Содержание к диссертации
Введение
1 Механизмы формирования и современные фармакологические подходы к профилактике и коррекции реперфузионного синдрома (литературный обзор) 17
1.1 Патологические процессы, наблюдающиеся при миокар-диальной реперфузии 18
1.2 Молекулярные механизмы реперфузионного поражения миокарда и головного мозга 22
1.3 Фармакологические подходы к профилактике и коррекции реперфузионного поражения внутренних органов 31
1.3.1 Кардиопротекторный эффект веществ с антиоксидантной активностью 31
1.3.2 Газовая сигнализация в формировании кардиопротектор-ного действия 37
1.3.3 Агонисты аденозиновых рецепторов как потенциальные кардиопротекторы 39
1.3.4 Протекторный эффект агонистов опиатных рецепторов при реперфузионном поражении миокарда 40
1.3.5 Инкретиновые пептиды как потенциальные мишени фармакологической регуляции реперфузионного синдрома 41
1.3.6 Терапевтические стратегии коррекции реперфузионного поражения головного мозга 42
2 Материалы и методы исследования 44
2.1 Дизайн исследования 45
2.2 Следование этическим и нормативным требованиям при выполнении диссертационного исследования 47
2.3 Фармакологическая характеристика исследуемых в работе субстанций и референтных лекарственных средств, доз, путей и режимов введения 48
2.4 Характеристика лабораторных животных и условия их содержания 56
2.5 Методические подходы к воспроизведению реперфузи-онных нарушений ритма сердечной деятельности 58
2.6 Методы изучения объема поражения миокарда после его реперфузии 60
2.7 Методы исследования гемодинамики 62
2.8 Метод электрофизиологических исследований in vivo 63
2.9 Методы изучения процессов перекисного окисления ли-пидов и антиоксидантного потенциала 65
2.10 Методы исследования некоторых показателей гомеостаза миокарда собак с реперфузионным синдромом 66
2.11 Методы статистического анализа и обработки полученных экспериментальных данных 67
3 Эффективность исследуемых соединений на моделях, воспроизводящих реперфузионные нарушения ритма сердца 68
3.1 Исследование соединений, содержащих 2-аминоэтансульфоновую кислоту, на модели, воспроизводящей поздние реперфузионные аритмии 68
3.2 Исследование влияния ЛБК-527 и ЛХТ-317 на течение реперфузионных аритмий у крыс 71
3.3 Исследование ЛБК-527 и ЛХТ-317 на модели электрической стимуляции крыс с реперфузируемым миокардом 74
4 Влияние соединений, содержащих аминоэтан сульфоновую кислоту, на объем поражения миокарда и его гомеостаз при экспериментальной реперфузии 81
4.1 Влияние соединений аминоэтансульфоновой кислоты на размеры зон ишемии и некроза на фоне реперфузии миокарда 81
4.2 Влияние соединений 2-аминоэтансульфоновой кислоты на некоторые параметры гомеостаза реперфузируемого миокарда 86
4.3 Влияние соединений 2-аминоэтансульфоновой кислоты на индуцированные реперфузией процессы свободноради-кальной пероксидации в миокарде 91
5 Влияние соединений 2-аминоэтансульфоновой кислоты на локальную и системную гемодинамику и электрофизиологические процессы миокарда в условиях реперфузии 95
5.1 Изучение гемодинамических изменений, возникающих в результате ишемии / реперфузии миокарда и влияния на них исследуемых соединений 95
5.2 Влияние ЛБК-527 и ЛХТ-317 на функциональное состояние изолированного сердца крысы при гипоксии / реокси-генации 99
5.3 Исследование влияния ЛБК-527 и ЛХТ-317 на динамику электрофизиологических параметров сердца собак с реперфузионным синдромом 103
6 Заключение 108
6.1 Итоги выполнения диссертационного исследования 118
6.2 Практические рекомендации 118
6.3 Перспективы дальнейшей разработки темы 119
Выводы 120
Библиографический список 121
- Молекулярные механизмы реперфузионного поражения миокарда и головного мозга
- Исследование соединений, содержащих 2-аминоэтансульфоновую кислоту, на модели, воспроизводящей поздние реперфузионные аритмии
- Влияние соединений 2-аминоэтансульфоновой кислоты на некоторые параметры гомеостаза реперфузируемого миокарда
- Исследование влияния ЛБК-527 и ЛХТ-317 на динамику электрофизиологических параметров сердца собак с реперфузионным синдромом
Введение к работе
Актуальность избранной темы
Острое окклюзионное и реперфузионное поражение миокарда является доминантной причиной гибели пациентов с ишемической болезнью сердца (Chin K.Y. et al., 2015). Реперфузионный синдром, возникающие вследствие ре-канализации коронарной магистрали, проявляется развитием нарушений ритма сердечной деятельности, гибелью кардиомиоцитов, сердечной недостаточностью и, в конечном итоге, смертью (Wit A.L., Janse M.J., 2001). Наиболее типичными клиническими ситуациями, создающими предпосылки для развития реперфузионного синдрома в кардиологии, являются острый инфаркт миокарда с подъемом сегмента ST на ЭКГ вследствие, как правило, тромбоза в месте разрыва атеросклеротической бляшки, проведение интервенционных вмешательств на сосуды сердца, операции аортокоронарного шунтирования и трансплантация сердца (Yellon D.M., Hausenloy D.J., 2007).
Ранняя реперфузия ишемизированного миокарда представляется ключевым событием для поддержания жизнедеятельности ткани миокарда и улучшения клинических исходов острой ишемической коронарной катастрофы (Yellon D.M., Hausenloy D.J., 2007). Парадоксально, но в результате описываемой ре-перфузионной стратегии наблюдается последующее усугубление повреждения тканевых, клеточных и субклеточных структур миокарда в большей степени, чем наблюдалось лишь на фоне только острой ишемии, с формированием так называемого реперфузионного синдрома.
