Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Грелин, его физиологические функции и участие в подкреплении (обзор литературы) 15
1.1. История открытия грелина 15
1.2. Генетический контроль, молекулярный предшественник грелина, молекулярные формы грелина 16
1.3. Рецепторы грелина 21
1.4. Топография грелиновых рецепторов и грелин-продуцирующих клеток 22
1.5. Основные функции грелина
1.5.1. Гипоталамические функции грелинов: энергетический баланс, регуляция метаболизма глюкозы, стимуляция пищевого поведения, эндокринная регуляция 23
1.5.2. Экстрагипоталамические функции грелина
1.5.2.1. Модуляция механизмов подкрепления и аддикции 31
1.5.2.2. Участие грелиновой системы в процессах запоминания и обучения 1.6. Действие различных молекулярных форм грелина 37
1.7. Онтогенез грелиновой системы 39
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Выбор животных 42
2.2. Процедура хронической алкоголизации 42
2.3. Выращивание животных в условиях социальной изоляции 43
2.4. Метод моделирования психической травмы 43
2.5. Методы исследования поведения
2.5.1. Условная реакция предпочтения места 45
2.5.2. Исследование поведения крыс в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» 47
2.5.3. Исследование поведения крыс в тесте «открытое поле» 48
2.5.4. Исследование агрессии в тесте «чужак-резидент»
2.6. Методы иммунохимического анализа (ИФА) 51
2.7. Фармакологические вещества, используемые в работе 52
2.8. Статистические методы анализа 53
Глава 3. Результаты собственных исследований 54
3.1. Исследование действия грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 на условную реакцию предпочтения места этанола, эмоционально-исследовательскую активность и его содержание в структурах головного мозга у крыс при хронической алкоголизации 54
3.1.1. Исследование действия грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 на условную реакцию предпочтения места этанола 54
3.1.2. Исследование участия грелина и антагониста грелина [D-Lys3]-GHRP-6 в контроле эмоционального и исследовательского поведения у крыс 57
3.1.3. Исследование содержания дезацилированной формы грелина в структурах головного мозга крыс при экспериментальной хронической алкоголизации 66
3.2. Исследование действия грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 на условную реакцию предпочтения места этанола и эмоционально-исследовательскую активность у крыс, выращенных в условиях социальной изоляции 73
3.2.1. Исследование действия грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 на условную реакцию предпочтения места этанола у животных, выращенных в условиях социальной изоляции 73
3.2.2. Исследование участия грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 в контроле эмоционально-исследовательского поведения и двигательной активности у крыс, выращенных в условиях социальной изоляции 76
3.3. Исследование участия грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 в контроле эмоционально-исследовательского поведения и двигательной активности у крыс с постстрессовым расстройством 89
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 99
Выводы 110
Практические рекомендации 112
Литература
- Гипоталамические функции грелинов: энергетический баланс, регуляция метаболизма глюкозы, стимуляция пищевого поведения, эндокринная регуляция
- Исследование поведения крыс в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт»
- Исследование участия грелина и антагониста грелина [D-Lys3]-GHRP-6 в контроле эмоционального и исследовательского поведения у крыс
- Исследование участия грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 в контроле эмоционально-исследовательского поведения и двигательной активности у крыс с постстрессовым расстройством
Введение к работе
Актуальность исследования. Интерес к исследованиям механизмов зависимости от психоактивных веществ и подкрепления как базовых механизмов, лежащих в основе эмоциональной деятельности человека и животных, в последние годы неуклонно растет. Важную роль в указанных механизмах играет аномальное функционирование эмоциогенных структур мозга, прежде всего, расширенной миндалины и мезолимбической системы мозга, включая гипоталамус и миндалевидное тело (Шабанов П.Д. и др., 2014). Среди химических трансмиттеров и модуляторов, опосредующих эмоциональные эффекты психоактивных веществ, привлекает внимание пептидный гормон грелин, открытый в конце ХХ века (Kojima M. et al., 1999). Гормон вырабатывается в слизистой желудка, состоит из 28 аминокислот и включает три изоформы: ацилированный грелин, неацилированный (дезацил-грелин) и обестатин (Chen Ch.-Y. et al., 2009). Рецептор к этим лигандам был впервые описан A.D. Howard и соавторами (1996). Грелиновый рецептор имеет две молекулярные формы: GHSR1A и GHSR1B, при этом биологическую активность связывают только с первой формой – GHSR1A. Рецепторы GHSR1A располагаются в основном в островках поджелудочной железы, надпочечниках, щитовидной железе, миокарде, а также структурах головного мозга, таких как передняя доля гипофиза, ар куатное ядро гипоталамуса, гиппокамп, черная субстанция, вентральная область покрышки (Guan X.M. et al., 1997; Gnanapavan S. et al., 2002).
Показано, что грелин способствует увеличению объема принимаемого жира и пищи посредством воздействия на гипоталамус, поэтому изначально функция грелина оценивалась только как гормона голода (Tschop et al., 2000). В то же время гормон может действовать и на специализированные клетки гипоталамуса, вызывающие аппетит, т. е. обусловливать эмоционально-мотивационные характеристики удовлетворения пищевой потребности (Kroemer et al., 2012; Holsen et al., 2014). В последние годы также показано участие грелина и в механизмах подкрепления при формировании алкогольной и наркотической зависимости (Jerlhag et al., 2009). На фоне введения грелина принятие этанола у алкоголизированных крыс вызывало повышение экстраклеточного дофамина в вентральной области покрышки (Jerlhag et al., 2009; Kaur, Ryabinin, 2010).
