Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Патогенетическая роль нарушений функции эндотелия при инфекционных заболеваниях 12
1.2. Фармакологические эффекты статинов и L-норвалина при заболеваниях, сопровождающихся нарушениями функции эндотелия 33
2. Материалы и методы 47
2.1. Объект исследования 47
2.2. Моделирование эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции 47
2.3. Дизайн исследования, дозировки, способы и кратность введения статинов и L-норвалина 48
2.4. Информация о статинах и L-норвалине, изученных в работе 50
2.5. Оценка степени развития эндотелиальной дисфункции при моделировании патологии 51
2.6. Проведение функциональных нагрузочных проб на открытом сердце у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании 52
2.7. Оценка оксидантных показателей 53
2.8. Статистическая обработка результатов исследования 53
3. Результаты собственных исследований 55
3.1. Состояние функции сосудистого эндотелия и сократительной активности миокарда в условиях экспериментальной модели эндотоксин индуцированной эндотелиальной дисфункции 55
3.2. Использование статинов и L-норвалина в коррекции нарушений функции сосудистого эндотелия, сократительной функции миокарда и метаболических показателей у животных с экспериментальной моделью эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции 62
3.3. Сочетанное применение статинов и L-норвалина в коррекции нарушений функциональной активности эндотелия, сократительной функции миокарда и метаболических показателей у животных с эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункцией 73
Заключение 82
Выводы 96
Список литературы
- Фармакологические эффекты статинов и L-норвалина при заболеваниях, сопровождающихся нарушениями функции эндотелия
- Моделирование эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции
- Проведение функциональных нагрузочных проб на открытом сердце у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании
- Использование статинов и L-норвалина в коррекции нарушений функции сосудистого эндотелия, сократительной функции миокарда и метаболических показателей у животных с экспериментальной моделью эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Наиболее тяжелым осложнением инфекционного процесса является сепсис, смертность от которого составляет не менее 22,2 на 100 000 населения и зависит от исходной резистентности организма к инфекции, возраста, пола, сопутствующей патологии, активности систем регуляции гомеостаза, в том числе, от функциональной активности эн-дотелиоцитов (Богачева В.В., Гардовска Д.Х., 2014; Лазанович В.А. и др., 2015). Под эндотелиальной дисфункцией (ЭД) понимают дисбаланс между медиаторами, обеспечивающими оптимальное течение всех эндотелий-зависимых процессов. В условиях эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции (ЭИЭД) сосудистый эндотелий является средой для реализации нормальных и патологических иммунных и биохимических реакций, протекающих с участием медиаторов воспалительной реакции, оксида азота и его метаболитов, активных радикалов кислорода и т.д. (Конопля А.И. и др., 2006, 2014; Покровский М.В. и др., 2012, 2013; Бедило Н.В. и др., 2014; Goldenberg N.M. et al., 2011; Yang K.Y. et al., 2011).
Степень разработанности темы. Фармакологическая коррекция ЭИЭД при системном воспалении должна заключаться в применении препаратов прямо или опосредованно влияющих на функции эндотелия, его проницаемость и регуляторные свойства, связанные с этим метаболические сдвиги (Черноморцева Е.С., 2005; Покровский М.В. и др., 2013, 2015). В этой связи экспериментальной проверки требует использование статинов, которые, помимо эндотелиопротективных свойств, обладают выраженным противовоспалительным действием и могут быть использованы в клинической практике по показаниям, связанным с нарушением холестеринового обмена и ингибитора аргиназы L-норвалина, который должен эффективно повышать уровень L-аргинина и предотвращать эндогенное ингибирование NO-синтазы (Корокин М.В. и др., 2012; Свистунов А.А. и др., 2015).
Цель исследования – оценка эндотелио- и кардиопротективных эффектов статинов и L-норвалина у крыс с эндотоксин-индуцированной моделью эн-дотелиальной дисфункции.
Задачи исследования.
