Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 19
1.1 Современные проблемы лечения инфекционных заболеваний 19
1.1.1 Проблемы распространения антибиотикорезистентных возбудителей зооантропонозных инфекций 19
1.1.2 Механизмы развития антибиотикорезистентности возбудителей инфекционных заболеваний 26
1.1.3 Проблемы устойчивости микроорганизмов дезинфекционным и антисептическим средствам 37
1.1.4 Микробные биопленки как фактор развития устойчивости к антимикробным препаратам и их роль в развитии инфекционных осложнений 41
1.1.5 Методические подходы к борьбе с микробными биопленками 46
1.2 Использование синтетических гетероциклических соединений в медико биологической и ветеринарной практике 50
1.2.1 Гетероциклические соединения с антиоксидантными свойствами 50
1.2.2 Гетероциклические соединения с антимикробным действием 56
1.2.3 Полимерные соединения с антимикробной активностью 61
Собственные исследования 66
Глава 2. Объект, материалы и методы 66
2.1 Экспериментальные модели 66
2.2 Химические соединения, использованные в работе 69
2.3 Методы микробиологических исследований 77
2.4 Оценка эффективности обеззараживания изделий медицинского назначения 80
2.5 Определение противовирусной активности химических соединений 82
2.6 Определение биологической активности гетероциклических соединений 83
2.7 Методы консервации микроорганизмов и определение продолжительности их хранения 85
2.8 Методы токсикологических исследований 87
2.8.1 Биотестирование на биотест-объекте Daphnia magna Straus 87
2.8.2 Определение острой токсичности на лабораторных животных 88
2.9 Исследование ранозаживляющих свойств препаратов 89
2.10 Статистическая обработка результатов 91
Глава 3. Характеристика биологического действия полимерных и гетероциклических соединений в отношении стандартных и клинических штаммов микроорганизмов 93
3.1 Изучение антимикробного действия полимерного соединения и его модификаций 93
3.1.1 Исследование антимикробной активности полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами йода, в отношении стандартных и клинических штаммов условно-патогенных микроорганизмов 93
3.1.2 Оценка эффективности антмикробного действия варианта полимерного соединения с высокой концентрацией гидрат-ионов йода 97
3.1.3 Сравнительная оценка действия полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами йода, и раствора диоксида хлора на санитарно-показательные микроорганизмы воды 99
3.1.4 Сравнительная оценка антимикробной активности полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами йода, и стандартных иод-содержащих антисептических препаратов 104
3.2 Изучение биологической активности гетероциклических соединений различных классов 104
3.2.1 Оценка антимикробной активности гетероциклических соединений различных классов 104
3.2.2 Изучение антифаговой и антиоксидантной активности гетероциклических соединений различных классов 113
3.2.3 Влияние химической структуры гетероциклических соединений на их биологическую активность 123
3.3 Исследование противовирусной активности 2,4-дихлор-1,3,5-трифенил 2-пентен-1,5-дионаи полиазолидинаммония, модифицированного гидрат ионами йода 130
Глава 4. Определение токсичности перспективных гетероциклических и полимерных соединений с высокой антимикробной активностью 133
4.1 Определение острой токсичности соединений на биотест-объекте Daphnia magna Straus 133
4.2 Определение острой токсичности соединений на лабораторных животных 136
Глава 5. Оценка биологического действия полимерного соединения на биопленочные формы условно-патогенных микроорганизмов в условиях in vitro 140
5.1 Особенности формирования в условиях in vitro микробных биопленок условно-патогенными микроорганизмами 140
5.2 Оценка воздействия полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами йода, на процесс формирования микробных биопленок 147
5.3 Влияние полимерного соединения на формирование микробных биопленок микроорганизмами на модели изделия медицинского назначения 154
Глава 6. Разработка лабораторных образцов препаратов по технологии «ядро-оболочка» с использованием полимерного соединения 162
6.1 Обоснование использования технологии структур «ядро-оболочка» и конструирование препаратов 162
6.2 Изучение антимикробной активности структур «ядро-оболочка» на основе наноразмерных агрегатов флавоноидов, стабилизированных полимером 165