Исследования последних лет показали значимую роль грелина в физиологической реакции мозга на стресс, поскольку одна из возможных мишеней грелина в стрессорной реакции – это кортиколиберин-продуцирующие нейроны паравентрикулярного ядра гипоталамуса. В частности, был описан механизм, по которому грелин активирует кортиколибериновые нейроны у мышей (Patterson Z.R. et al., 2010).
В связи с этим изучение физиологической роли грелина и его рецепторов в реализации механизмов подкрепления и зависимости от психоактивных веществ, а также влияние лигандов грелина на
эмоционально-исследовательскую и двигательную активность при
алкоголизации и стрессорных воздействиях является актуальной проблемой, как для физиологии, так и нейрофармакологии, рассматривающей систему грелина в качестве мишени для воздействия лекарственных средств.
Степень разработанности темы. В исследованиях последних лет
показано, что системное, в нутрижелудочковое и внутриструктурное (в
вентральную область покрышки – ВОП) введение грелина вызывают
повышение экстраклеточного дофамина (ДА) в прилежащем ядре, а также
повышает локомоторную активность животных (Abizaid A. et al., 2006;
Jerlhag E. et al., 2011). С другой стороны, в ведение антагониста рецептора
грелина в ВОП блокируют способность грелина увеличивать высвобождение
дофамина в прилежащем ядре (Jerlhag E. et al., 2011). Кроме того,
продемонстрировано, что повышенный уровень грелина связан с активацией
поискового поведения при лекарственной зависимости, в частности, поиска
психостимулятора кокаина у крыс (Davis K.W. et al., 2007; Tessari M. et al.,
2007). Ограничение потребления пищи, вызывающее повышение уро вня
грелина (Gualillo O. et al., 2002), также увеличивает и вызванную
амфетамином и кокаином локомоторную активность, усиливает поведение
поиска к окаина и повышает самовведение кокаина и амфетамина у крыс
(Carroll M.E. et al., 1979). Внутрижелудочковое и внутриструктурное (в ВОП)
введение грелина повышают потребление алкоголя у мышей (Jerlhag E. et al.,
2011). При этом работ, свидетельствующих о регуляции грелином или
компонентами его системы (дезацил-грелином, обестатином) эмоционально-
исследовательской и двигательной активности при хронической
алкоголизации, не проводилось.
К экстрагипоталамическим мишеням, на которые непосредственно действует грелин, относится и система структур расширенной миндалины, стресс-зависимая система головного мозга, опосредующая механизмы подкрепления и зависимости (Zigman J.M. et al., 2006). Исследования показали, что периферическое и центральное введение грелина активирует кортиколибериновые нейроны и, как следствие, гипоталамо-гипофизно-надпочечниковую систему (Cabral A. еt al., 2012). Активация этой системы важна, если грелин играет защитную роль против развития депрессивных симптомов при хроническом стрессе (Tung Y.L. et al., 2004). В то же время, работ по действию грелина на системы подкрепления и эмоционального поведения при стрессорных воздействиях в доступной литературе сравнительно мало, не ясны также механизмы и последствия этого влияния.
Целью исследования было изучение участия грелина и антагониста его рецепторов [D-Lys3]-GHRP-6 в механизмах безусловного и условного подкрепления, стресс-индуцированного поведения и алкогольной зависимости у крыс.
В задачи исследования входило:
1. Изучить действие грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 на эмоционально-исследовательское поведение и условную
реакцию предпочтения места этанола при хронической алкоголизации у крыс.
-
Изучить динамику уровней дезацилированной формы грелина в структурах головного мозга крыс при хронической алкоголизации и последующей отмене этанола.
-
Изучить действие грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 на эмоционально-исследовательское поведение, двигательную активность и условную реакцию предпочтения места этанола у крыс, выращенных в условиях стресса социальной изоляции.
-
Изучить участие грелина в организации эмоционально-исследовательского поведения и двигательной активности у крыс, перенесших острое витальное стрессорное воздействие в период формирования посттравматического стрессорного расстройства (ПТСР).
Научная новизна. В результате проведенных исследований получены
новые данные о значении грелиновых механизмов подкрепления в
формировании зависимости от этанола. Доказано, что б локада рецепторов
грелина в головном мозге устраняет или существенно уменьшает
подкрепляющее действие алкоголя. Интраназальное введение грелина у
хронически алколизированных крыс, напротив, вызывает проявление
агрессии, снижение коммуникативного поведения и исследовательской
активности. При этом антагонист рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6,
рассматриваемый как видоизмененный фрагмент с убстанции Р, обладает
мягким анксиолитическим и нормализующим поведение действием у таких
животных. С другой стороны, у крыс, не получавших этанол, антагонист
рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 обладает анксиогенным действием и
вызывает повышение коммуникативной активности. Динамика содержания
дезацил-грелина отличается в различных структурах головн ого мозга и
меняется в ходе алкоголизации и последующей отмены алкоголя. В
миндалине наблюдается снижение его концентрации с последующим
повышением в разные сроки отмены (2-7 суток) этанола. В гиппокампе
концентрация дезацил-грелина снижается как при формировании
зависимости от этанола, так и при ее отмене. В гипоталамусе отмечается
резкое увеличение концентрации дезацил-грелина, особенно в период
отмены этанола. При стрессе социальной изоляции у крыс а нтагонист
рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 проявляет типичные анксиолитические
свойства, снижает исследовательскую активность, коммуникативное
поведение и проявления агрессии. Эти свойства не воспроизводятся в период
формирования ПТСР у крыс, перенесших острую витальную психогенную
травму (экспозицию с питоном). Напротив, в этих условиях
анксиолитические свойства проявляет сам грелин, вводимый интраназально в виде курса (7 дней). Таким образом, полученные данные создают предпосылки для создания противоалкогольных и анксиолитических средств среди агонистов и антагонистов рецепторов грелина, меняющих активность подкрепляющих и стресс-лимитирующих систем мозга.