Впервые повреждение миокарда вследствие его реперфузии после периода острой ишемии было описано в 1960 году Jennings и соавт., которые наблюдали у собак набухание клеток, контрактуры миофибрилл и кальцификацию митохондрий кардиомиоцитов. Позднее было доказано, что реперфузионная стратегия индуцирует гибель сохраняющих жизнеспособность кардиомиоцитов зоны ишемии и увеличивает размер зоны инфаркта (гибели ткани). Более того, авторами было установлено, что не менее 50% финальных размеров зоны некроза обусловлены последствиями реперфузионного поражения ткани сердца. Таким образом было показано, что фармакологическая интервенция в период реперфузии, направленная на сохранение жизнедеятельности ишемизиро-ванного миокарда, представляется реалистичным сценарием с точки зрения возможности ограничения размеров повреждения органа (Qutuba G. et al., 2018).
Однако, несмотря на многочисленные экспериментальные исследования различных фармакологических подходов к профилактике и терапии реперфузи-онного синдрома, до настоящего времени не существует ни одной стратегии с доказанной клинической эффективностью (Chin K.Y. et al., 2015).
В настоящее время считается, что ключевыми элементами реперфузионного повреждения внутренних органов являются гиперпродукция активных форм кислорода, перегрузка клеток ионами кальция, инфильтрация ткани воспалительными клетками. В миокарде это приводит к формированию фармакорезистентных ре-перфузионных аритмий, станнинга, микроциркуляторной дисфункции, гемодина-мических нарушений и гибели кардиомиоцитов (Maxwell S.R., Lip G.Y., 1997).
В нашей стране ведутся многочисленные исследования перспективных молекул лекарственных веществ, обладающих высоким потенциалом в области реализации кардиопротекторных, антиишемических и антиаритмических свойств, коррекции эндотелиальной дисфункции в целях нормализации регуляции сосудистого тонуса и микроциркуляторного кровотока (Блинова Е.В. и со-авт., 2016; Василькина О.В. и соавт., 2016; Шахно Е.А. и соавт., 2017; Покровский М.В. и соавт., 2017).
Среди веществ с подобного рода активностью наше внимание привлекли соли 2-аминоэтансульфоновой кислоты, содержащие в качестве основания магний и диметилфенилацетамид. Именно эти соединения были выбраны нами для изучения возможностей профилактического воздействия на миокард с целью разработки фармакологической стратегии предотвращения реперфузионного поражения сердца, что является актуальной задачей фармакологии.
Степень разработанности проблемы
Наблюдаемый в последние десятилетия прогресс исследовательских технологий, приблизил научное сообщество к пониманию ведущих механизмов патологического процесса, возникающего в ответ на восстановление коронарного кровотока после периода ишемии различной продолжительности (Maxwell S.R., Lip G.Y., 1997). Формирование и повышение проницаемости специфического митохондриальной поры (mPTP), активация образования и утечки активных форм кислорода в клеточный матрикс, нарушение функционирования ферментативных систем, принимающих участие в энергетическом и субстратном метаболизме кардиомиоцита, перегрузка клеток и субклеточных структур кальцием, дисбаланс ионов, ответственных за генерацию трансмембранного потенциала, в совокупности определяют патологическую картину реперфузионного поражения миокарда и, с другой стороны, представляют собой биомишени, прицельное фармакологическое воздействие на которые позволит создать эффективные лекарственные технологии профилактики или коррекции негативных последствий реперфузии (Andrienko T.N. et al., 2017).
Среди широкого спектра молекул, обладающих кардиотропной активностью, особого внимания достойны соединений 2-аминоэтансульфоновой кислоты, в которых в качестве основания присутствует магний и диметилфенилаце-тамид. У этих соединений в проведенных ранее исследованиях установлена антиаритмическая активность на ряде интоксикационных моделей нарушений ритма, антиишемическое кардио- и церебропротекторное действие (Блинов Д.С. и соавт., 2013; 2014, Яхья М.Х.С., 2017). Диметилфенилацетамидному соединению присуще местноанестезирующее действие на моделях терминальной, проводниковой и инфильтрационной анестезии (Блинова Е.В. и соавт., 2016; Василькина О.В. и соавт., 2017). Описанные обстоятельства являются фармакологическим основанием для предположения наличия у них кардиопротекторной активности и при реперфузионном повреждении.
Цель работы
На основе комплексного изучения антиаритмической активности, гемо-динамических и электрофизиологических эффектов, влияния на объем повреждения и свободнорадикальные процессы сердца, динамику газов коронарной
венозной крови, функциональную активность изолированного органа обосновать кардио-протекторное действие некоторых соединений 2-аминоэтансульфо-новой кислоты при реперфузионном повреждении миокарда.
Задачи исследования
-
Изучить антиаритмическую активность магний-содержащего (ЛБК-527) и диметилфенилацетамидного (ЛХТ-317) соединений 2-аминоэтан-сульфоновой кислоты на моделях нарушений ритма, возникающих вследствие реперфузии миокарда после периода ишемии различной продолжительности.
-
Изучить влияние соединений ЛБК-527 и ЛХТ-317 на размер зоны некроза, возникающего вследствие восстановления коронарного кровотока у крыс с инфарктом миокарда, а также на рН и концентрацию кислорода и углекислого газа в крови, оттекающей от зоны реперфузии.