-
Выработать критерии, характеризующие развитие эндотелиальной дисфункции при экспериментальном моделировании эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции по совокупности результатов функциональных проб, оксидантных маркеров и активности антиоксидантных систем.
-
Установить фармакологическую эффективность розувастатина, симвастатина в коррекции нарушений функции эндотелия, функциональной активности миокарда, метаболических сдвигов у животных, которым вводили стафилококковый эндотоксин.
-
Установить фармакологическую эффективность L-норвалина в коррекции нарушений функции эндотелия, функциональной активности
миокарда и оксидантных показателей у животных, которым вводили стафилококковый эндотоксин.
-
Изучить эндотелио-, кардиопротективные и метаболические эффекты сочетания симвастатина и L-норвалина у крыс с эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункцией.
-
Изучить эндотелио-, кардиопротективные и метаболические эффекты сочетания розувастатина и L-норвалина у крыс с эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункцией.
Научная новизна. Установлены характер и степень изменений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитро-пруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация), сократительной способности миокарда, параметров, характеризующих процессы перекисного окисления ли-пидов, уровень стабильных метаболитов оксида азота в условиях эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции.
Впервые выявлена эффективность применения симвастатина в дозе 0,5 мг/кг, розувастатина в дозе 0,125 мг/кг, L-норвалина в дозе 10 мг/кг и их сочетаний в коррекции сосудистых реакций, сократительной функции миокарда и метаболических показателей у крыс с эндотоксин-индуцированной эндотели-альной дисфункцией. Обнаружены выраженные корригирующие эффекты ро-зувастатина, L-норвалина, в большей степени их сочетания, на гемодинамиче-ские показатели, функциональную активность миокарда и метаболические изменения, коэффициент эндотелиальной дисфункции у крыс, которым вводили эндотоксин.
Теоретическая и практическая значимость работы. Разработаны эффективные методы фармакологической коррекции сосудистых реакций и сократительной функции миокарда, метаболических сдвигов у крыс с эндоток-син-индуцированной эндотелиальной дисфункцией применением розувастати-на в дозе 0,125 мг/кг и L-норвалина в дозе 10 мг/кг.
В работе обоснована большая фармакологическая эффективность совместного применения розувастатина и L-норвалина для коррекции показателей функциональной активности эндотелия и миокарда в условиях экспериментальной эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции. Полученные результаты о применении статинов и L-норвалина позволяют формировать новые подходы к проведению лекарственной терапии инфекционного процесса.
Методология и методы исследования. В проведённом исследовании использовался комплексный подход по оценке эндотелио-, кардиопротектив-ных и антиоксидантных эффектов статинов и L-норвалина в условиях эндоток-син-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс. Дизайн исследования был составлен в соответствии с этическими нормами работы с лабораторными животными. Теоретическую и методологическую основы диссертации разрабатывали в соответствии с результатами, полученными отечественными и зарубежными учеными по данной проблеме. Исследование проведено с использованием необходимого количества животных, современного оборудования и адекватных поставленным задачам методов, позволяющих получить репрезентативные и достоверные данные.
Положения, выносимые на защиту.
-
Эндотоксин-индуцированная модель эндотелиальной дисфункции характеризуется выраженными изменениями соотношений сосудистых реакций, увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции, снижением резервов функциональной активности миокарда, активацией процессов перекисного окисления липидов, снижением уровня стабильных метаболитов оксида азота, активности антиоксидантных систем.
-
Внутрижелудочное введение розувастатина в дозе 0,125 мг/кг или L-норвалина в дозе 10 мг/кг по сравнению с симвастатином в дозе 0,5 мг/кг эффективнее корригирует функциональные нарушения эндотелия, сократительную способность миокарда и оксидантные показатели у крыс с моделью эндо-токсин-индуцированной эндотелиальной дисфункции.