Теоретическая и практическая значимость. Показано, что интраназальное введение антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 блокирует экспрессию условной реакции предпочтения места (УРПМ) и возобновление реакции после ее угашения у алкоголизированных крыс. Внутрибрюшинное введение этанола в дозах 0,5-0,75-1,5 г/ кг при хронической алкоголизации оказывает как подкрепляющее, так и аверсивное действие. Интраназальное вв едение антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 крысам, выращенным в условиях социальной изоляции с 20-го дня жизни, блокирует экспрессию УРПМ этанола и возобновление реакции после ее угашения. В противоположность этому, и нтраназальное введение грелина крысам, выращенным в условиях социальной изоляции, вызывает анксиогенный эффект, повышение исследовательской активности и агрессии, снижение коммуникативного поведения. Антагонист рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 в этих условиях обладает мягкой анксиолитической активностью, снижает исследовательскую активность, коммуникативное поведение и проявления агрессии. В то же время, грелин при курсовом интраназальном применении в течение 7 дней у крыс, подвергнутых острому психогенному витальному стрессу (экспозиция с питоном), проявляет анксиолитическое действие без существенного влияния на проявления агрессии. А нтагонист рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 в данных условиях, на против, вызывает анксиогенный эффект, при этом у животных увеличивается локомоторная активность. Данные о включении грелиновой системы в организацию эмоционального и следовательского поведения открывает перспективы для рассмотрения гр елина и компонентов его системы в качестве новых мишеней для создания эффективных корректоров эмоционально-мотивационного поведения, прежде всего , из числа антагонистов рецепторов грелина.
Методология и методы исследования. Методология исследования состояла в изучении у крыс подкрепляющих свойств психоактивных веществ, оцененных с помощью у словной реакции предпочтения места и других методов изучения эмоционально-исследовательского и двигательного поведения («приподнятый крестообразный лабиринт», «открытое п оле», «чужак-резидент»), моделирования хронической алкоголизации, социальной изоляции и постсттравматического стрессового расстройства, оценки концентраций дезацил-грелина в структурах головного мозга крыс при хронической алкоголизации и последующей отмене этанола методом иммуноферментного анализа. Исследования выполнены с соблюдением всех правил доказательной медицины.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Интраназальное введение антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 блокирует экспрессию и возобновление условной реакции предпочтения места после ее угашения у алкоголизированных крыс. При этом антагонист рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 обладает мягким
анксиолитическим и сбалансированным д ействием на эмоциональное поведение.
2. Динамика содержания дезацил-грелина отличается в различных
структурах головного мозга и изменяется в ходе алкоголизации и
последующей отмене алкоголя. Наиболее чувствительными структурами
головного мозга являются миндалина и гиппокамп, где наблюдается
снижение концентрации дезацил-грелина при алкоголизации с возрастанием
уровней пептида после отмены этанола. В гипоталамусе, напротив,
концентрация дезацил-грелина при алкоголизации не меняется, но возрастает
после острой отмены этанола.
-
Интраназальное введение антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 блокирует экспрессию и возобновление УРПМ после ее угашения у крыс, выращенных в условиях стресса социальной изоляции. При этом антагонист рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6, как и в случае с алкоголизацией, проявляет свойства анксиолитика и снижает проявления агрессии. Данные о включении грелиновой системы в организацию эмоционального и следовательского поведения открывает перспективы для рассмотрения грелина и его аналогов как корректоров эмоционально-мотивационного поведения.
-
Грелин при курсовом (в течение 7 дней) интраназальном введении после острого витального стрессогенного воздействия (экспозиция с питоном) проявляет анксиолитическое действие, но повышает проявления агрессии. А нтагонист рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 после его введения в течение 7 д ней, наоборот, вызывает анксиогенный эффект, при этом увеличивается локомоторная активность.
Степень достоверности определяется большим количеством экспериментальных животных (340 крыс Вистар), рандомизацией и формированием групп сравнения и активного контроля, адекватными поведенческими, фармакологическими и биохимическими методами исследования, длительными сроками наблюдения и корректными методами статистической обработки.
Реализация результатов Материалы и сследования используются в
лекционном курсе кафедры фармакологии Военно-медицинской академии
имени С.М. Кирова МО РФ, кафедры фармакологии Северо-Западного
государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова МЗ РФ,
кафедры фармакологии Санкт-Петербургского государственного
педиатрического медицинского университета МЗ РФ, кафедры неврологии и
психиатрии и кафедры специализированной терапии Института
медицинского образования Новгородского государственного университета имени Ярослава Мудрого МОН РФ. Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины». Материал диссертации вошел в грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований РАН (РФФИ №13-04-00186).