6.3 Изучение ранозаживляющих свойств структур на основе наноагрегатов флавоноидов, стабилизированных полимерным соединением, на моделях неосложненных и осложненных полнослойных гнойных ран 167
6.4 Сравнительная оценка антимикробной активности соединений ряда енаминов и их аналогов, модифицированных полимерным соединением 177
6.5 Изучение антимикробных свойств фильтрующих систем, созданных по технологии «ядро-оболочка», с использованием полимерного соединения 180
Глава 7. Обоснование перспектив использования полимерного и гетероциклических соединений в медико-биологической практике 184
7.1 Оценка дезинфицирующего действия полимерного соединения в отношении искусственно контаминированных микроорганизмами изделий медицинского назначения в лабораторных условиях 184
7.2 Оценка влияния сочетанного действия антибиотиков и полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами йода, на выживаемость стандартных и клинических штаммов условно-патогенных бактерий 188
7.3 Влияние сублетальных концентраций полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами йода, на чувствительность клинического полирезистентного штамма P.aeruginosa к антимикробным препаратам 194
7.4 Разработка защитных сред, содержащих синтетические антиоксиданты, для лиофилизации и хранения в коллекциях культур микроорганизмов 196
Заключение 199
Выводы 216
Список сокращений и условных обозначений 219
Список литературы 221
Приложение 1 272
Приложение 2 273
- Механизмы развития антибиотикорезистентности возбудителей инфекционных заболеваний
- Оценка антимикробной активности гетероциклических соединений различных классов
- Изучение ранозаживляющих свойств структур на основе наноагрегатов флавоноидов, стабилизированных полимерным соединением, на моделях неосложненных и осложненных полнослойных гнойных ран
- Оценка влияния сочетанного действия антибиотиков и полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами йода, на выживаемость стандартных и клинических штаммов условно-патогенных бактерий
Механизмы развития антибиотикорезистентности возбудителей инфекционных заболеваний
В последние десятилетия широкое использование антимикробных средств в различных областях медицины, ветеринарии, сельского хозяйства привело к формированию и распространению антибиотикорезистентных штаммов бактерий и микроскопических грибов (Страчунский Л.С., Белоусова Е.Б., Козлова С.Н., 2002; Покровский В.И., 1998; Митрохин С.Д. с соавт., 1996; Еремин СР. с соавт., 1992; McKinnell J.A. et al., 2013; Kollef М., 1994).
Существует две общепринятые группы факторов, которые способствуют формированию антибиотикорезистентных штаммов возбудителей (Larson Е., 2007):
1. поведенческие, которые связаны с применением антибиотиков в медицинской практике и контролем за распространением инфекционных болезней;
2. факторы окружающей среды, связанные с применением антибиотиков в ветеринарной практике, а также разработкой новых антимикробных препаратов.
Основной причиной формирования антибиотикорезистентности является нерациональная антибиотикотерапия, которая обусловлена несоблюдением схем приема препаратов, избыточным назначением, а также самолечением антибиотиками (Bell B.G. et al., 2014, ВОЗ, 2014). Кроме того, зачастую назначение антибиотиков проводится необоснованно с профилактической целью для снижения риска инфекционных осложнений при хирургическом вмешательстве.
Важную роль в распространении антибиотикорезистентных штаммов играют и домашние животные, пища которых может содержать антибиотики. Такие животные могут является источником метициллинрезистентных S. aureus, передача которых человеку возможна либо при непосредственном контакте с ними, либо алиментарным путем (Weese J., 2005; Larson Е., 2007).
Различают два типа устойчивости микроорганизмов к антимикробным препаратам: природную и приобретенную.
Природная устойчивость обусловлена отсутствием у микроорганизмов мишени для связывания с антибиотиком и является видовым признаком (Страчунский Л.С., Козлов С.Н., 2001). Так, например, клинически неэффективными для лечения заболеваний, вызванных бактериями родов Mycoplasma и Ureaplasma, являются бета-лактамные антибиотики ввиду отсутствия у возбудителей клеточной стенки (Сидоренко СВ., Белоусова Ю.Б., Козлова С.Н., 2002).