-
Провести исследование процессов свободнорадикальной липоперокси-дации и антиокислительной активности миокарда крыс с реперфузионным синдромом на фоне профилактического внутривенного введения соединений ЛБК-527 и ЛХТ-317.
-
Оценить влияние соединений ЛБК-527 и ЛХТ-317 на системную гемодинамику животных с острой ишемией миокарда в период восстановления венечного кровотока, и функциональную активность изолированного сердца крыс в условиях его гипоксии и последующей реоксигенации.
-
Изучить изменения процессов автоматии, возбудимости, проводимости и рефрактерности различных отделов сердца животных с острой ишемией миокарда и последующей реперфузией на фоне фармакологического воздействия с помощью ЛБК-527 и ЛХТ-317.
Научная новизна
В ходе комплексного исследования двух соединений, содержащих 2-аминоэтансульфоновую кислоту – 2-аминоэтнасульфоноата 2-диэтиламино-2',6'-диметилфенилацетамида (ЛХТ-317) и магния бис-2-аминоэтансульфо-ноата (ЛБК-527), проведено фармакологическое обоснование их кардиопротек-торного действия по профилактике формирования реперфузионного поражения миокарда. Впервые показано, что соединение ЛХТ-317 при внутривенном капельном введении полностью купирует реперфузионную желудочковую аритмию у собак, развивающуюся через 2 часа после формирования инфаркта миокарда в дозе, составляющей 65,3% от высшей терапевтической, при этом продолжительность действия превышает 120 мин. Магний содержащее производное ЛБК-527 подавляет частоту эктопической активности более, чем на 50% при внутривенном введении в дозе, равной 48,9% от высшей терапевтической. Оба соединения при профилактическом внутривенном введении предотвращают генерацию ранних реперфузионных аритмий у крыс, возникающих через 7 минут после развития окклюзии коронарной артерии, и электроимпульсной ре-перфузионной аритмии, причем для развития эффекта ЛХТ-317 требуется в два раза меньшая доза, чем для развития эффекта ЛБК-527.
При определении размера зоны некроза у крыс с острым инфарктом миокарда через 2 часа после восстановления коронарного кровотока, установлена способность соединений ЛХТ-317 и ЛБК-527 при внутривенном профилактиче-
ском введении перед перевязкой коронарной магистрали в высшей терапевтической дозе сдерживать рост индуцированного ишемией и реперфузией необратимого повреждения ткани сердца, а также увеличивать объем потенциально жизнеспособного миокарда.
У крыс с острой 30-минутной ишемией и последующей 30-минутной ре-перфузией миокарда соединения 2-аминоэтансульфоновой кислоты ЛХТ-317 и ЛБК-527 предотвращают депрессию сократительной активности миокарда, гипотонию и формирование тахикардии преимущественно в период восстановления кровотока по венечным артериям. В опытах на изолированном сердце крыс перфузия органа 10-4 М соединений позволяла увеличить продолжительность биоэлектрической активности сердца в период 15-минутной гипоксии и 30-минутной реоксигенации, сохранять объем выброса и скорость оттока перфуза-та на уровне, превышающем показатели в контрольных наблюдениях.
Профилактическое введение ЛХТ-317 и ЛБК-527 в высших терапевтических дозах собакам предотвращало аритмическую трансформацию электрофизиологических процессов – возбудимости в большей степени желудочков, проводимости по различным отделам сердца, автоматии синусного узла и длительности рефрактерных периодов преимущественно желудочков – на фоне репер-фузии миокарда поле 30-минутной острой ишемии.
Возможными механизмами, лежащими в основе кардиопротекторных свойств соединений ЛХТ-317 и ЛБК-527, являются антирадикальная активность веществ, установленная хемилюминисцентным методом, и их способность оптимизировать метаболические процессы в миокарде при реперфузии, о чем косвенно свидетельствует динамика парциального напряжения кислорода и углекислого газа, характеристика кислотно-основного равновесия крови коронарного венозного синуса животных.
Научно-практическая значимость работы
Полученные в диссертационной работе результаты обогащают теоретические представления об особенностях развития фармакологического действия кардиопротекторов при реперфузионном повреждении миокарда. Особенности фармакодинамики соединений, содержащих остаток 2-аминоэтансульфоновой кислоты, при ишемическом и реперфузионном синдроме позволяют рассматривать соединения ЛХТ-317 и ЛБК-527 в качестве кандидатов в перспективные лекарственные средства для профилактики и лечения поражений сердца указанной природы.
При проведении настоящего исследования осуществлена модификация ряда известных экспериментальных методов, позволяющих воспроизводить ре-перфузионные аритмии после ишемии разной продолжительности, а также оценивать размер зоны инфаркта при реперфузии миокарда у крыс, что может быть использовано исследователями при проведении поиска потенциальных кардио-протекторов, эффективных при этой патологии.
Методология и методы исследования
Методологической основой при выполнении настоящей диссертационной работы служили «Методические рекомендации по доклиническому изучению антиаритмических лекарственных средств» и «Методические рекомендации по
доклиническому изучению противоишемического (антиангинального) действия лекарственных средств», изложенные в фундаментальном «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств».
Антиаритмическое действие исследуемых в работе соединений изучали на моделях нарушений ритма, возникающих в ответ на реперфузию миокарда. Причем, использовали три принципиально различных подхода к воспроизведению аритмии: во-первых, была использована модель поздней реперфузии – через 120 минут после начала ишемии – у собак, на которой изучалось купирующее действие соединений и устанавливались накопленные эффективные дозы; во-вторых, на модели ранних (через 7 минут ишемии) реперфузионных аритмий у крыс изучали профилактическое действие веществ; и, наконец, на модели электроимпульсной реперфузионной фибрилляции желудочков, исследована проаритмогенная активность соединений.