-
Комбинированное использование L-норвалина и розувастатина по сравнению с сочетанием L-норвалина и симвастатина обладает более выраженным эндотелио- и кардиопротективным действием, корригирует процессы пе-рекисного окисления липидов и уровень стабильных метаболитов оксида азота при эндотоксин-индуцированной модели эндотелиальной дисфункции в эксперименте на животных.
Степень достоверности и апробация результатов. Научные положения и выводы диссертационного исследования обоснованы адекватным поставленным задачам выбором экспериментальной модели эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции, методов лабораторного мониторинга, высокой методической обеспеченностью, необходимой для правильной статистической обработки полученных результатов. Все это позволило сделать точные выводы, которые определены высокой достоверностью результатов.
Основные положения диссертации представлены на конференциях Курского государственного медицинского университета (2009-2010); V конгрессе «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология» (Санкт-Петербург, 2010), XXIII международной научно-практической конференции «Современные проблемы гуманитарных и естественных наук» (Москва, 2015), международной научно-практической конференции НИЦ «Поволжская научная корпорация» «Вопросы образования и науки: теоретический и практический аспекты» (Самара, 2015), XXIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2016), совместном заседании кафедр фармакологии, клинической фармакологии, инфекционных болезней, НИИ экологической медицины Курского государственного медицинского университета, кафедры фармакологии НИУ БелГУ (2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, 4 из которых в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ. В материалах содержится полный объем информации, касающейся темы диссертации.
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, проведении анализа отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации, оценке и обобщении полученных результатов. Автором лично проведены моделирование эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс, мониторинг параметров,
характеризующих эндотелиальную дисфункцию, сократительную функцию миокарда, метаболические показатели, аналитическая и статистическая обработка материала, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической и лабораторной реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику. Доля автора в совместных публикациях составила 80-90%.
Соответствие диссертации паспорту специальности. Диссертация соответствует паспорту специальности 14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 3, 4 и 8 паспорта специальности 14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология.
Диссертация выполнена в соответствии с планом научных исследований ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России (номер государственной регистрации 01201150274).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 таблицами и 9 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения собственных результатов, заключения, выводов, библиографического указателя, включающего 107 отечественных и 94 иностранных источников.
Фармакологические эффекты статинов и L-норвалина при заболеваниях, сопровождающихся нарушениями функции эндотелия
Эндотелиальная NO-синтаза (eNOS) представляет собой гомодимер, каждая субъединица которого включает редуктазный участок, содержащий в структуре которого есть локусы для связывания флавиновых кофакторов – флавинадениндинуклеотида и флавинмононуклеотида и для никотинамиддинуклеотидфосфата. Редуктазный участок является донором электронов для оксидазного участка другого мономера, где L-аргинин окисляется. Переход электронов регулируется кальций-кальмодулином в области между редуктазным и оксидазным участками (рисунок 1). Фермент располагается в лакунообразных участках плазматической мембраны эндотелиальных клеток размерами до 50-1000 нм, в непосредственной взаимосвязи с кавеолином. В этом блокированном состоянии каталитические свойства eNOS значительно снижаются [166]. Принципиально каталитический синтез оксида азота зависим от: 1) скорости транскрипции генов, обеспечивающих контроль переноса белковой части NOS с ДНК на матричную РНК (мРНК); 2) формирования мРНК-NOS; транспорт мРНК-NOS в места цитоплазматического ретикулума, где осуществляется