Апробация результатов Материалы, вошедшие в диссертацию, доложены на 8-й международной конференции «Steroids and nervous system» (Турин, Италия, 2015), на Всероссийской конференции, посвященной 150-летию Н.П. Кравкова (Рязань, 2015), на 23-й международной конференции «Stress and Behavior» (Санкт-Петербург, 2016), научных заседаниях отдела нейрофармакологии им . С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (2014-2016). Работа рассмотрена и одобрена комитетом по этике ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины».
Апробация диссертации прошла на заседании отдела нейрофармакологии им . С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины».
Публикации. По теме диссертации опубликованы 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК, и 19 тезисов и статей в сборниках научных работ. Личный вклад автора осуществлялся на всех этапах работы и состоял в планировании экспериментов, их непосредственном выполнении, обработке полученных результатов, обсуждении результатов, написании статей и тезисов, написании диссертации и автореферата. Участие автора в выполнении, сборе и анализе – 93-96%, статистической обработке – 100%, в написании статей и тезисов – 90-92%, написании диссертации – 100%, написание автореферата – 100%.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, включающей 3 подраздела, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 рисунками и 22 таблицами. Библиографический указатель содержит 211 наименований, в том числе 38 отечественных и 173 иностранных.
Гипоталамические функции грелинов: энергетический баланс, регуляция метаболизма глюкозы, стимуляция пищевого поведения, эндокринная регуляция
В состав грелиновой системы включают три пептида, биосинтез которых контролируется одним геном. Ген грелина у мыши и человека имеют в своем составе по пять экзонов (Chen Ch.-Y. et al., 2009). Продуктами экспрессии гена грелиновой системы являются три формы пептидов: ацилированный грелин, неацилированный (дезацил-грелин) и обестатин. Кроме того, к грелиновой системе относят грелиновые рецепторы. Грелин – это гормон, который содержит 28 аминокислотных остатков, полученный последовательной протеолитической деградацией белкового предшественника препрогрелина и прогрелина. Грелин преимущественно синтезируется в желудке и секретируется в общий кровоток. В плазме грелин существует в двух формах: ацетилированный грелин и дезацетилированный грелин. Считается, что пострансляционное ацилирование грелина необходимо для его основной функциональной активности. Ацилированный грелин имеет уникальную для олигопептидов посттрансляционную модификацию, заключающуюся в присоединении остатка октановой кислоты к аминокислотному остатку серина, что происходит путем формирования сложноэфирной связи. Наличие ацильного (алкильного) остатка в молекуле является необходимым для связывания грелина с соответствующим специфическим рецептором в ЦНС – грелиновым рецептором типа 1А (Sato S. et al., 2012). Грелин кодируется препрогрелиновым геном, который кроме грелина также кодирует и сигнальные белки, и 23-аминокислотный пептид обестатин. Изначально предполагали, что обестатин является эндогенным лигандом рецепторов грелина, а функции обестатина могут вступать в противодействие с грелином (Zhang J.V. et al., 2005), то есть, ингбириовать прием пищи и моторику желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Однако несколько независимых групп исследователей не смогли подтвердить эти факты (Depoortere I., 2012). Для активации его единственного рецептора требуется прикрепление жирной кислоты боковой цепочкой к своему сериновому остатку в положении 3, уникальной посттранскрипционной модификации, которое достигается с помощью грелин-О ациламинотрансферазой (ГОАТ) (Depoortere, I., 2012; Gutierrez J.A. et al., 2008). Открытие данного фермента, ответственного за процесс ацилирования грелина (Gutierrez J.A. et al., 2008), было важным прорывом в понимании роли, которую ацилированный грелин играет в физиологии. Эта форма грелина, в основном октановая и меньше декановая, необходима для воздействия грелина на системный метаболизм. Данные, демонстрирующие решающую роль ГОАТ в активации грелина, ясны. Во-первых, этот фермент и дезацил-грелин достаточны для продукции ацилированного грелина (Gutierrez J.A. et al., 2008). Во-вторых, грелин и ГОАТ имеют похожие тканевые профили у людей и грызунов с высоким содержанием ГОАТ в поджелудочной железе, желудке у людей и желудке и кишечнике у грызунов (Gutierrez J.A. et al., 2008; Lim C.T. et al., 2011). В-третьих, ГОАТ, так же как и грелин, очень специфичен для позвоночных. Человек и грызуны проявляют функциональную активность ГОАТ. Наконец, наиболее убедительные данные в пользу того, что ГОАТ является ферментом для ацилирования грелина, то, что мыши, у которых отсутствует ГОАТ, продемонстрировали отсутствие октановой и декановой форм грелина (Zhao T.J. et al., 2010; Gutierrez J.A. et al., 2008). Интересно, что липиды, используемые для активации грелина, напрямую поступают из молочных жиров из пищи (Nishi Y. et al., 2005). Возможно, это связано с тем, что грелин-продуцирующие клетки расположены в железах дна желудка. Большое число этих клеток контактируют между собой в эпителии полости желудка, что дает прямой доступ к молочным липидам (Armand M. et al., 1996). Более того, предпочтительные субстраты жирных кислот для ГОАТ образуются из триглицеридов средней длины, которые могут напрямую поступать в кровоток, не расщепляясь липазой и желчными кислотами (Armand M. et al., 1996). Несмотря на эти доказательства, эффект синтезированных жирных кислот по сравнению с напрямую полученными из пищи жирными кислотами остается неизвестным. Исследования продемонстрировали, что глицин-1, серин-3, и фенилаланин-4 являются важными компонентами распознавания последовательности для ГОАТ, тогда как серин-2, лейцин-5, серин-6 и пролактин-7 