженный участок кожи на расстоянии 10-20 см один раз в сутки так, чтобы вся пораженная поверхность была покрыта препаратом (перед употреблением баллон встряхивали). Данная техника перевязки была выбрана исходя из инструкции по применению препарата. Весь эксперимент проводили в течении 21 суток, что соответствует общепринятым срокам заживления раны [4, 5, 65, 70, 76]. Весь период ранозаживления был разделён на три этапа: воспаление, регенерация, образование рубца (рис. 2.2.).
Подбор доз и дизайн исследования
Морфологическая картина гнойной раны в данной группе животных на первой стадии раневого процесса однотипна - струп имеет толщину от 0,15 до 0,6 мм, состоящий из фрагментов некротизированной ткани с обломками лейкоцитов, толщина воспалительной инфильтрации до 1 мм (рис.3.7. А). В период регенерации произошла колликвация в области формирования струпа, который отторгался до заживления раны, присоединялась вторичная инфекция с обильным гнойным отделяемым, в центре раны некротизированная ткань с нейтрофильными лейкоцитами, их обломками (рис. 3.7. Б). На третьей фазе происходит слабовыраженная лимфо-гистиоцитарная инфильтрация, лейкоцитарная инфильтрация у крыс отсутствовала (рис. 3.7. В). А) Острая фаза раневого процесса (3-е сутки) 1. Фрагмент некротизированной ткани с нейтрофильными лейкоцитами и их обломками 2. Некротизированная поперечная полосатая мышечная ткань 3. Лимфоциты, моноциты 4. Тучные клетки Б) Фаза регенерации раневого процесса (9-е сутки) 1. Некротизированная ткань 2. Колонии микробов 3. Соединительная ткань 4. Нейтрофильные лейкоциты со своими обломками В) Фаза реорганизации рубца (20-е сутки) 1. Соединительная ткань 2. Жировая ткань 3. Лимфомоногистиоцитарная инфильтрация
Гистологические срезы с гнойных ран, при аппликации «Пантенол Фармстандарт», у крыс в эксперименте. А - Острая фаза раневого процесса (3-е сутки); Б - Фаза регенерации раневого процесса (9-е сутки); В -Фаза реорганизации рубца (20-е сутки). Окраска гематоксилином-эозином. Ув. 200. 3. ФМС в форме присыпки У крыс получавших ФМС в форме присыпки на острой фазе раневого процесса некротизированная ткань с густой инфильтрацией нейтрофильными лейкоцитами и кровяными сгустками (рис. 3.8. А). Появление соединительной ткани на раневых участях свидетельствует о начале регенерационных процессов (рис. 3.8. Б), также присутствуют да данном этапе некротизированная ткань с густой инфильтрацией до 0,85 мм в глубину нейтрофильными лейкоцитами. Фаза реорганизации рубца обусловлена присутствием соединительной ткани с густой лимфомоногистиоцитарной инфильтрацией (рис.3.8. В). А) Острая фаза раневого процесса (3-е сутки) 1. Некротизированная ткань 2. Нейтрофильные лейкоциты и их обломки 3. Кровь Б) Фаза регенерации раневого процесса (9-е сутки) 1. Некротизированная ткань 2. Соединительная ткань 3. Нейтрофильные лейкоциты со своими обломками В) Фаза реорганизации рубца (20-е сутки) 1. Лимфомоногистиоцитарная инфильтрация
Гистологические срезы с гнойных ран, при использовании ФМС в форме порошка, у крыс в эксперименте. А - Острая фаза раневого процесса (3-е сутки); Б - Фаза регенерации раневого процесса (9-е сутки); В - Фаза реорганизации рубца (20-е сутки). Окраска гематоксилином-эозином. Ув. 200. 4. ФМС в форме геля. Зона раневого дефекта у данной группы животных в острую фазу покрыта некротизированной тканью с нейтрофилами, глубина некроза составляет до1 мм (рис. 3.9. А). На стадии регенерации появляются точечные грануляции. Глубже лежит некротизированная соединительная ткань с аналогичной инфильтрацией (рис. 3.9. Б). На завершающем этапе происходит образование соединительной ткани с лимфомоногистиоцитарной инфильтрацией. В сосудах микроциркуляторного русла встречаются мегакариоциты (рис.3.8. В). А) Острая фаза раневого процесса (3-е сутки) 1. Некротизированная ткань с нейтрофильными лейкоцитами 2. Жировая ткань 3. Соединительная ткань 4. Некротизированная поперечная полосатая мышечная ткань 5. Лимфоциты, моноциты, тучные клетки и гистиоциты Б) Фаза регенерации раневого процесса (9-е сутки) 1. Некротизированная ткань с нейтрофильными лейкоцитами, их обломками 2. Жировая ткань 3. Соединительная ткань 4. Лимфомоноцитарная инфильтрация В) Фаза реорганизации рубца (20-е сутки) 1. Лимфомоногистиоцитарная инфильтрация 2. Мегакариоциты Рисунок 3.9 – Гистологические срезы с гнойных ран, при использовании ФМС в