Сохраняет свою актуальность приобретенная лекарственная устойчивость, связанная со способностью некоторых штаммов микроорганизмов поддерживать жизнеспособность при действии антибиотиков, в концентрациях подавляющих жизнедеятельность основной части микробной популяции (Козлов Р.С, 2009). Выделяют первичную устойчивость, которая присутствует у микроорганизмов еще до начала использования антибиотиков, и вторичную устойчивость, которая формируется в ходе применения антимикробных препаратов (Сидоренко СВ., Белоусова Ю.Б., Козлова С.Н., 2002). Приобретенная резистентность связана с изменением генома микроорганизмов, который происходит либо в результате мутационного процесса, либо в ходе переноса генетического материала между микробными клетками и дальнейшей селекцией устойчивых штаммов (Иванов А.С., 2009; Gloede J. et al., 2010; Hiramatsu К. et al., 2001).
Перенос генов резистентности между клетками микроорганизмов происходит с помощью мобильных генетических элементов (МГЭ) (Супотницкий М.В., 2011; Lin J. et al., 2015). Различают две основные группы МГЭ, которые отличаются способностью:
1. самостоятельно перемещаться между микробными клетками -конъюгативные плазмиды и транспозоны, в которых происходит сборка и сортировка генов антибиотикорезистентности.
2. перемещаться в микробной клетке в пределах хромосомы, а также между хромосомой и плазмидой (транспозоны, генные кассеты, интегроны и др.).
МГЭ присутствовали в микробных клетках еще до внедрения антибиотиков в клиническую практику, о чем свидетельствует выделенный до 1937 г. штамм Е. coli, содержащий R-плазмиду, детерминирующую устойчивость к тетрациклину и стрептомицину (Smith D.H., 1967).
Транспозоны (Тп) - МГЭ, содержащие структурные гены, кодирующие определенные признаки, например, гены устойчивости к антимикробным препаратам, которые отличаются по структуре, происхождению и механизмам транспозиции. Описаны 2 типа транспозонов (Salyers A., Abile-Cuevas C.F., 1997):
1) Композитные транспозоны (composite transposons) - их концевые участки фланкированы парой IS-последовательностей, которые обеспечивают процесс транспозиции, и между которыми располагается структурный ген, кодирующий определенные свойства бактерии;
2) Комплексные транспозоны (complex transposons) - в их структуре отсутствует четкое расположение структурных и регуляторных генов, и они характеризуются высокой частотой транспозиции.
На частоту транспозиции оказывают влияния изменения в окружающей среде. Установлено, что частота транспозиции транспозона Тп501 значительно выше в присутствии в среде ртути, а транспозона Тп551 - в присутствии эритромицина (Kholodii G. et al., 2000).
Интегроны и генные кассеты. Интегроны являются генными системами, которые, в отличие от транспозонов, распространяются по геному бактерии, используя сайт-специфическую рекомбинацию с использованием фермента интегразы и генных кассет (Ильина Т.С, 2006; Damn R.S. et al., 2002; Katayama Y., Ito Т., Hiramatsu K., 2000; Recchia G.D., Hall R.M., 1995). Генная кассета представляет собой короткую последовательность ДНК, которая соответствует определенному гену, которая при перемещении в пределах интегрона существует в виде короткой автономной нереплицирующейся кольцевой молекулы ДНК (Bennett P.M., 1999). В составе интегронов клинически значимых бактерий может входить порядка пяти генных кассет (Nordmann P., Poirel L., 2002).
Интегроны могут локализоваться на плазмидах или нуклеоиде. Они могут захватываться бактериями из окружающей среды, а затем встраиваться в состав их носителей генетической информации. Интегроны не только обеспечивают горизонтальный перенос генов, но и способны захватывать фрагменты чужеродной ДНК (Krauland M.G. et al., 2009). В состав интегронов помимо генов лекарственной устойчивости могут входить гены, детерминирующие факторы вирулентности, метаболической активности и др. (Ильина Т.С., 2001).
Генные кассеты бактерий различных видов одного рода в составе интегрона могут отличаться (Смирнов Г.Б., 2008). В литературе описаны более 70 различных вариантов генных кассет, которые несут гены устойчивости к наиболее популярным в медицинской и ветеринарной практике антибиотикам -р-лактамам, аминогликозидам, амфениколам, макролидам и т.д.