синтез белка, так как определение содержания мРНК, которая не является кодирующим сегментом, но регулирует активность генов эндотелиоцитов при воспалении позволяет косвенно оценивать тяжесть общего состояния при сепсисе [173]; 3) от макроэргических соединений, присутствие которых создает энергию синтеза NO; 4) от активности синтезированных молекул NOS; 5) концентрации субстрата (L-аргинина внутри клеток) и посттрансляционных факторов [30, 65, 71]. В некоторых работах есть указания на полиморфизм генов, кодирующих eNOS. Супрессия, или стимуляция активности генов, вызывает развитие различных заболеваний, обусловленных ЭД. Установлен характер распространенности полиморфизма генов eNOS у японцев, корейцев, народов севера России. Определена недостаточная изученность этого вопроса [68]. Существенную роль выполняет тетрагидробиоптерин, который является обязательным компонентом для внутриклеточного синтеза оксида азота, необходим для гомодимеризации eNOS и регулирует редокс-состояние железа гема в процессе транспорта электронов, обеспечивая сопряженную работу фермента и субстрата [141]. Есть работы, в которых показана способность L-аргинина самостоятельно преодолевать процесс дезинтеграции в работе NOS, возникающей при различных патофизиологических факторах. Исследователями было показано, что взаимосвязь реакции синтеза оксида азота от совместного присутствия субстратов L-аргинина и тетрабиоптерина не обязательна, поскольку при отсутствии последнего осуществляется окисление L-аргинина [40, 65]. Следующим этапом становится реализация биохимических эффектов NO, происходящих при переходе этого соединения в расположенные глубже миоциты стенок сосудов. На уровне гладкомышечных клеток NO стимулирует растворимую гуанилатциклазу, повышая содержание 3,5-циклического гуанозинмонофосфата, снижая концентрацию кальция. Следствием является релаксация гладкомышечных клеток и вазодилатация [21, 124]. Биологическая роль вазодилатации заключается в защите сосудистой стенки, торможении процесса тромбообразования и агрегации тромбоцитов, окислении липопротеидов низкой плотности, экспрессии молекул адгезии, прилипании моноцитов и тромбоцитов к стенке сосуда и т. д. [116].
Таким образом, если ЭД неразрывно связана с дефицитом NO, то патогенетические механизмы инфекционного процесса, как и любого заболевания, требуют коррекции дефицита NO. Основными эндогенными ингибиторами eNOS являются: NG-диметил аргинин, то есть асимметричный диметиларгинин (АДМА) и NG-монометил L-аргинин (NMMA) [127]. Содержание в крови АДМА в 10 раз превышает уровень NMMA, поэтому более весомый вклад как ингибитор вносит АДМА.
В настоящее время обнаружены два типа ферментов, которые участвуют в реакциях трансметилирования с L-аргинином: протеин-аргинин 19 метилтрансфераза (PRMT-1), катализирующая синтез АДМА и NMMA, и PRMT-2, формирующий симметричный диметиларгинин (СДМА) [65, 190]. Последний является стереоизомером АДМА, но не влияет на eNOS. Кроме того, были идентифицированы четыре различных изомера протеин-аргинин метилтрансферазы, работающих при синтезе белков в клетках и тканях человека, которые различаются по субклеточной локализации, субклеточной специфичности и механизмам действия: PRMT-1 (протеин-аргинин-N-метил трансфераза-1), PRMT-2, PRMT-3 и HRMII-2 [142]. Основным источником метиловых групп, участвующих в различных реакциях метилирования, является S-аденозилметионин (промежуточный продукт в процессе превращения метионина в гомоцистеин [182]. Торможение же аденозилметионин-зависимых метилтрансфераз их ингибитором S аденозилгомоцистеином резко снижает формирование АДМА в эндотелии [162]. Различные клетки вырабатывают АДМА, в том числе эндотелиоциты. АДМА выводится с мочой, при этом конечным продуктом деградации соединения является его разрушение диметиларгинин диметиламиногидролазой, которая гидролизирует АДМА с образованием диметиламина и L-цитруллина [177]. Выявлено, что существует две изоформы этого фермента: диметиларгинин-диметиламиногидролаза-1, синтезируемая в тканях, в которых происходит экспрессия нейрональной NOS, диметиларгинин-диметиламиногидролаза-II – определяется в тканях с преимущественной экспрессией eNOS. Совместное пребывание диметиларгинин-диметиламиногидролазы и NOS свидетельствует о том, что концентрация L-аргинина значительно регулируется в клетках, генерирующих NO [65, 152].