представляются менее важными для этого. С точки зрения биохимии, ГОАТ представляет собой фермент для двух важных субстратов: дезацил-грелина и коротких или средних цепей жирных кислот, этерифицированных коэнзимом А. Клетки, содержащие грелин и ГОАТ, синтезируют серин-3-ацил-грелин вместе с ацильной частью прекурсоров, полученных из жирных кислот от ацетатов до тетрадекановой кислоты (Gutierrez J.A. et al., 2008). Длина жирных кислот, используемых для ацилирования грелина, представляется важным фактором для метаболизма грелина, так как изменение длины жирной кислоты приводит к изменению активации рецептора грелина 1А in vitro и изменяет влияние грелина на пищевое поведение и ожирение in vivo. Таким образом, модификация ацильной боковой цепи может представлять интерес в виде терапевтического рычага для будущих вмешательств. Октановые и декановые формы грелина являются оптимальными лигандами для активации рецепторов 1А. Исследования, проводимые in vitro, воспроизводящие ацилирование грелина, с дезацил-грелиновыми пептидами, жирными кислотами и ГОАТ, определяют субстратную специфичность для ГОАТ. Структурные ограничения представляются специфичными только для грелина и предполагают, что грелин является основным субстратом для фермента ГОАТ. Последние исследования подчеркивают важность метаболизма специфических жирных кислот в клетках, продуцирующих ацилированный грелин (Kirchner H. et al., 2009). Последние исследования с генетически модифицированными мышами, у которых либо отсутствовал ГОАТ, либо уровни ГОАТ и грелина были повышены, выявили, что ГОАТ-грелиновая система действует как пищевой сенсор, информирующий организм о присутствии пищи, а не об ее отсутствии, как предполагалось ранее (Kirchner H. et al., 2009). Несколько наблюдений поддерживают это утверждение. Во-первых, продолжительное голодание мышей приводило к уверенно выявляемому повышению уровня общего грелина, что было вызвано увеличением дезацил-грелина, а не ацилированной его формы. Это увеличение дезацил-грелина происходит на фоне снижения уровня ГОАТ в ответ на длительное голодание (Kirchner H. et al., 2009).
Исследование поведения крыс в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт»
В экспериментах с хронической алкоголизацией крыс Вистар массой 180-200 г в возрасте 3-4 месяца (взрослых) подвергали полунасильственной алкоголизации 15%-ным раствором этанола, который потреблялся крысами в качестве единственного источника жидкости в течение 6 месяцев, доступ к брикетированному сухому корму был свободным. Контрольная группа крыс того же привоза в качестве источника жидкости получала воду.
Из питомника «Рапполово» были получены беременные самки на сроке беременности 15-18 дней, которые содержались в индивидуальных клетках при свободном доступе к воде и сухому брикетированному корму с добавлением свежей моркови и сухого молока. На 20-й день после рождения, когда крысята становились способными к самообеспечению, среди них отбирали самцов и рассаживали в индивидуальные клетки, в которых животные содержались в течение всего эксперимента. В изоляции крысы находились до 90-100 дней. Именно такой период постнатального развития, по мнению ряда исследователей (Пошивалов В.П., 1977; Пошивалов В.П., 1978; Пошивалов В.П., 1986), считается наиболее значимым для влияния различных воздействий внешней среды на формирование адаптивного поведения у крыс. Индивидуальные клетки размерами 40х30х25 см были сконструированы таким образом, чтобы свести до минимума контакт животного с экспериментатором или служителем вивария при уборке клетки. Животных содержали в отдельном теплом помещении при температуре воздуха +230С со свободным доступом к корму, воде, сухому брикетированному корму, дополнительно в питание добавляли сухое молоко, свежую морковь и пшенную кашу. К началу опыта возраст животных-изолянтов и сгруппированных крыс был одинаков и составлял 90-100 дней. Крысы-изолянты после каждого опыта по изучению поведения помещались в свои индивидуальные клетки.
В соответствии с определением ВОЗ, под психической травмой понимается сильное, относительно краткое воздействие внешних отрицательных обстоятельств, приводящее к развитию негативных эмоциональных реакций типа страха, тревоги, ужаса, отчаяния и других, приводящих к формированию соматических нарушений (МКБ – 10, 1993). Психическую травму у крыс моделировали особым стрессирующим воздействием, суть которого состояла в переживании крысой обстоятельств гибели одного из животных группы от действий хищника-питона (Цикунов С.Г. и др., 2000, 2006, 2012; Шабанов П.Д. и др., 2014). Применяли острую однократную психотравмирующую ситуацию, моделируемую в лабораторных условиях. Группу крыс в количестве до 20-22 особей помещали в террариум (размеры 1,2 х 0,7 х 1 м) к тигровому питону массой около 35 кг. Питон удушал и заглатывал одно из животных, остальные крысы наблюдали за этим, находясь вместе с питоном в клетке в ситуации неизбегаемого психогенного стресса (рис. 1).
Как правило, они сбивались в кучу, совершая хаотичные движения, заползая друг на друга, прячась от питона, незначительная часть из них выявляла агрессивные реакции в виде нападения на питона, активно передвигаясь по клетке, пытаясь его укусить. Продолжительность нахождения в террариуме составляла около 25 минут. В ходе эксперимента регистрировали ряд поведенческих актов, включая двигательную (горизонтальную и вертикальную) активность, обнюхивание, груминг, фризинг, неподвижность. После этого крыс забирали из террариума и на протяжении нескольких дней проводили тестирование поведения. Интересно отметить, что поведенческие нарушения у крыс после экспозиции с питоном возникают, как правило, не сразу, а нарастают постепенно, достигая наибольшей выраженности к 7-9-му дню. Именно этот период рассматривался нами как формирование посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) у крыс (Шабанов П.Д. и др., 2014).