В составе генных кассет некоторых бактерий обнаружены гены, кодирующие металло-бета-лактамазы, которые детерминируют устойчивость к современным карбапенемам - имипинему и меропинему (Bennett P.M., 2008).
Инсерционные криптические последовательности (ISCR-elements, IS-cryptic sequences) представляют собой участки ДНК сходные по размеру с IS-последовательностями, однако они отличаются особым механизмом транспозиции, которая получила название транспозиции катящегося кольца (rolling circle transposition), а также отсутствием концевых терминальных повторов (Miller R.M. et al., 2014; Garcillian-Bracia M.P., de-la Cms F., 2002; Tavakoli N. et al., 2000). Для ISCR-последовательностей характерно то, что процесс репликации для них является неточным, поскольку в данный процесс может вовлекаться ДНК бактерии, находящаяся за пределами этих последовательностей, поэтому объем генетического материала может в несколько раз превышать ISCR-последовательность (Tavakoli N. et al., 2000, Toleman M.A., Bennett P.M., Walsh Т., 2006).
Основной механизм формирования приобретенной лекарственной устойчивости связан с передачей R-плазмид (от англ. resistance -устойчивость), которые представляют собой автономные генетические элементы, в состав которых входят гены, детерминирующие устойчивость к одному или нескольким антибиотикам (Зверев В.В., 2010). В микробной клетке R-плазмида может существовать в конъюгативной и неконъюгативной формах.
Оценка антимикробной активности гетероциклических соединений различных классов
С целью поиска новых эффективных антимикробных препаратов была проведена оценка спектра антимикробного действия 120 новых синтетических гетероциклических соединений, относящихся к двадцати различным классам.
Оценку антимикробной активности гетероциклов проводили в отношении стандартных штаммов условно-патогенных микроорганизмов E.coli 113-13, S aureus 209 P, Bcereus 8035 и С albicans 18, результаты которой представлены в таблице 7.
Полученные результаты позволили установить, что гетероциклические соединения ряда конденсированных замещенных диазобицикло-нондиенов, пиридинов, дигидропиридинов, кетонов, оксимов, пиранов и тиопиранов не обладали антимикробным действием в отношении исследуемых микроорганизмов.
Из всех представителей ряда кумаринов только соединение с лабораторным шифром КМ-3 характеризовалось антимикробным действием в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибов С albicans. Наибольшую чувствительность к данному соединению проявили грамположительные бактерии - Saureus 209 Р и B.cereus 8035, для которых показатели МІЖ составляли 12,5 мкг/мл, для стандартного штамма E.coli 113 108 13 данный показатель был в 2 раза выше. Клетки стандартного штамма С albicans 18 были наиболее устойчивы к соединению КМ-3, что проявилось в высоких значениях МІЖ (100 мкг/мл).
Гетероциклические соединения ряда тетрагидротриазолохиназолина не обладали антибактериальным действием в отношении исследованных штаммов, и только одно соединение с лабораторным шифром ТГТ-1 проявляло антимикотическую активность при высоких значениях МІЖ.
Все соединений ряда гидроиндазолов обладали широким спектром антимикробной активности при высоких значениях МІЖ. Выявлена устойчивость клеток стандартного штамма Е.coli 113-13 действию соединений с лабораторным шифром ГИД-7, ГИД-57 и ГИД-58. Наибольшая чувствительность к гетероциклам данного класса установлена у грамположительных бактерий. Для стандартного штамма S. aureus 209 Р наиболее эффективными оказались соединения ГИД-10 и ГИД-58, а для Bcereus 8035 - ГИД-13 и ГИД-14, а их показатели МІЖ были равны 25 мкг/мл. Из всех представленных соединений наибольшая антимикотическая активность была выявлена для соединения ГИД-10, показатели МІЖ которого для С albicans 18 составила 25 мкг/мл. Четыре представителя гидроиндазолов (ГИД-13, ГИД-14, ГИД-27 и ГИД-57) противогрибковой активностью не обладали, а для остальных представителей этой группы соединений значения МІЖ составляли от 50 до 100 мкг/мл.