Моделирование эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции
Эксперименты проводили на здоровых половозрелых крысах линии Вистар, массой 180-250 г. В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 18-20 животных. В контрольные и опытные группы входили животные одного возраста, полученные из питомника РАМН «Столбовая» одновременно. Разброс в группах по исходной массе не превышал 10%. Все исследования проводили в одно и то же время суток, с 8 до 12 ч, с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986), и согласно правилам лабораторной практики РФ (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.).
Моделирование эндотоксин-индуцированной ЭД проводили следующим образом. У фиксированных на спине экспериментальных животных, с соблюдением правил асептики и антисептики, под наркозом выбривали шерсть. Затем подкожно вводили 0,1 мл свежей взвеси Staphylococcus aureus (штамм 603, взятый из музея кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии КГМУ) в концентрации 10 миллиардов микробных тел в 1 мл. В последующем ежедневно проводили компрессионный, пневматический массаж места инъекции в течение 10 минут [58, 95]. После проведения функциональных проб, на 7-е сутки от моделирования патологического процесса, под наркозом, с тщательным соблюдением правил асептики и антисептики, осуществляли торакотомию, затем забор крови в объеме 5 мл из правого желудочка сокращающегося сердца. Выведение животных из эксперимента осуществляли передозировкой средств для наркоза.
Подтверждением развития сепсиса, вызванного Staphylococcus aureus 603, служили результаты бактериологического и бактериоскопического исследования образцов крови. Проводился бактериологический посев крови, после чего культура идентифицировалась как исходная (Staphylococcus aureus 603) с помощью определения факторов патогенности и фаготипа. Кроме этого, подсчитывали количество колониеобразующих единиц стафилококка в 0,1 мл крови.
Симвастатин. Регистрационный номер: ЛСР-002033/08. Фирма производитель: ЗиО-Здоровье (Россия). Торговое название: Симвастатин. Международное непатентованное название: симвастатин. Лекарственная форма: таблетки, покрытые пленочной оболочкой. Фармакотерапевтическая группа: гиполипидемическое средство, ГМГ-КоА-редуктазы ингибитор. Розувастатин. Регистрационный номер: П № 015644/01. Фирма производитель: Astra Zeneca UK Ltd. (Великобритания). Торговое название: Розувастатин. Международное непатентованное название: розувастатин. Лекарственная форма: таблетки, покрытые оболочкой. Фармакотерапевтическая группа: гиполипидемическое средство – ГМГ-КоА редуктазы ингибитор. L-Норвалин. Норвалин (-аминовалериановая кислота, пропилглицин) — нестандартная аминокислота, которая входит в состав некоторых белков, являясь в организме животных антагонистом валина и лейцина. Норвалин существует в виде двух стереоизомеров: L-норвалин и D-норвалин. Причем они легко различимы на вкус: L-норвалин горький, а D-норвалин сладкий. L-норвалин является ингибитором аргиназы (фермента, расщепляющего аргинин).
Химическое соединение, синтезированное WIRUD, GmgH, Hamburg. 2.5. Оценка степени развития эндотелиальной дисфункции при моделировании патологии
Развитие эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных оценивали по расчетному коэффициенту эндотелиальной дисфункции (КЭД).
Формула расчета коэффициента эндотелиальной дисфункции впервые предложена в лаборатории кардиофармакологии НИИ экологической медицины коллективом авторов под руководством профессора М.В. Покровского. При оценке результатов функциональной пробы на ЭЗВД использовалась площадь прямоугольного треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение ацетилхолина в дозе 40 мкг/кг. При этом за меньший из катетов данного треугольника принималась разность между исходным значением АД (перед проведением пробы) и минимальным значением АД после окончания кардиального компонента (рисунок 2).