В качестве метода моделирования поведенческой аддикции от этанола была использована методика условной реакции предпочтения места (УРПМ). Для выработки УРПМ этанола у крыс использовали двухкамерную установку с гладким и решетчатым полами (рис. 2)
Установка для изучения выработки и воспроизведения условной реакции предпочтения места (УРПМ) у крыс Во время выработки УРПМ животных последовательно помещали в одну из двух камер, разделенных между собой перегородкой, на 30 минут с интервалом между посадками 1 час в течение 4 дней подряд. В течение 1-го часа между посадками крысы содержались в домашней клетке. Перед посадкой в первую камеру крысы получали внутрибрюшинную инъекцию 0,9%-ного раствора NaCl (физиологического раствора), перед посадкой во вторую камеру животным внутрибрюшинно вводили этанол в дозе 0,5 г/кг. Контрольной группе во второй камере вводили 0,9%-ный раствор NaCl. Для исключения влияния текстуры пола на выработку УРПМ этанола животных экспериментальной группы разделяли на две подгруппы: крыс первой подгруппы первоначально помещали в отсек с решетчатым полом, второй подгруппы – с гладким полом. Для оценки выработки УРПМ этанола у животных на 5-й день эксперимента определяли время нахождения в отсеках с различной текстурой пола в течение 15 мин в условиях беспрепятственного перемещения крыс в 2-камерной установке. Полученные данные представляли в процентах как отношение времени пребывания в отсеке, ассоциированном с введением этанола, к общему времени исследования. В последующих экспериментах использовали животных, которые проводили более 60% времени в отсеке, ассоциированном с этанолом (критерий выработки УРПМ). Данные животные на 6-ой день эксперимента получали интраназально антагонист рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 20 мкл интраназально за 5 минут до алкоголизации (рис. 3).
Контрольные животные интраназально получали аналогичную дозу 0,9%-ного раствора NaCl. Затем производили угашение УРПМ в течение 7 дней, которое заключалось в ежедневном тестировании УРПМ без введения алкоголя и иных препаратов. На 7-ой день угашения УРПМ не регистрировалась. На 14-й день эксперимента после 7 суток угашения УРПМ производили введение этанола и регистрировали реакцию возобновления. Части животных вводили антагонист рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 20 мкл интраназально за 5 минут до введения этанола для определения возобновления УРПМ.
Поведение крыс в «приподнятом крестообразном лабиринте» исследовали в экспериментальной установке (рис. 4), которая состояла из двух открытых рукавов 50х10 см и двух закрытых рукавов 50х10 см с отрытым верхом, расположенных перпендикулярно относительно друг друга.
Исследование поведения в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» Высота лабиринта над полом составляла 1 м. Животное помещали в центр лабиринта. Путем нажатия соответствующей клавиши этографа, связанного с компьютером, фиксировали следующие показатели: время пребывания в закрытых и открытых рукавах, время свешивания с платформы в отрытых рукавах и количество выглядываний из закрытых рукавов. Продолжительность теста составляла 5 мин.
Исследование участия грелина и антагониста грелина [D-Lys3]-GHRP-6 в контроле эмоционального и исследовательского поведения у крыс
У крыс, в течение 6 месяцев подвергшихся полупринудительной хронической алкоголизации, вырабатывали условную реакцию предпочтения места этанола в течение 4 дней. На пятый день определяли выработку УРПМ этанола у данных животных. Крысы с выработанной реакцией УРПМ на внутрибрюшинное введение этанола в дозе 0,5 г/кг проводили в камере, ассоциированной с введением этанола в среднем 74,0±11,7% времени эксперимента (p0,05). Далее на шестой день определяли влияние грелина и антагониста грелина на экспрессию УРПМ этанола. Из 27 крыс с выработанной УРПМ 8 животных составили контрольную группу (получали интраназально 20 мкл 0,9%-ный раствор хлорида натрия), 9 – получили интраназально грелин 10 мкг в 20 мкл раствора, 10 – получали интраназально антагонист рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 10 мкг в 20 мкл раствора. Крысы экспериментальной группы (алкоголизация в течение 6 мес), проводили в камере, ассоциированной с введением этанола, в среднем 74,0±11,7% времени эксперимента (p 0,05 по отношению к контролю). Контрольные животные, получившие интраназально 20 мкл физиологического раствора, проводили в камере УРПМ в среднем 657,5±43,0 сек (73,0±4,7% времени эксперимента), показывая тем самым полное сохранение реакции предпочтения места. Крысы, получавшие антагонист рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6, снизили среднее пребывание в камере УРПМ до 419,2±102,8 сек (до 46,5±11,4% времени эксперимента). У крыс, получавших интраназально грелин, наблюдали повышение времени пребывания в камере УРПМ до 497,1±96,8 сек (до 55,2±10,7 % времени эксперимента). Животные, которым вводили физиологический раствор интараназально без введения этанола внютрибрюшинно, проводили в камере УРПМ 540,7±81,0 сек (60,0±9,0% времени эксперимента). Животные, которым вводили антагонист рецепторов грелина интраназально без введения этанола внутрибрюшинно, проводили в камере УРПМ 542,3±79,4 сек (60,2±8,8% времени эксперимента). Животные, которым вводили интраназально грелин без введения этанола внутрибрюшинно, проводили в камере УРПМ 538,1±74,3 сек (59,8±8,2% времени эксперимента). Следовательно, антагонист рецепторов грелина грелина [D-Lys3]-GHRP-6 блокирует выработку УРПМ, что проявляется уменьшением времени нахождения в предпочитаенмой камере (ассоциированной с этанолом) на 26,5% (табл. 1).