Ни у одного из девяти исследованных соединений ряда гидроксициклогексанонов не установлена антимикотическая активность. Наибольшей антибактериальной активностью обладали соединения с лабораторными шифрами ГЦГ-2, ГЦГ-4 и ГЦГ-41, для которых значения МІЖ в отношении исследуемых бактерий составляли от 25 до 100 мкг/мл. Наибольшую чувствительность к данной группе соединений проявили клетки стандартного штамма S aureus 209 P.
Из десяти соединений ряда циклогексенонов антибактериальная активность в отношении стандартных штаммов E.coli 113-13 и Saureus 209Р отмечена для соединения с лабораторным шифром ЦГ-11, а в отношении штаммов Saureus 209 P и Bcereus 8035 - ГЦ-22, однако показатели МІЖ были высокими и составили 100 мкг/мл. Антимикотическая активность установлена для соединений лабораторными шифрами ЦГ-15, ЦГ-16 и ЦГ-53, однако значения МІЖ также были высокими.
Полученные результаты согласуются с данными, представленными в работах ряда авторов (Пантюхин А.А. с соавт., 2012; Шаповал О.Г. с соавт., 2006; Голиков А.Г. с соавт., 2005; Райкова СВ. с соавт., 2004, 2005;), в которых приведены данные по антимикробному спектру синтетических соединений ряда гидроксициклогексанонов, циклогексенонов и гидроиндазолов.
Оценка спектра антимикробного действия комплекса меди с органическими лигандами показала его высокую активность в отношении стандартных штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий, причем, в отличие от предыдущих групп гетероциклических соединений, значения МІЖ были низкими и составили 6,25 мкг/мл и 12,5 мкг/мл соответственно. Антимикотическую активность данное соединение проявляло при значении МІЖ 25 мкг/мл.
Полученные результаты согласуются материалами, приведенными в работах (Самофалов А.С. с соавт., 2013; Каштанова Е.В. с соавт., 2006; Бурачева С.А. с соавт., 2005), в которых показана антимикробная активность комплексов органических соединений и металлов, содержащих в своем составе медь.
Оценка антимикробных свойств соединения с лабораторным шифром ХЦС, относящегося к селеноорганическим гетероциклическим соединениям показало его эффективность в отношении исследуемых микроорганизмов. Наибольшую чувствительность к нему проявили стандартные штаммы грамположительных бактерий, особенно выраженная у штамма В. cereus 8035. Антимикотическая активность данного соединения была достаточно низкой, что выражалось в высоких значениях МІЖ.
Полученные результаты согласуются с данными, представленными в работах ряда авторов (Бородулин Я.В., 2013; Русецкая Н.Ю. с соавт., 2011; Лыкова Л.И., Барабанова А.В., Федотов И.В., 2003), в которых показан широкий спектр антимикробной активности селеноорганических соединений в отношении стандартных и клинических штаммов условно-патогенных бактерий.
Талийорганические соединения проявили низкий уровень антимикробной активности. Антибактериальная активность установлена для соединений с лабораторными шифрами ЗГ и 6Г, причем соединение ЗГ было эффективно только в отношении стандартных штаммов S.aureus 209 P и Bcereus 8035, однако показатели МІЖ были высокими. К соединению 6Г наибольшую чувствительность проявили клетки Bcereus 8035, а для S aureus 209 P значения МІЖ были в 2 раза выше, в отношении E.coli 113-13 данное соединение было активно только в высоких концентрациях. Антимикотическая активность была установлена для пяти представителей талийорганических соединений - 2Г, ЗГ, 4Г, 9Г и ИГ, однако значения МІЖ были достаточно высокими.
Соединение с лабораторным шифром ПНВ-1 ряда фенилпентендиона проявило высокую антибактериальную активность, причем по показателям МІЖ наиболее чувствительными к нему оказались клетки стандартного Е. coli 113-13, хотя в отношении грамположительных бактерий значения МІЖ также были низкими. Препарат с лабораторным шифром ПНВ-Б проявил антимикробной действие только в отношении стандартного штамма Saureus 209 P, однако значения МІЖ были высокими. Для гетероциклических соединений ряда фенилпентендиона антимикотическая активность не установлена.
Полученные результаты согласуются с данными, представленными в исследованиях ряда авторов (Пчелинцева Н.В., 1998; Пчелинцева Н.В., Федотова О.В., Колеватова Я.Г., 2007), в которых показана антимикробная активность структурных аналогов соединений ряда фенилпентендиона.