Примечание: 1 – треугольник над кривой восстановления артериального давления в ответ на введение ацетилхолина; 2 – треугольник над кривой восстановления артериального давления в ответ на введение нитропруссида; 3 – окончание кардиального компонента и стабилизации частоты сердечных сокращений. Рисунок 2 – Динамика систолического и диастолического артериального давления и частоты сердечных сокращений при проведении функциональных сосудистых проб с внутривенным введением растворов ацетилхолина и нитропруссида натрия. При оценке результатов ЭНВД с введением нитропруссида в дозе 30 мкг/кг также использовалась площадь прямоугольного треугольника над кривой восстановления АД, точками меньшего катета которого являлись: исходное значение АД (перед проведением пробы) и точка максимального падения АД при сосудистой реакции.
Большими катетами в обоих треугольниках являлись показатели времени восстановления АД в ответ на внутривенное введение ацетилхолина и нитропруссида соответственно, выражаемое в секундах. Площадь исчисляемых треугольников выражалась в условных единицах (усл. ед.).
Предложенный коэффициент эндотелиальной дисфункции является отношением площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение НП (SНП) к площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение АХ (SАХ):
Проведение функциональных нагрузочных проб на открытом сердце у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика и аппарата для инвазивного измерения показателей гемодинамики Biopac (USA) и компьютерной программы AsqKnowledge 3.8.1 регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dtmax), максимальную скорость расслабления (-dp/dtmax), частоту сердечных сокращений (ЧСС) и интенсивность функционирования структур (ИФС) (произведение частоты сердечных сокращений и давления, развиваемого левым желудочком (мм рт. ст. х уд/мин) [53, 54, 83].
Проведение функциональных нагрузочных проб на открытом сердце у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании
В предыдущей главе были установлены изменения показателей функциональной активности сердечно-сосудистой системы у крыс с ЭИЭД, вызванной введением стафилококкового эндотоксина. Обнаружены повышение КЭД и нарушения сократительной способности миокарда. Эти изменения, вероятно, тесно связаны с метаболическими нарушениями, сопровождающими состояние эндотоксикоза. Универсальной основой этих нарушений служат активация процессов перекисного окисления липидов, усиление синтеза оксида азота. Однако возрастающий расход оксида азота в различных биохимических процессах становится причиной не только изменений микроциркуляции, но и синтеза весьма опасных для клеточных мембран соединений, таких как пероксинитрит ион, способных оказывать массивное повреждающее действие на клетки. В этой связи основными направлениями коррекции нарушений функции сердечно-сосудистой системы при эндотоксин-индуцированной ЭД служат: уменьшение содержания субстрата для перекисного окисления применением статинов и увеличение эффективной концентрации оксида азота путем введения L-норвалина.
У животных с ЭИЭД, получавших статины и L-норвалин, исходные сосудистые реакции не отличались от таковых группы интактных животных или крыс, не получавших препараты. При проведении пробы на ЭЗВД с АХ только в группе животных, получавших L-норвалин, наблюдалось достоверное по сравнению с группой животных с ЭИЭД, не получавших препараты, снижение САД. При проведении пробы с НП на ЭНВД, сократительные реакции сосудистой стенки крыс с ЭИЭД, получавших статины и L-норвалин, были такими же, как в группах интактных животных и при моделировании ЭИЭД без введения препаратов. Описанные изменения сосудистых реакций у крыс, получавших розувастатин, симвастатин и L-норвалин (отсутствие выраженного повышения САД и ДАД при введении АХ), как следствие, привели к увеличению, но не до соответствующих значений в группе интактных животных, площади треугольника над кривой восстановления АД в пробе на ЭЗВД. В свою очередь, эти изменения, по сравнению с моделью, ЭИЭД стали причиной статистически существенного снижения КЭД: при введении розувастатина – до 1,6±0,1, симваститина – до 2,0±0,2 и L-норвалина – до 1,7±0,4 (таблица 5; рисунок 5).
