Введение к работе
Актуальность проблемы. Миелосупрессивные состояния, развивающиеся в большинстве случаев как осложнения цитостатических методов лечения [Гершанович М.Л. и др., 1999; Владимирская Е.Б., 2001; Bhatt V., Saleem A., 2004; Marangolo M. e.a., 2006], требуют применения гемостимулирующих средств для поддержания качества жизни пациентов и обеспечения переносимости терапии основного заболевания [Molineux G., 2004; Переводчикова Н.И., 2005; Greil R. e.a., 2008]. Достижения экспериментальной и клинической гематологии последних десятилетий легли в основу разработки высокоэффективных гемостимуляторов - аналогов эндогенных гемопоэтинов (колониестимулирующие факторы, эритропоэтин, интерлейкины), что позволило значительно продвинуться в терапии лейкопений и анемий различного генеза [Metcalf D., 1989; Ganser A. e.a., 1991; Hill A.D. e.a., 1995; Волкова М.А., 1998; Lee D.L. e.a., 2008; Дыгай А.М. и др., 2009].
Широкое распространение для коррекции нарушений гранулоцитопоэза получили препараты гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) [Asano S., 1991; Demetri G.D., Griffin J.D., 1991; Zeidler C., Wright D.E. e.a., 2001; Levesque J.-P. e.a., 2003; Welte K., 2007]. На сегодняшний день существуют неконъюгированные (гликозилированный и негликозилированный Г-КСФ) [Hoglund M., 1998; Bonig H. e.a., 2001] и пегилированная химическим путем формы данного средства [Molineux G., 2004; Frampton J.E., Keating G.M., 2005; Rajan R.S. e.a., 2006]. Практическое применение неконъюгированного Г-КСФ в значительной степени лимитировано токсичностью и достаточно высокой частотой развития нежелательных побочных эффектов. В отличие от этого пегилированный Г-КСФ представляет собой практически нетоксичное соединение и имеет высокую физическую стабильность, растворимость и период полувыведения из организма [Delgado C. e.a., 1992; Curran M.P., Goa K.L., 2002; Zamboni W.C., 2004; Hamidi M. e.a., 2006; Piedmonte D.M., Treuheit M.J., 2008]. Однако технология его получения (химический синтез) является многостадийной, сложной с использованием высокотоксичных соединений, требующих в последующем очистки готового продукта [Hamidi M. e.a., 2006].
Вместе с тем существует технология/нанотехнология электронно-лучевого (радиационного) синтеза [Vereschagin E.I. e.a., 2001], позволяющая получать низкоиммуногенные и малотоксичные фармакологические средства белковой природы [Дыгай А.М.и др., 2009]. Создаваемые с помощью ионизирующей радиации иммобилизированные вещества, помимо указанных выше преимуществ, оказываются в значительной степени защищенными от воздействия протеолитических ферментов, что делает возможным их использование per os [Дыгай А.М. и др., 2009].
В связи с вышеизложенным, а также с учетом сведений о высокой эффективности и перспективности использования Г-КСФ в качестве средства для регенеративной медицины, определяемых его способностью вызывать миграцию костномозговых мультипотентных стволовых клеток (СК) в пораженные органы [Гольдберг Е.Д. и др., 2005, 2007; Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., 2009; Lei Y. e.a., 2009], представляется весьма актуальным изучение фармакологических свойств препарата, созданного на основе данного цитокина с помощью электронно-лучевого синтеза.
Цель исследования. Изучить гемостимулирующую и мобилизующую стволовые клетки активности иммобилизированного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и вскрыть механизмы его действия.
Задачи исследования:
-
Изучить влияние иммобилизированного (им) Г-КСФ на процессы восстановления костномозгового гемопоэза при цитостатической миелосупрессии.
-
Оценить состояние различных пулов кроветворных клеток-предшественников при введении имГ-КСФ.
-
Вскрыть механизмы гранулоцитопоэзстимулирующей активности имГ-КСФ и выявить особенности его специфического действия.
-
Исследовать мобилизующие свойства препарата в отношении кроветворных и мезенхимальных прогениторных клеток.
-
Определить возможность и эффективность перорального использования имГ-КСФ.
Научная новизна работы. Впервые изучены гемостимулирующая и мобилизующая стволовые клетки активности иммобилизированного на полиэтиленгликоле Г-КСФ с помощью электронно-лучевого синтеза. Показано, что в основе стимуляции подавленного циклофосфаном гранулоцитарного ростка кроветворения под влиянием имГ-КСФ при его подкожном введении лежит повышение содержания полипотентных (КОЕ-Н, КОЕ-ГЭММ) и коммитированных (КОЕ-ГМ, КОЕ-Г) гемопоэтических клеток-предшественников. Действие препарата определяется не только прямым влиянием на кроветворные прекурсоры, но и стимуляцией функциональной активности гемопоэзиндуцирующего микроокружения: увеличение количества мезенхимальных клеток-предшественников и продукции ими гемопоэтинов, повышение фидерной способности Тhy1,2+- клеток в отношении родоначальных элементов крови. Выявлены мобилизующие прогениторные клетки свойства имГ-КСФ. Обнаружены особенности механизмов действия иммобилизированной формы Г-КСФ (по сравнению с не модифицированным ростовым фактором), заключающиеся в более выраженной активации коммитированных предшественников на фоне менее значимой стимуляции полипотентных кроветворных предшественников. Впервые установлена принципиальная возможность эффективного перорального использования препарата, созданного на основе Г-КСФ.
Практическая значимость работы. Продемонстрирована высокая эффективность парентерального и перорального использования нового отечественного гемостимулятора, представляющего собой иммобилизированный с помощью оригинальной технологии электронно-лучевого синтеза Г-КСФ (разработанный ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г. Новосибирск совместно с НИИ фармакологии СО РАМН, г. Томск).
По материалам работы подготовлен отчет в Федеральную службу по надзору в сфере здравоохранения и социального развития о специфической активности имГ-КСФ для получения разрешения на его клинические исследования в качестве гемостимулирующего средства. Кроме того, полученные результаты о мобилизующих свойствах имГ-КСФ в отношении стволовых клеток могут явиться основой для разработки неинвазивной стратегии клеточной терапии дегенеративных заболеваний, основанной на принципе фармакологической модуляции функций эндогенных прогениторных элементов.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Екатеринбург, 2009), IV региональной конференции молодых ученых-онкологов им. академика Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2009), II международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 8 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Получен 1 патент (RU) на изобретение и подано 2 заявки (RU) на изобретения: «Способ определения эффективности гемостимуляторов при цитостатической миелосупрессии» (заявка № 2009125095, приоритет от 30.06.2009 г.), «Способ стимуляции стволовых кроветворных клеток при цитостатической миелосупрессии» (заявка № 2009144320, приоритет от 20.10.2009 г.).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 8 рисунками и 23 таблицами. Библиографический указатель включает 329 источников литературы, в том числе 243 иностранных.