Кардиопротекторное действие соединений 2-аминоэтансульфоновой кислоты изучали с использованием также трех методических приемов. Исследовали потенциал соединений по ограничению размера зоны инфаркта, формирующейся у крыс с инфарктом миокарда через 2 часа после начала реперфузии. Для этого модифицировали известный дифференциальный индикаторный метод определения размеров зон ишемии и некроза. Используя хемилюминисцентный метод, изучили влияние веществ на интенсивность процессов ПОЛ и антирадикальную активность веществ при реперфузии сердца крыс с инфарктом миокарда. С помощью катетеризации коронарного венозного синуса осуществляли оценку действия веществ на концентрацию кислорода, углекислого газа, рН, буферные системы крови, оттекающей от зоны ишемии / реперфузии.
Гемодинамические эффекты соединений исследованы нами в опытах in vivo и in vitro. Использовали инвазивные и неинвазивные методы для регистрации АД, ЧСС, оценки сократимости миокарда левого желудочка крыс с ишемией / реперфузией. На изолированном гипоксическом сердце путем изменения условий перфузии воспроизводили гипоксию / реоксигенацию, что позволило изучить влияние веществ на насосную функцию органа и продолжительность его биоэлектрической активности в условиях, близких к клиническим.
Связь диссертации с основными научными темами университета
Диссертационная работа проведена при частичной финансовой поддержке исследовательского фундаментального проекта №2859 базовой части государственного задания ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарёва» «Обоснование фармакологических возможностей повышения эффективности и безопасности регуляции деятельности сердца при патологических воздействиях ишемической и стрессовой природы» (номер государственной регистрации 114112440238).
Научные результаты, представляющие высокую научную и практическую ценность, внедрены в образовательный и научно-исследовательский процесс учебных и научных подразделений Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарёва: включены в программу лекционного цикла по дисциплине «Фармакология» для студентов, обучающихся по специальностям «Лечебное дело», «Педиатрия» и «Фармация»; используются при проведении лекционных и семинарских занятий с ординаторами и аспирантами, проходящими обучение
на кафедре фармакологии и клинической фармакологии с курсом фармацевтической технологии названного вуза по профилям направления подготовки «Фундаментальная медицина».
Результаты работы активно используются и обсуждаются в работе научного семинара лабораторий специфической фармакологической активности лекарственных средств, фармакокинетики и таргетной фармакотерапии.
Положения, выносимые на защиту
-
Магний-содержащее и диметилфенилацетамидное соединения 2-амино-этансульфоновой кислоты эффективно предотвращают формирование ре-перфузионных нарушений ритма сердечной деятельности, возникающих у лабораторных животных через 7, 30 и 120 минут после окклюзии коронарной артерии.
-
Соединения ЛХТ-317 и ЛБК-527 при внутривенном профилактическом введении ограничивают процесс гибели миокарда, обусловленный ишемиче-ским и реперфузионным повреждением сердца, сдерживают депрессию системной и локальной гемодинамики, аритмическую трансформацию электрофизиологических процессов в органе; перфузия изолированного сердца 10-4 М ЛХТ-317 и ЛБК-527 в условиях его гипоксии / реоксигенации пролонгирует период биоэлектрической активности миокарда.
3. Кардиопротекторное действие соединений при реперфузионном син
дроме обусловлено их антирадикальной активностью и способностью позитив
но воздействовать на состояние метаболизма миокарда при его ишемии и по
следующей реперфузии.
Степень достоверности
Достоверность полученных в диссертационной работе результатов и сформулированных выводов определяется следующими обстоятельствами: а) все экспериментальные исследования проведены на здоровых сертифицированных лабораторных животных, при получении, транспортировке и содержании которых неукоснительно соблюдались требования национальных регулирующих стандартов; б) примененные в исследовании методы являются общепринятыми и воспроизводимыми, лабораторное оборудование – исправным и поверенным, материалы – соответствующими целям и задачам экспериментального исследования; в) субстанции исследуемых веществ, готовые лекарственные формы были получены и хранились в соответствие с требованиями к условиям и срокам их хранения; г) ведение исследовательской документации проводили в соответствие с установленными правилами; д) объем выполненных исследований отвечал принципам необходимости и достаточности и обеспечивал получение релевантных результатов; е) при обработке и анализе результатов корректно использованы методы вариационной статистики: применены параметрические и непараметрические критерии сравнения.
Апробация результатов работы
Апробация результатов диссертационного исследования проведена на совместном расширенном заседании кафедр фармакологии и клинической фармакологии с курсом фармацевтической технологии, факультетской хирургии с курсами топографической анатомии и оперативной хирургии, урологии и дет-
ской хирургии, анестезиологии и реаниматологии, нормальной и патологической физиологии, цитологии, гистологии, эмбриологии с курсом медицинской биологии и молекулярной биологии клетки, лабораторий Центра перспективных исследований инновационных лекарственных средств ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарёва», протокол №2 от 22.02.2018 г.
Результаты исследований докладывались на II и III Международных научно-практических конференциях «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области» (Пенза, 2012, 2013); конференции «Здравоохранение XXI века: проблемы и пути решения: материалы молодежной научной конференции с элементами научной школы. (Саранск, 2012); VII Всероссийской итоговой студенческой научной конференции «Студенческая наука и медицина XXI века: традиции, инновации и приоритеты» (Самара, 2013), XX и XXIII Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2013, 2016), XVI и XVII Всероссийских медико-биологических конференциях молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2013, 2014); II Всероссийском студенческом научном форуме с участием молодых исследователей «Актуальные проблемы медицинских наук» (Саранск, 2013); XVII Российском конгрессе кардиологов (Екатеринбург, 2016).