Примечание: и/наз – интраназально, в/бр – внутрибрюшинно. р 0,05 относительно животных, получавших физиологический раствор. В последующем на 14 день эксперимента после угашения УРПМ в течение 7 дней изучалось влияние грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 на возобновление УРПМ этанола. Тест угашения УРПМ этанола показал, что в камере, ассоциированной с введением этанола, животные проводили 473,0±5,2 сек (52,3% времени эксперимента), то есть УРПМ не воспроизводилась и не достигала уровня 60%. После введения этанола (напоминания) крысы демонстрировали возобновление УРПМ (проводили в ассоциированной с введением алкоголя камере в среднем 71,0±10,2% времени эксперимента, p 0,05). Животные, получавшие интраназально физиологический раствор + этанол, проводили в камере УРПМ 663,5±36,7 сек (73,7±4,0% времени эксперимента). Группа животных, получавших антагонист рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 находились в камере, ассоциированной с введением этанола, только 458,3±96,2 сек (50,9±10,7% времени эксперимента), то есть УРПМ не воспроизводилась (табл. 2).
Влияние грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 на возобновление УРПМ после ее угашения у крыс Группа животных Время, проведенное в камере УРПМ (сек) Процент временинахождения в камереУРПМ Крысы, получавшие физиологический раствор и/наз + этанол в/бр 663,5±36,7 73,7±4,0 Крысы, получавшие антагонист грелина [D-Lys3]-GHRP-6 и/наз + этанол в/бр 458,3±96,2 50,9±10,7 Крысы, получавшие грелин и/наз + этанол в/бр 467,5±85,6 51,9±9,5 Примечание: и/наз – интраназально, в/бр – внутрибрюшинно; р 0,05 относительно животных, получавших физиологический раствор. Животные, получавшие грелин интраназально и этанол внутрибрюшинно, находились в данной камере 467,5±85,6 сек (51,9±9,5% времени эксперимента). Следовательно, и грелин, и его антагонист [D-Lys3]-GHRP-6 блокировали возобновление УРПМ этанола после ее угашения. Таким образом, проведенные исследования показали, что интраназальное введение пептидного антагониста грелина [D-Lys3]-GHRP-6 в дозе 10 мкг в 20 мкл блокировало формирование УРПМ этанола. В то же ивремя и сам грелин, и его антагонист блокировали возобновление (экспрессию) УРПМ этанола после двух дней ее угашения на 35% и 40% соответственно. Интересно отметить, что внутрибрюшинное введение этанола в разных дозах (от 0,5 до 1,5 г/кг) может обладать как подкрепляющими (как правило, низкие дозы этанола), так и аверсивными свойствами, что, возможно, связано с индивидуальными особенностями животных из-за неоднородности популяции животных. Низкие дозы этанола (0,5-0,75 г/кг), как правило, демонстрируют типичный эффект подкрепления, в данном случае ассоциированный с предпочитаемой камерой УРПМ.
Изучение участия грелина и антагониста рецепторов грелина [D Lys3]-GHRP-6 в организации эмоционального и исследовательского поведения у хронически алкоголизированных в течение 6 месяцев крыс проводили с помощью следующих поведенческих тестов: "Приподнятый крестообразный лабиринт", тест "Открытое поле", тест "Чужак-резидент". Животные были разделены на следующие группы: контрольная группа неалкоголизированных животных, хронически алкоголизированные в течение 6 месяцев животные, интактные неалкоголизированные животные, получавшие интраназально антагонист рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 в дозе 20 мкг, хронически алкоголизированные животные, получавшие интраназально антагонист рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 в дозе 20 мкг. В тестах "Открытое поле и "Чужак-резидент" также была группа интактных животных, получавших интраназально грелин в дозе 20 мкг и хронически алкоголизированные животные, получавшие интраназально грелин 20 мкг.
В тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» оценивали анксиолитическую активность антагониста грелина [D-Lys3]-GHRP-6 у хронически алкоголизированных крыс. Фиксировали время нахождения животных в светлом, темном рукавах, число свешиваний, число актов груминг и число перебежек в течение 5 минут эксперимента. В контрольной группе неалкоголизированных животных время нахождения в светлом рукаве составило 102,5±11,5 сек, время нахождения в темном рукаве – 197,5±12,7 сек, число свешиваний – 7,1±2,1 актов, число перебежек – 4,2±1,2 актов, число актов груминг – 0,1±0,3. В группе алкоголизированных животных, не получавших препараты, время нахождения в светлом рукаве составило 45,0±9,8 сек, время нахождения в темном рукаве – 255,0±10,4 сек, число свешиваний – 3,2±2,2 актов, число перебежек по рукавам – 2,8±1,9 актов, число актов груминга – 0,7±1,0 (табл. 3).