Соединения XA-44 и XA-47 ряда халконов обладали антистафилококковым действием, причем значения МІЖ для стандартного штамма Saureus 209 Р составили 1,6 мкг/мл. В отношении остальных исследованных штаммов микроорганизмов представители данной группы соединений антимикробную активность не проявили. Данные, полученные нами, согласуются с результатами исследований, приведенных в работах (Оганесян Э.Т., Тускаев В.А., Муцуева С.Х., 2002; Konieczny М.Т. et al., 2007; Nowakowska Z., 2007), где показано, что соединения ряда халкона характеризуются выраженным антимикробным действием не только в отношении различных групп микроорганизмов, но и опухолевых клеток.
Соединения ПЭ-46, ПЭ-45 и ПЭ-49 ряда полифункционально-замещенных эфиров характеризовались высокой антистафилококковой активностью при низких значениях МІЖ. В отношении стандартных штаммов Ecoli 113-13, Bcereus 8035 и С albicans 18 для данной группы соединений антимикробная активность не установлена.
Изучение ранозаживляющих свойств структур на основе наноагрегатов флавоноидов, стабилизированных полимерным соединением, на моделях неосложненных и осложненных полнослойных гнойных ран
Оценку регенеративной способности наноагрегатов флавоноидов и структур «ядро-оболочка» на их основе проводили на модели экспериментальных неосложненных полнослойных ран у белых лабораторных мышей. Экспериментальные животные были разделены на 3 группы:
1 - опытная группа - раны обрабатывали препаратом, содержащим структуры «ядро-оболочка» ПААГ-М;
2 - контрольная группа 1 - раны обработке не подвергали;
3 - контрольная группа 2 - раны обрабатывали нестабилизированными наноагрегатами флавоноидов.
Регенеративную способность исследуемых препаратов проводили по ежесуточному уменьшению площади полнослойных ран.
Было выявлено, что обработка ран опытной группы животных наноагрегатами флавоноидов, стабилизированных ПААГ-М, способствовала статистически достоверному уменьшению их площади, начиная со вторых суток эксперимента, а их полное заживление происходило на 8 сутки от начала обработки (рисунок 37). Полное заживление ран в 1 контрольной группе лабораторных мышей происходило на 14 сутки, в во 2 контрольной группе - на 11 сутки от начала обработки.
Исходная площадь экспериментальных ран составляла 78±0,5 мм2. В опытной группе животных на 3-й сутки от начала лечения отмечалась гиперемия краев раны, однако площадь значительно сокращалась и составила 52,8±1,8 м2 , по сравнению с ранами 1-ой и 2-ой контрольных групп животных, площадь которых составила 70,4±2,6 мм2 и 63,8±3,4 мм2 соответственно (рисунок 38). Края раны контрольных групп животных были гиперемированы и отечны. У двух животных из 1-ой контрольной группы наблюдались незначительные участки нагноения подкожно-жировой клетчатки.
На 5-е сутки от начала лечения края ран опытной группы животных подвергались эпителизации, происходило значительное сокращение площади раневой поверхности (26,4±3,6 мм ). В центре раны появлялся небольшой струп, гиперемия краев раны исчезала. Раны мышей 1-ой контрольной группы сохраняли интенсивную отечность краев и гиперемию близлежащих участков; рана была покрыта струпом, под которым обнаруживались небольшие участки нагноения. У мышей 2-ой контрольной группы раны были покрыты тонким струпом, участки нагноения подкожно-жировой клетчатки отсутствовали. В контрольных группах животных также наблюдалось сокращение площади ран, однако скорость регенерации была значительно ниже, чем в опытной группе животных (58,5±4,7 и 42,4±2,8 мм2 соответственно).
На 8-е сутки от начала обработки в опытной группе мышей происходила полная эпителизация ран, а их гиперемия, отек и нагноение ран отсутствовали. В 1-ой контрольной группе мышей наблюдалось уменьшение участков нагноения, края ран были гиперемированы, отечны, в центре раны сосредоточены элементы струпа, площадь раны сокращалась до 32,6±4,2 мм2.