Личный вклад автора
Автором выдвинута идея проведения настоящего исследования и разработана его гипотеза. Автор лично сформировал детализированный план и дизайн диссертационного проекта. Подготовительный этап исследования проведен лично автором. Анализ российских и международных научных публикаций, подготовка литературного обзора проведены им самостоятельно. Автор принимал непосредственное участие в проведении всех экспериментов на крысах и собаках, лично ставил опыты на изолированных сердцах крыс, вел учетную документацию, обобщал полученные результаты, проводил статистическую группировку и сводку. Автор принимал самое деятельное участие в подготовке и публикации печатных работ по теме своего диссертационного исследования. Им лично написаны рукописи диссертации и автореферата.
Публикации по теме диссертационной работы
По теме диссертационного исследования опубликовано 17 научных работ, из них 7 статей – в центральных рецензируемых изданиях и журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, и 1 патент на изобретение Российской Федерации.
Объём и структура работы
Диссертация изложена на 156 страницах компьютерного текста, иллюстрирована восемью рисунками и десятью таблицами. Библиографический список содержит 327 работ, из которых 20 – отечественных и 307 – зарубежных авторов. Диссертация изложена в классическом стиле, имеет традиционную структуру, включающую введение, обзор литературных источников, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, заключение и выводы, библиографический список.
Молекулярные механизмы реперфузионного поражения миокарда и головного мозга
В последнее время растет понимание патофизиологических механизмов формирования реперфузионного поражения сердца и головного мозга, что составляет субстантивный базис для выработки эффективных фармакологических подходов для кардиопротекции. Ключевыми процессами, лежащими в основе ре-перфузионного синдрома, как уже было сказано выше, считают повышение продукции токсичных форм кислорода, перегрузку клеток ионами кальция, а также инфильтрацию зоны ишемии – реперфузии клетками воспаления. На уровне ЦНС, кроме того, важнейшим механизмом реперфузионно поражения является нарушение целостности гемато-энцефалического барьера.
В рамках настоящего обзора хотелось бы подробнее остановиться на каждом из упомянутых процессов. Молекулярный кислород используется клетками как терминальный акцептор электронов в метаболической цепи утилизации органических – карбоновых – кислот и продукции энергии. В миокарде 95% молекулярного кислорода редуцируется в воду через митохондриальную электроно-транспортную цепь. Сам по себе данный процесс может служить источником утечки электронов и формирования активных форм кислорода. Последние, в свою очередь, включают свободные радикалы, такие как синглетный кислород и гид-роксил-радикал, нерадикальный пероксид водорода, пероксинитрит (ONOO-) и хлористоводородная кислота (HOCl) [49-52]. В процессе реперфузии потенциальными источниками продукции активных форм кислорода являются митохондрии паренхиматозных клеток – кардиомиоци-тов и нейронов, фосфолипиды клеточной мембраны и цитоплазма (ключевая роль в данном процесс принадлежит НАДФН и синтазам оксида азота). Кроме того, дополнительным ресурсом являются нейтрофилы, эндотелиальные клетки и тромбоциты [53, 54].
В течение ишемического процесса выработка АТФ лимитирована резким ограничением поступления кислорода, что влечет за собой гидролиз имеющегося аденозинтрифосфата с образованием АДФ и, затем, АМФ. В процессе последующего катаболизма АМФ образуется гипоксантин. После восстановления нарушенного кровотока кровотока вследствие реперфузии гипоксантин вступает в реакцию с поступающим кислородом. Данная реакция катализируется ксантинокси-дазой [5] и сопровождается продукцией мочевой кислоты и синглетного кислорода – мощного ресурса активных форм данного химического элемента при репер-фузии [55].
Хотя, несомненно, продукция высокореактогенных форм кислорода наблюдается и при ишемии, именно реперфузия потенцирует взрывной характер выработки этих химических форм кислорода. Прямые доказательства этого были получены в результате использования метода спиновой электронной резонансной спектроскопии. Так, Zweier и соавторы продемонстрировали пиковый рост генерации кислород-содержащих радикалов в течение первых 10 секунд после репер-фузии изолированного сердца кролика с глобальной ишемией миокарда [56]. Позднее Bolli с сотрудниками, используя тот же методический прием наблюдали формирование активных радикалов в течение 15-минутной ишемии у собак в опытах in vivo [57]. Кроме того, повышенная продукция активных форм кислорода в экспериментальных условиях была доказана и с помощью других экспериментальных методов, таких как хемилюминисценция на изолированных сердцах и полосках кардиомиоцитах, целостных организмах животных [58, 59], использование чувствительных флуоресцентных внутриклеточных зондов кардиомиоцитов [60, 61]. На уровне головного мозга подобные исследования также проводились рядом авторов.
В указанных работах была показан не только ингибирующий эффект активных радикалов на функцию левого желудочка [62], но также установлен прямой цитотоксический эффект на кардиомиоциты и эндотелиальные клетки [63], что послужило обоснованием ключевого значения свободных радикалов в формировании сердечных аритмий, сердечного станнинга и эндотелиальной дисфункции [23]. Более того, сейчас также не вызывает сомнений тот факт, что тяжесть течения окклюзионно-реперфузионного синдрома прямо пропорциональна магнитуде продукции активных радикалов в кардиомиоцитах [39].