Исследование участия грелина и антагониста рецепторов грелина [D-Lys3]-GHRP-6 в контроле эмоционально-исследовательского поведения и двигательной активности у крыс с постстрессовым расстройством
Было показано значительное снижение подкрепляющих свойств этанола, которые измеряли по уровню дофамина в прилежащем ядре и особенностям поведения (локомоторная активность и условная реакция предпочтения места). Введение грелина (внутрижелудочковое или локальное в вентральную область покрышки) повышало потребление алкоголя у мышей (Jerlhag E. et al., 2011). Кроме того, было показано, что действие грелина наиболее выражено у грызунов, которые ранее уже потребляли алкоголь, так как периферическое введение грелина крысам, не потреблявшим ранее алкоголь, незначительно повышает его потребление (Jerlhag E., et al., 2011; Lyons A.M., et al., 2008).
Таким образом, грелин и его GHS-R1A рецепторы могут регулировать уровень потребления и поиск аддиктивных веществ (Виноградов П.М. и др., 2015). Поэтому лечение пациентов с алкогольной зависимостью с помощью фармакологических веществ, действующих на грелиновую систему, может оказаться перспективным направлением современной психофармакологии и биологической наркологии.
При исследовании эмоционального поведения крыс нами было показано, что грелин обладает модулирующим действием на эмоциональное и исследовательское поведение (Виноградов П.М. и др., 2015.) Ранее (Шабанов П.Д. и др., 2002; 2010) было показано, что нейропептиды КРГ, субстанция Р, орексин, алаптид и другие также способны модулировать данные формы поведения. При этом каждая пептидергическая система имеет свои особенности действия на эмоционально-мотивационную и когнитивную сферы (Asakawa A., et al., 2001; Шабанов П.Д., 2008; 2010). При исследовании поведения в тесте Порсолта этими исследователями было показано, что этанол обладает дерессантным действием, снижая время иммобилизации и увеличивая время плавания. В то же время в наших экспериментах антагонист грелина [D-Lys3]-GHRP-6 показал себя как вещество сбалансированного действия, нормализуя поведение животных до уровня контрольной группы. Так, [D-Lys3]-GHRP-6 10 мкг в 20 мкл интраназально в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» не обладал выраженной анксиолитической активностью: время нахождения в светлом и темном рукавах, а также число свешиваний достоверно не менялось по сравнению с контрольной группой. Он существенно не влиял на коммуникативную активность крыс в тесте «чужак-резидент». В то же время грелин 20 мкг в 20 мкл интраназально, напротив, снижал коммуникативное поведения и проявления агрессии. Как сам грелин, так и его антагонист [D-Lys3]-GHRP-6 снижали исследовательскую активность в тесте «открытое поле».
Это укладывается в современные представления о направленности действия грелина. В частности, грелин активирует преимущественно мотивационные аспекты потребления пищи, связанные с повышением аппетита, включая поведенческие реакции, которые предшествуют приему пищи. После введения грелина (и орексинов) системно или в желудочки мозга у грызунов увеличивается число подходов к кормушке, запасание пищи, ожидание пищевого подкрепления, пищевое предпочтение и пищевая мотивация (Dickson S.L. et al., 1993) В то же время прямых данных о влиянии грелина на эмоциональное поведение и исследовательское поведение при использовании стандартных тестов (открытое поле, приподнятый крестообразный лабиринт, плавательный тест отчаяния Порсолта, «чужак резидент»), обычно используемых для оценки анксиолитического (транквилизирующего) действия препаратов, в доступной литературе не отмечено. Поэтому полученные нами данные об участии грелиновой системы в организацию и контроль эмоционального и исследовательского поведения открывает определенные перспективы для рассмотрения грелина и его аналогов в качестве возможных корректоров эмоционально-мотивационной и когнитивной сфер (Виноградов П.М. и др., 2015). Речь идет не только о пищевом поведении, где эффекты грелина описаны (грелин не только инициирует прием пищи, но и повышает мотивационное поведение и достижение пищевого подкрепления), но и о регуляции внутривидового поведения (агрессия, коммуникативное поведение), исследовательского поведения, а также реакций на введение психотропных веществ (Виноградов П.М. и др., 2015).
Специальный раздел работы был посвящен использованию высокочувствительного иммуноферментного анализа для определения дезацил-грелина, стабильного продукта обмена грелина, в крови экспериментальных животных (крыс). Было подтверждено, что данный пептид выявляется во всех экспериментальных группах крыс (при длительной алкоголизации в течение 6 мес и ее отмене), как в крови, так и в структурах головного мозга. При длительной полунасильственной алкоголизации крыс в течение 6 мес выявлено достоверное снижение концентрации дезацил-грелина в миндалине с последующим повышением при 2- и 7-дневной отмене этанола. В гиппокампе отмечали тенденцию к снижению концентрации дезацил-грелина во всех экспериментальных группах. Статистически значимых различий при этом не было выявлено. В гипоталамусе отмечается резкое увеличение концентрации дезацил-грелина при 2-дневной отмене алкоголя по сравнению с контрольной группой, хронической алкоголизацией и 7-дневной отменой. Тенденции изменения концентрации грелина в структурах расширенной миндалине аналогичны изменениям в сыворотке, полученными в нашей лаборатории (Хохлов П.П. и др., 2014; Виноградов П.М. и др., 2015). В гиппокампе выявлена противоположная тенденция. Результаты показали, что дезацил-грелин при алкоголизации по-разному аккумулируются в различных структурах головного мозга. Динамика содержания дезацил-грелина в различных структурах головного мозга различна, она изменяется в ходе алкоголизации и последующей отмене алкоголя (Виноградов П.М. и др., 2015).