форме порошка, у крыс в эксперименте. А - Острая фаза раневого процесса (3-е сутки); Б - Фаза регенерации раневого процесса (9-е сутки); В - Фаза реорганизации рубца (20-е сутки). Окраска гематоксилином-эозином. Ув. 200. В результате проведенных микроскопических исследований раневого дефекта обнаружено, что при использовании ФМС на ранних стадиях раневого процесса способствует лимфомоногистиоцитарной инфильтрации и быстрому восстановлению соединительной ткани. Вторичного реинфицирование не происходило, за счёт высокой сорбционной способности препаратов. Применение «Пантенол Фармстандарт» при аппликации гнойных ран вызывал разложение ткани в области формирования струпа, струп отторгался до заживления раны, присоединялась вторичная инфекция с обильным гнойным отделяемым. Стоит отметить, что на завершающей стадии раневого процесса нейтрофильные лейкоциты присутствовали в гистологических препаратах только контрольной группы, что указывает на эффективность использования как ФМС так и «Пантенол Фармстандарт» при лечении гнойных ран.
Защитные силы организма при травмах у животных зависят от функционального состояния клеточного и гуморального звеньев иммунной системы, соединительной ткани и многих других систем, работа которых направлена на борьбу с инфекцией раневого дефекта в тканях и интоксикацией [33].
На протяжении всего эксперимента нами изучались морфологические показатели периферической крови у животных опытных и контрольных групп. Клиническая картина крови крыс на 3 сутки после нанесения модельной раны (табл. 3.2.) показывает, что у всех экспериментальных животных наблюдались острые кровопотери и резкое угнетение функций образования новых клеток.
Исследование системы красной крови раненых животных показало, что гемоглобин во всех группах достоверно был ниже фонового показателя в среднем на 11%, концентрация эритроцитов, также была пониженной, наблюдался сильный гемолиз в контрольной группе. Гематокрит, как показатель процентного соотношения форменных элементов к плазме крови, был достоверно ниже нормы. Количество тромбоцитов в I, II и III группах достоверно превышал исходный показатель на 29, 23 и 26% соответственно. Также наблюдалось сильное токсическое поражение, вследствие инфицирования лабораторных животных. Концентрация лейкоцитов в крови у крыс была занижена. В IV группе данный показатель достоверно ниже нормы на 19%.
Динамика общего анализа и биохимических показателей крови у крыс на фоне моделирования гнойной раны и её коррекции ФМС
Полученные данные за 1-е сутки гнойного процесса свидетельствуют, что у крыс во II и III экспериментальных групп, обладающие характерными признаками нагноения, имеют слабокислый или нейтральный характер: показатель рН находился в пределах от 5,88 до 7,09, что ниже пограничного критерия рН равного 7,20. Данный аспект говорит о нарушении кислотно-щелочного равновесия клеток и тканей и, как следствие об ацидозе.
Наиболее ярко выраженный ацидоз на вторые сутки экссудации наблюдался в контрольной группе. На третьи сутки рН гнойного экссудата изменялась в сторону кислого значения в группе, где применяли Пантенол. Стоит отметить, что на эти же сутки в экспериментальной группе,где применяли ФМС в форме присыпки экссудации не наблюдалось, так же в данной группе животных не было резких колебаний значений рН гнойного экссудата, что может свидетельствовать о ровном течении заболевания (табл 3.20).
Таким образом, проведенные исследования по изучению активной кислотности гнойных ран, в частности рН гнойных экссудатов, определили сдвиг концентрации Н+ в кислую сторону, независимо от выбора перевязывающего средства. Однако, у крыс экспериментальной группы, где перевязка раны осуществлялась сухой формой ФМС, экссудация прекратилась уже на 3-е сутки эксперимента, а также наблюдалась наиболее ровная динамика изменения рН.
Определение концентрации общего белка в выпотах является основным моментом в исследовании гнойных ран. При легком повреждении сосудов в очаг воспаления просачиваются не только низкомолекулярные альбумины, при более тяжелом повреждении в экссудате появляются крупномолекулярные глобулины и, наконец, наиболее крупные молекулы фибриногена, превращающиеся в ткани в фибрин. Общепринятым значением, различающим экссудат от транссудата, является то, что содержание белка в сыворотке биологического материала должно быть более 25 г/мл [113].