В физиологическом состоянии свободная концентрация цитозольного кальция в кардиомиоцитах составляет в диастолу порядка 100 нМ и повышается до 0,5-1,5 мкМ в течение систолы. При ишемическом поражении сердца уже через несколько минут после прекращения кровотока концентрация кальция в кардио-миоцитах ишемизированной зоны может возрастать до 1-10 мкМ [64]. Настоящие данные удалось получить при использовании кальций-специфических флуоресцентных зондов, магнитно-резонансной томографической спектроскопии [65-69]. При этом следует понимать, что перегрузка сердечных клеток кальцием, наблюдающаяся в процессе окклюзионно-реперфузионного синдрома является следствием ишемического нарушения метаболизма и обмена ионов кардиомиоцитов (рис. 1.2).
В естественном состоянии сердечная мышца представляет собой высоко аэробную ткань, в которой большая часть продуцируемой энергии получается в результате оксидативного метаболизма. При снижении поступления кислорода к сердцу в течение ишемического состояния, орган переключается на анаэробный метаболизм, сопровождающийся ростом внутриклеточного ацидоза вследствие накопления лактата и иных продуктов анаэробного гликолиза.
Примечание: CaMKII – Са2+-кальмодулин зависимая протеинкиназа II, NCX – натрий-кальциевый обменник, NKA – натрий-калиевая АТФ-аза, NHE – натрий-водородный обменник, NMgX – натрий-магниевый котранспортр, RyR – риано-диновые рецепторы, NBC – натрий-бикарбонатный обменник, N/K 2Cl – натрий-калий-2 хлор-котранспортр, ROS – активные формы кислорода
Быстрое нарастание ацидоза активирует рН-зависимые ионные транспортеры, включая натрий-водородный обменник и натрий-карбонатный ко-транспортер, совместная работа которых влечет аккумуляцию ионов натрия внутри клетки (рис. 1.1) [70-73].
С другой стороны, истощение пула АТФ приводит к инактивации Na+/К+-АТФ-азы, что сопровождается дополнительным ростом внутриклеточных концен 26 траций ионов натрия в кардиомиоцитах [74, 75]. Перегрузка клеток натрием запускает работу натрий-кальциевого обменника в противоположную сторону, в результате чего кальций накапливается в кардиомиоцитах [72]. Дополнительное поступление кальция в клетку становится возможным в результате повышения проницаемости поврежденной свободными радикалами цитоплазматической мембраны для кальция [76, 77]. Как только концентрация цитозольного кальция увеличивается, саркоплазматический ретикулум начинает выделять дополнительные ионы кальция вследствие стимуляции рианодиновых рецепторов 2 типа (RyR 2, рис. 1.1) [78], в то время как механизм естественной компенсации гиперкальцийгистии (Са2+-АТФ-аза) нарушается вследствие дефицита АТФ. Данный феномен описан в литературе как процесс перераспределения внутриклеточного кальция [64]. Драматическим результатом описанного процесса является кальций-зависимая активация повреждающих механизмов внутри клеток сердца. Активация ферментов, фосфолипаз и протеаз, влечет повреждение макромолекулярных внутриклеточных комплексов [64, 79, 80], вырабатываются проапоптотические факторы и запускается программируемая гибель клеток [81, 82]. Оксидативный стресс наряду с гиперкальцийгистией вовлекает эндоплазматический ретикулум в процесс аутофагии. Однако, следует сказать, что последнее утверждение остается дискуссионным, поскольку аутофагия в данном случае может приводить как к гибели клеток, так и к процессу естественного их обновления [83, 84]. Кроме того, перегрузка гладкомышечных элементов сосудов зоны ишемии приводит к вазоко-нстрикуции и неполноценной реперфузии [85].
Нужно сказать, что описанные механизмы повреждения клеток при ишеми-ческом и реперфузионном синдроме не являются эксклюзивными и представляют собой взаимовлияющие этапы одного каскада поражения как миокарда, так и головного мозга. Так, мы уже упоминали ряд возможных механизмов повышения внутриклеточной концентрации кальция под воздействием свободных радикалов. Во-первых, эндоплазматический ретикулум особо чувствителен к воздействию активных форм кислорода, повреждающих мембрану и повышающих ее проницаемость для ионов кальция [85]. Во-вторых, активные формы кислорода ингибируют гликолитическое и окислительное фосфорилирование [86], что влечет истощение пула свободной АТФ с последующей дисфункцией эндоплазматического ретикулума и перегрузкой цитозоля ионами кальция. В свою очередь, перегрузка клеток кальцием сама влечет образование активных радикалов [87].
Исследование соединений, содержащих 2-аминоэтансульфоновую кислоту, на модели, воспроизводящей поздние реперфузионные аритмии
Зачастую в клинической практике можно наблюдать формирование нарушений сердечного ритма, возникающих в ответ на позднее восстановление коронарного кровотока – в течение первых 120 мин после развития острого коронарного синдрома. Для того, чтобы смоделировать подобную ситуацию, мы воспользовались известным методом поздних окклюзионных аритмий у собак по Harris, при этом модифицировав ее так, чтобы на 121 минуте можно было восстановить коронарный кровоток.
Исследование было выполнено на 5 группах животных: 5 собак составили контрольную серию, в 4 сериях, также включавших по 5 животных изучили фармакологический эффект соединений ЛХТ-317, ЛБК-527 и двух референтных антиаритмических лекарственных средств – лидокаина гидрохлорида и амиодарона. Мы не стали вводить лекарственные вещества одномоментно, но вводили их ка-пельно с тем, чтобы помимо регистрации самого факта наступления эффекта можно было сопоставить также эффективные дозы исследуемых соединений и препаратов сравнения.