Края ран 2-ой контрольной группы мышей утрачивали отечность, были покрыты сухим струпом, наблюдалось значительное сокращение их площади до24,8±1,8мм2.
На 11-е сутки от начала лечения на поверхности раневых дефектов 2-ой контрольной группы мышей появлялся нежный рубец, и происходило полное заживление ран. Площадь раневой поверхности 1-ой контрольной группы мышей сокращалась до 18,8±2,5 мм2, раны были покрыты струпом, участки нагноения исчезали, края ран сохраняли незначительную гиперемию. Полное заживление ран в 1-ой контрольной группе мышей наблюдалось на 14 сутки от начала лечения с образованием рубца.
Таким образом, было установлено, что обработка ран препаратами, содержащих наноагрегаты флавоноидов, способствовала увеличению скорости их заживления: стабилизированные ПААГ-М наноагрегаты флавоноидов сокращали сроки заживления ран в 1,75 раза, а нестабилизированные нанаоагрегаты флавоноидов - в 1,27 раза по сравнению с контролем (% =19,53, W=0,89, Z=2,8 при р 0,05). Наличие в составе препарата полимера, характеризующегося широким спектром антимикробной активности, препятствовала развитию гнойных осложнений, вызванных представителями нормальной микрофлоры. Наноагрегаты флавоноидов, вероятно, стимулировали регенерацию за счет усиления барьерно-защитную функцию кожи.
На следующем этапе работы было изучено влияние препаратов, содержащих наноагрегаты флавоноидов, на течение раневого процесса при формировании экспериментальных полнослойных гнойных ран (Григорьян А.Ю. ссоавт.,2011).
Исследования проводили на белых беспородных крысах, которые были разделены на 4 группы по 10 животных в каждой:
- группа № 1 (контроль 1) - раны не обрабатывали;
- группа № 2 (контроль 2) - раны обрабатывали 0,5%-ным раствором хлоргексидина;
- группа № 3 - раны обрабатывали препаратом, содержащем наноагрегаты флавоноидов;
- группа № 4 - раны обрабатывали препаратом, содержащим наноагрегаты флавоноидов, стабилизированные ПААГ-М.
Через двое суток после проведения операции все животные, взятые в эксперимент, были живы. Скорость изменения площади экспериментальных полнослойных гнойных ран представлена на рисунке 39.
Площадь экспериментальных ран составляла 225±0,8 мм . Исходно экспериментальные гнойные раны характеризовались интенсивной гиперемией краев и инфильтрацией прилежащих тканей, наблюдалось обильное гнойное отделяемое, на дне раны отмечались участки некроза и налет фибрина (рисунок 40).
На 3-й сутки после начала обработки значительных изменений в развитии раневого процесса не наблюдалось. По периферии ран опытных и контрольных групп животных отмечалось появление участков грануляции, поверхность раневого дефекта была покрыта фибрином. Сокращение площади ран было незначительным с наибольшей динамикой в опытной группе № 4: в группе № 1 площадь раны составляла 202,4±8,2 мм , в группе № 2 - 189,6±12,4 м2 , в группе № 3 - 178,2±6,2 мм2, а в группе № 4 - 164,24±8,3 мм2.
Оценка влияния сочетанного действия антибиотиков и полиазолидинаммония, модифицированного гидрат-ионами йода, на выживаемость стандартных и клинических штаммов условно-патогенных бактерий
Одним из эффективных направлений преодоления антибиотикорезистентности клинических штаммов-возбудителей инфекционных заболеваний является модификация антимикробных препаратов полимерными соединениями. Создание комбинаций антибиотиков и химиотерапевтических препаратов с другими биологически активных соединениями (Ананьева Е.П., Караваева А.В., Соловский М.В., 2014; Соловский М.В., Борисенко М.С., Смирнова М.Ю., 2011; Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф., 2000; Kaneko Y. et al., 2013). Поэтому представляло интерес провести оценку эффективности антимикробного действия антибиотиков, а также их композиционных смесей с полимерным соединением ПААГ-М в отношении стандартных и клинических штаммов условно-патогенных бактерий.