Таким образом, при анализе динамики сосудистых реакций во время при проведения монотерапии статинами или L-норвалином у животных с ЭИЭД обнаружено, что большей корригирующей эффективностью обладали розувастатин и L-норвалин. Симвастатин обладал менее выраженными корригирующими эффектами на показатели центральной гемодинамики в условиях ЭИЭД, вызванного введением стафилококкового эндотоксина. У крыс с эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункцией, вызванной введением стафилококкового эндотоксина, из пяти исследованных показателей сократительной функции миокарда наблюдалось статистически существенное повышение скоростных параметров – +dp/dtmax и -dp/dtmax. Введение розувастатина или L-норвалина нормализовало оба нарушенных показателя, а симвастатин – нормализовал +dp/dtmax, но не оказывал влияния на -dp/dtmax (таблица 6).
При проведении пробы на адренореактивность у животных с эндотоксин индуцированной моделью ЭД, получавших розувастатин, наблюдалась нормализация ЛЖД, +dp/dtmax и ИФС, но снижение -dp/dtmax. В группе животных, получавших симвастатин, нормализовались ЛЖД и ИФС, однако по сравнению с крысами, не получавшими препаратов, изменений +dp/dtmax и -dp/dtmax не происходило. Максимальные корригирующие эффекты наблюдались в группе, получавшей L-норвалин, поскольку все изученные параметры сократительной функции миокарда не отличались от группы здоровых животных (таблица 7).
При проведении пробы с нагрузкой сопротивлением на 5-й секунде у крыс с эндотоксин-индуцированной ЭД, получавших розувастатин, наблюдалось снижение +dp/dtmax, а показатели -dp/dtmax, ЧСС и ИФС – оставались повышенными. У животных, получавших симвастатин, +dp/dtmax оставался на нормальном уровне, но значительно повышались -dp/dtmax, ЧСС и ИФС. После введения экспериментальным животным с эндотоксин-индуцированной моделью ЭД L-норвалина отмечалась нормализация -dp/dtmax, снижение +dp/dtmax, но ЧСС и ИФС были повышенными (таблица 8).
Использование статинов и L-норвалина в коррекции нарушений функции сосудистого эндотелия, сократительной функции миокарда и метаболических показателей у животных с экспериментальной моделью эндотоксин-индуцированной эндотелиальной дисфункции
Формирующийся в ходе активации ферментативных систем эндотелиоцитов в условиях инфекционного процесса NO связывается с радикалами кислорода, образуя пероксинитриты, усугубляющие течение септического шока и ишемии органов, так как это соединение подавляет работу цикла Кребса и активность рибонуклеотидредуктазы, ингибирует образование энергии в митохондриях. В свою очередь, бактериальный эндотоксин активизирует синтез важнейшего проапоптотического фактора – белка р53, образно названого «стражем генома». С другой стороны, индукция eNOS под воздействием липополисахаридов вызывает в эндотелиальных клетках типичные для апоптоза морфологические и биохимические изменения, при этом доказана зависимость активности апоптоза от концентраций супероксид-радикала кислорода и оксида азота. Наиболее выраженным антиапоптотическим действием обладает сбалансированная пропорция этих веществ в клетке, являющаяся важным фактором регуляции апоптоза [99, 110, 115, 193].
Ограничение патологического действия NO и его инактивация осуществляются с помощью супероксид-радикала О2. Однако нужно учитывать и то, что увеличение продукции супероксид-радикала О2 в кровеносной системе активными макрофагами или эндотелиальными клетками может провоцировать спазм эндотелиоцитов, что, в свою очередь, приводит к нарушению проницаемости монослоя эндотелия, являясь основой развития последующей эндотелиальной дисфункции. Аналогичным действием обладают окисленные и гликозилированные формы липопротеидов низкой плотности, они ингибируют еNOS в макрофагах и эндотелиоцитах. Окисление липопротеидов низкой плотности при септическом процессе является также защитной реакцией для связывания избыточного количества вырабатываемого NO, но в последующем эти модифицированные формы становятся одними из главных в патогенезе атеросклероза и его осложнений. Дополнительное высвобождение дериватов арахидоновой кислоты, цитотоксичных радикалов кислорода и лизосомальных ферментов усиливают токсическое повреждение эндотелия, прогрессирование дисфункции эндотелия и повышение проницаемости сосудов, запускается так называемый «порочный круг». В рамках этой гипотезы весьма интересен факт, что эндотелиальная NO-синтаза может катализировать образование супероксид-иона [88, 89, 99, 132].