Исследование лидокаина гидрохлорида с целью установления силы и продолжительности его купирующей активности проведено в одной серии опытов, состоявшей из 5 собак. Мы отмечали, что у всех животных развивался полный антиаритмический эффект в среднем к 46 мин инфузии лекарственного средства со скоростью 0,024 мг/кг в мин. Средняя накопленная доза составила 1,1 мг/кг или 46,6% от ВТД. Продолжительность полного антиаритмического эффекта составляла не более 16 минут во всех наблюдениях (таблица 3.2).
Исследование амиодарона. Препарат вводили 5 бодрствующим собакам внутривенно в 5% растворе декстрозы со скоростью 0,085 мг/кг в минуту. При этом наблюдали снижение ЧСС в среднем со 193 до 144 в минуту, что объясняется как -адреноблокирующей активностью препарата, так и удлинением ПД. Полной фармакологической кардиоверсии удалось достичь у 3 животных в среднем к 71 мин инфузии, у остальных собак наблюдали подавление эктопической активности более, чем на 50% от исходной. Средняя накопленная доза амиодарона составила 6,0 мг/кг или 70,3% от ВТД. Продолжительность антиаритмического действия препарата была высокой и составила 158±20 мин.
Исследование ЛХТ-317. Вещество вводили инфузионно 5 собакам со скоростью введения 0,015 мг/кг в мин. Полное прекращение аритмии и восстановление синусового ритма мы наблюдали у всех животных в группе через 64 мин после начала инфузии. Накопленная доза ЛХТ-317 составила в среднем 1,0 мг/кг или 65,3% от ВТД. Длительность полного антиаритмического эффекта вещества равнялась в среднем 124 мин (Таблица 3.2).
Исследование ЛБК-527. Соединение вводили собакам внутривенно капельно со скоростью введения 0,053 мг/кг в 1 минуту. Ни у одного животного не регистрировали полного прекращения реперфузионной аритмии, однако через 47 мин после начала инфузии отмечали снижение эктопической активности более, чем на 50% у всех животных в группе. Следовательно накопленная эффективная доза соединения составила 2,49 мг/кг или 47,9% от ВТД ЛБК-527 (таблица 3.2).
Несмотря на то, что накопленная эффективная доза диметилфенилацетами-да аминоэтансульфоноата была большей, чем у лидокаина гидрохлорида, тем не менее, она была ниже, чем у амиодарона. В отличие от амиодарона введение соединение ЛХТ-317 вызывало формирование полного антиаритмического эффекта, а в отличие от лидокаина гидрохлорида длительность антиаритмического действия вещества была существенно более высокой.
Магний-содержащее производное 2-аминоэтансульфоновой кислоты обладало наименее высоким антиаритмическим эффектом из всех исследуемых фармакологических агентов: ни в одном случае не регистрировали полного подавления эктопической активности. При этом, следует подчеркнуть, что достижение частичного антиаритмического эффекта у всех животных наблюдали при введении суммарной дозы вещества, не превышавшей 50% от высшей терапевтической. Также примечателен тот факт, что продолжительность действия вещества существенно превышала таковую лидокаина, но уступала амиодарону.
Влияние соединений 2-аминоэтансульфоновой кислоты на некоторые параметры гомеостаза реперфузируемого миокарда
Оценка состояния метаболических процессов в миокарде в условиях репер-фузии является важнейшей составляющей изучения роли потенциальных лекарственных средств в профилактике и коррекции реперфузионного поражения сердца. Реоксигенация находившихся в состоянии ишемии тканей влечет активацию кислород-зависимых ферментных систем с подчас драматическими последствиями для клеток и ткани в целом. В опытах на собаках, у которых через 45 мин окклюзии воспроизводили реперфузионное поражение сердца в течение 15 мин, исследовали парциальное напряжение и сатурацию кислорода и углекислого газа, рН, а также емкость карбонатной буферной системы.
Основные результаты данного раздела работы иллюстрированы в таблице 4.6. Для того, чтобы проследить динамику изучаемых показателей в зависимости от состояния перфузии несколько модифицировали схему постановки опыта с точки зрения забора крови для исследования в контроле и опытных группах: второй забор крови для исследования производили через 45 мин после окклюзии коронарной артерии, а третий – через 15 минут после того, как кровоток по сосуду восстанавливали.
Исследуемые вещества и референтное лекарственное средство вводили в накопленной эффективной дозе на модели поздней аритмии у собак. В контрольной серии опытов, проведенной на 5 собаках обоего пола, катетеризация коронарного венозного синуса с последующей окклюзией коронарной артерии приводила через 60 мин после формирования острой патологии к развитию ацидоза (показатель рН снижался с 7,45 до 5,51), росту концентрации углекислого газа и снижению парциального напряжения кислорода, его насыщения крови, наряду с истощением буферных резервов карбонатной буферной системы (таблица 4.6). Реперфузия коронарной артерии сопровождалась резким повышением концентрации кислорода в крови коронарного венозного синуса, стагнацией уровня углекислого газа. На этом фоне наблюдали рост рН, емкости карбонатной буферной системы, и сатурации кислорода.
Внутривенное введение собакам референтного антиаритмического лекарственного средства амиодарона в эффективной накопленной дозе (на модели реперфузи-онной аритмии у собак) изменяло картину газового профиля крови как на фоне 45-минутной ишемии, так и после восстановления коронарного кровотока. В частности, ацидоз, хотя и формировался, носил более мягкий характер. Не происходило критического снижения концентрации кислорода в крови, оттекающей из зоны острой ишемии, что свидетельствовало о формировании так называемого ишемического прекондиционирования, когда потребность миокарда в кислороде снижается и, соответственно снижается его потребление из артериальной крови. Это приводило к незначительному росту парциального напряжения углекислого газа. Декомпенсации буферных систем не наблюдали.