Данные по содержанию белка в экссудате раны представлены в табл.3.21.Расчёт был произведён по уравнению: y=0.0032x + 0.0061; R=0.9944, при аналитической длине волны: =547 нм
Концентрация общего белка в экссудате гнойных ран у крыс в эксперименте (M±m), n= №Экспериментальнойгруппы 1 сутки 2 сутки 3 сутки СБ, мг/см3 (I) контроль 34,0 ± 0,1904 21,6 ± 0,1210 90,0 ± 0,5041 (II) Пантенол 29,4 ± 0,1646 21,2 ± 0,1187 77,3 ± 0,4329 (III) ФМС присыпка 25,0 ± 0,1400 10,2 ± 0,0571 (IV) ФМС гель 54,5 ± 0,3052 35,1 ± 0,1966 108,8 ± 0,6093 Примечание достоверные различия по сравнению с I группой животных, p0.05
Результаты исследования показывают, что в I, II и IV опытных группах животных наблюдали увеличение концентрации общего белка в экссудате раны. На третьи сутки эксперимента в данных группах содержание белка в выпоте составляло больше, чем 25 г/мл, что говорит о том, что выпот из раны характеризуется как экссудат. В III экспериментальной группе концентрация общего белка имела отрицательную динамику, выпоты прекратились на 3 сутки эксперимента. На 1-е сутки эксперимента в экссудате концентрация белка составляла 25 г/мл, а на 2-е сутки – 10 г/мл, что меньше чем общепринятое значение для экссудата.
При увеличении проницаемости стенок сосудов, глюкоза также переходит в экссудат раны. Присутствие глюкозы в выпотных жидкостях создаёт благоприятную среду для развития патогенной микрофлоры. На настоящий момент нет исследований по содержанию глюкозы в выпотных жидкостях из гнойных ран. Концентрация глюкозы в экссудате или транссудате гнойных ран может коррелироваться с концентрацией глюкозы в крови, в следствии её выхода из кровеносного русла.
Показатели концентрации глюкозы в экссудате раны представлены в таблице 3.22.
Исходя из результатов исследования, в экспериментальных группах наблюдается неравномерное изменение концентрации глюкозы. У крыс I, III и iV опытных групп концентрация глюкозы изменяется волнообразно: повышается на 2 сутки эксперимента и понижается на третьи. Во II и III группах содержание глюкозы снижается на вторые сутки и поднимается на третьи.
Концентрация глюкозы в экссудате гнойной раны (M±m), n= №Экспериментальнойгруппы 1 сутки 2 сутки 3 сутки Сг, ммоль/дм3 (I) контроль 0,77±0,0077 2,27±0,0227 0,72±0,0072 (II) Пантенол 0,22±0,0022 1,39±0,0139 1,51±0,0151 (III) ФМС присыпка 0,33±0,0033 1,11±0,0111 (IV) ФМС гель 0,49±0,0049 2,22±0,0222 1,72±0,0172 Примечание достоверные различия по сравнению с I группой животных, p0.05 Таким образом, можно сделать вывод, что применение ФМС в экссудативную фазу процесса ранозаживления способствует снижению концентрации общего белка, что благоприятствует формированию процессов регенерации. Концентрация глюкозы в экссудате гнойной раны животных обратно пропорциональна концентрации глюкозы в крови. Данный метаболит может указывать на степень повреждения капилляров.
Сопоставляя представленные выше данные, можно сделать вывод о неоднозначности, и многогранности течения раневого процесса. Опираясь на результаты исследований биохимических и общих клинических показателей крови крыс, а также анализ экссудата, можно предположить возможные механизмы процесса ранозаживления.
Множественный регрессионный анализ морфологических и биохимических данных крови у экспериментальных животных. Целью регрессионного анализа явилось поиск статистически значимых факторов, максимально влияющих на течение раневого процесса и построение прогностической модели развития рецидива гнойного процесса после лечения ФМС.
В качестве зависимой переменной был взят процесс регенерации раневого дефекта, т.е. уменьшение площади раны. Независимыми предикторами выступали как категориальные данные, так и непрерывные. Для регрессионного анализа использовались следующие переменные: тип лечения (применение Пантенола и различных форм ФМС), биохимические и общие клинические данные крови. Основанием для отбора признаков, которые могли предлагаться алгоритму в качестве предикторов в уравнение регрессии, являлись результаты корреляционного анализа.