Таким образом, основа стратегии фармакологической реабилитации эндотелиальной дисфункции при инфекционных процессах, должна быть направлена на предотвращение инверсии каталитической активности eNOS на пероксинитрит-ион и повышение ее влияния на метаболизм оксида азота.
В этой связи экспериментальной проверки требует использование статинов, которые помимо эндотелиопротективных свойств, обладают выраженным противовоспалительным действием и могут быть использованы в клинической практике по показаниям, связанным с нарушением холестеринового обмена, ингибитора аргиназы L-норвалина, который разрешен в качестве биологически активных добавок, проходит III фазу клинических испытаний при бронхиальной астме и должен эффективно повышать уровень L-аргинина и предотвращать эндогенное ингибирование индуцибельной NO-синтазы.
Для реализации задач в работе исследовали фармакологическую эффективность статинов (розувастатина и симвастатина) и L-норвалина в коррекции сосудистого и кардиального компонентов эндотелиальной дисфункции, индуцированной ведением стафилококкового эндотоксина.
При анализе динамики гемодинамических показателей и сократительной функции миокарда животных с ЭИЭД во время проведения функциональных проб установлен, что отдельное применение розувастатина или L-норвалина у крыс обладает большей корригирующей эффективностью по сравнению с симвастатином. Симвастатин обладает менее выраженными корригирующими эффектами на показатели центральной гемодинамики и кардиальный компонент эндотелиальной дисфункции в условиях экспериментальной модели ЭИЭД, вызванной введением стафилококкового эндотоксина. Совместное применение статинов и L-норвалина оказывало более выраженные корригирующие эффекты на исследованные показатели центральной гемодинамики и сократительной функции миокарда. При этом по совокупности скорригированных показателей более эффективным было сочетание L-норвалина и розувастатина, по сравнению с комбинацией, включавшей симвастатин и L-норвалин.
Розувастатин является селективным конкурентным ингибитором ГМГ КоА-редуктазы – фермента, превращающего 3-гидрокси-3 метилглутарилкоэнзим А в мевалонат, предшественник холестерина.
Введение препарата увеличивает число печеночных рецепторов ЛПНП на поверхности клеток, повышает захват и катаболизм ЛПНП, что, в свою очередь, приводит к ингибированию синтеза ЛПОНП, уменьшая тем самым общее количество ЛПНП и ЛПОНП. Розувастатин снижает повышенные концентрации ХС-ЛПНП, общего ХС, триглицеридов (ТГ), повышает концентрацию ХС-ЛПВП, а также снижает концентрации аполипопротеина В, ХС-ЛПВП, ХС-ЛПОНП, ТГ-ЛПОНП и увеличивает концентрацию аполипопротеина А-I, снижает соотношение ХС-ЛПНП/ХС-ЛПВП, общий ХС/ХС-ЛПВП и ХС-неЛПВП/ ХС-ЛПВП и соотношение AпoB/AпoA-I. Симвастатин – синтетический гиполипидемический препарат, получаемый путем ферментации Aspergillus terreus, является неактивным лактоном, в организме подвергается гидролизу с образованием гидроксикислотного производного. Активный метаболит, так же как и в случае с розувастатином, ингибирует 3-гидрокси-3-метил-глутарил-КоА-редуктазу. Применение симвастатина не вызывает накопления в организме потенциально токсичных стеролов. ГМГ-КоА легко метаболизируется до ацетил-КоА, который участвует во многих процессах синтеза в организме.