На основе анализа показателей гомеостаза после реперфузии можно сделать вывод о компенсаторной способности амиодарона, проявлявшейся в достижении изучаемыми показателями значений, близких к исходным и довольно контрастным при сравнении с контрольными показателями.
Исследуемые в работе соединения, в структуру которых входит 2-аминоэтансульфоновая кислота, также эффективно предотвращали драматические сдвиги гомеостатических показателей крови, оттекающей из зоны повреждения миокарда: происходила коррекция ишемического ацидоза, напряжения газов в крови, свидетельствующая о формировании оптимального режима потребления кислорода миокардом. При этом следует обратить внимание на то, что оба соединения, в большей степени – ЛХТ-317 – проявляли активность по предотвращению негативных последствий реперфузии, чем ишемического повреждения.
Исследование влияния ЛБК-527 и ЛХТ-317 на динамику электрофизиологических параметров сердца собак с реперфузионным синдромом
Поскольку внутриклеточные процессы, возникающие в ответ на восстановление коронарного кровотока после периода ишемии различной продолжительности влекут за собой изменения ионного гомеостаза сердечной ткани с развитием электрической нестабильности, очагов аномальной автоматии, круговых возбуждений, на заключительном этапе нашего диссертационного проекта мы оценили влияние соединений, содержащих 2-аминоэтансульфоновую кислоту, на основные электрофизиологические характеристики миокарда наркотизированных и находящихся на управляемом дыхании собак, у которых после 30 минут окклюзии коронарной артерии формировали реперфузионный синдром.
Исследуемые вещества вводили внутривенно болюсно в профилактическом режиме после регистрации исходных электрофизиологических параметров в эффективных накопленных дозах, установленных на модели поздней реперфузион-ной аритмии у данного вида животных.
Сначала оценили влияние веществ ЛХТ-317 и ЛБК-527 на функции автома-тии синусного узла, а также проводимость по различным отделам сердца: предсердиям, атриовентрикулярному узлу и желудочкам. Результаты представлены на рис. 5.7 – 5.9.
Формирование острой ишемии миокарда приводило к подавлению функции автоматии синусного узла, которую оценивали по значению показателя ВВФСУ (время восстановления функций синусного узла) – в контроле он снижался в среднем на 20% от исходных значений.
Реперфузия миокарда сопровождалась еще более глубокой депрессией нормальной автоматии сердца, что клинически проявляется формированием репер-фузионных аритмий.
Профилактическое внутривенное введение ЛБК-527 предотвращало ишеми-ческое подавление автоматии номотопного водителя ритма, а также способствовало более мягкому прогрессированию депрессии автоматии во время реперфузии. Несколько иными были результаты, полученные при исследовании соединения ЛХТ-317: если соединение не было способно поддержать уровень синусной авто-матии в период острой ишемии, то в течение реперфузии показатель ВВФСУ не только не снижался по сравнению с предыдущим периодом регистрации, но, напротив, стремился к исходному значению.
Реперфузия миокарда оказывала негативное влияние и на процессы проводимости по предсердиям, атриовентрикулярному соединению и желудочкам: наблюдалось подавление проводимости по предсердиям, ускорение этого процесса через АВ-соединение и желудочки, что являлось благоприятным условием для формирования нарушений сердечного ритма и проводимости, ассоциированных с рассматриваемой патологией.
Соединение ЛБК-527 при профилактическом внутривенном введении собакам способствовало сохранению скорости проведения волны возбуждения по предсердиям и, при этом предотвращало ускорение проведение по атриовентри-кулярному соединению и желудочкам, при этом практически не оказывая существенного влияния на показатели проводимости отделов сердца на протяжении периода ишемии.
Производное 2-аминоэтансульфоновой кислоты с диметилфенилацетами-дом (ЛХТ-317) воспроизводил описанные эффекты для ЛБК-527, но в сравнении с данным соединением проявил тенденцию к более активному воздействию на изучаемые параметры проводимости.
Важнейшими электрофизиологическими процессами, определяющими ритмическую функцию сердца и передачу импульса по проводящей системе и рабочему миокарду являются свойства возбудимости и рефрактерности. Поэтому в настоящем разделе мы изучили влияние соединений ЛБК-527 и ЛХТ-317 на динамику порогов возбуждения предсердия и желудочка, а также длительности эффективных рефрактерных периодов предсердия, атриовентрикулярного соединения и желудочков в зависимости от воспроизведения периодов ишемии и репер-фузии у собак. Результаты представлены на рис. 5.8.
Реперфузионный синдром закономерно стимулировал снижение порогов возбудимости и предсердия и, в большей степени, желудочка, что характеризовало повышение батмотропной функции указанных отделов сердца. Исследуемые вещества при их профилактическом внутривенном введении не оказывали значимого влияния на возбудимость предсердий, при этом предотвращая реперфузион-ный рост возбудимости миокарда желудочков. В большей степени это утверждение справедливо для диметилфенилацетамида 2-аминоэтансульфоноата (соединения ЛХТ-317).
Функция рефрактерности также подвергалась негативной динамике вследствие реперфузионного нарушения ионного гомеостаза кардиомиоцитов: укорачивалась продолжительность ЭРП атриовентрикулярного соединения и желудочков, рефрактерность предсердий значимо не изменялась.
Профилактическое введение исследуемых соединений приводило к увеличению длительности рефрактерности желудочков, а соединение ЛБК-527 увеличивало и рефрактерный период атриовентрикулярного соединения.
Таким образом, спектр электрофизиологических эффектов соединений ЛБК-527 и ЛХТ-317 объясняет их способность предотвращать формирование нарушений ритма сердечной деятельности, обусловленных реперфузионным поражением миокарда.