Для того чтобы исключить антимикробное воздействие полимера на микробные клетки в исследованиях использовали его сублетальную концентрацию (Ул МІЖ). Комплексообразование полимера с антибиотиками проводили в стерильной дистиллированной воде при массовом соотношении антибиотик/ПААГ-М равном 1 -5.
Для проведения исследования получали последовательные двукратные разведения исследуемых препаратов в лунках полистирольных иммунологических планшетов в объеме 100 мкл в физиологическом растворе. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл взвеси суточных культур исследуемых штаммов бактерий в концентрации 1 109 КОЕ/мл. После инкубирования в термостате при температуре 37 С в течение 24 часов проводили измерение оптической плотности при длине волны 420 нм на спектрофотометре для микропланшетов Epoch (Биотек, США). Контролем служили лунки, заполненные физиологическим раствором, оптическая плотность которого составляла 0,039±0,002.
Было установлено, что наибольшей антимикробной активностью в отношении как стандартного, так и клинического штаммов S. aureus согласно показателям оптической плотности характеризовались концентрации кларитромицина 1000 и 500 мкг/мл (рисунок 50). Более низкие концентрации антибиотика обладали меньшей эффективностью в отношении клеток золотистого стафилококка, поскольку показатели оптической плотности превышали контрольные значения в 6,28-7,02 раза.
Комплекс кларитромицина и ПААГ-М проявлял большую антимикробную активность в отношении стандартного и клинического штамма S. aureus, поскольку показатели оптической плотности всех разведений опытных образцов препаратов не значительно отличались от контрольных значений в 1,17-1,87 раза.
При оценке действия амикацина на клетки стандартного штамма P. aeruginosa АТСС 27853 установлено, что наибольшая чувствительность исследуемого микроорганизма наблюдалась в диапазоне концентраций антибиотика от 1000 до 64 мкг/мл (рисунок 51).Однако даже минимальное рабочее разведение препарата не вызывало абсолютного ингибирования бактерий, поскольку значения оптической плотности достоверно превышали контрольные значения в 1,28 раза, при действии антибиотика в концентрациях от 500 до 64 мкг/мл оптическая плотность в лунках иммунологических планшетов была выше в 1,9-2,28 раза по сравнению с контролем. Снижение концентрации антибиотика от 32 до 1 мкг/мл приводило к снижению эффективности его действия, что выражалось в увеличении оптической плотности при культивировании стандартного штамма P. aeruginosa в 3,26-5,03 раза по сравнению с контролем.
Аналогичные результаты были отмечены при действии амикацина на клетки клинического штамма P. aeruginosa № 26: в диапазоне концентраций препарата от 1000 до 64 мкг/мл наблюдалось увеличение оптической плотности в лунках иммунологического планшета в 1,41-2,36 раза, а концентрации от 191 до 1 мкг/мл способствовали увеличению оптической плотности в 3,54-4,69 раза по сравнению с контрольными значениями.
Композиционная смесь амикацина и сублетальной концентрации ПААГ-М была более эффективна в отношении исследуемых штаммов P. aeruginosa. Большая чувствительность к комплексу препаратов была отмечена для стандартного штамма P. aeruginosa АТСС 27853, поскольку показатели оптической плотности при действии разведений препаратов от 1000 до 8 мкг/мл достоверно не отличались от контрольных значений. Действий концентраций композиционной смеси от 4 до 1 мкг/мл вызывало увеличение оптической плотности в 1,44-1,67 раза по сравнению с контролем.
Клинический штамм P. aeruginosa № 26 проявил меньшую чувствительность к действию комплекса амикацина и ПААГ-М, поскольку показатели оптической плотности достоверно не отличались от контрольных значений только при действии концентраций препаратов 1000 и 500 мкг/мл. При воздействии концентраций от 250 до 8 мкг/мл отмечалось незначительное увеличение оптической плотности в лунках в 1,44-1,72 раза, а снижение концентраций препаратов от 4 до 1 мкг/мл приводило к увеличению оптической плотности в 2,35-2,54 раза по сравнению с контролем.
Оценка действия цефепима в отношении стандартного штамма S. aureus АТСС 25923 позволила установить его эффективные антимикробные концентрации от 1000 до 64 мкг/мл, при действии которых показатели оптической плотности отличались от контрольных значений в 1,31-1,48 раза (рисунок 52). Снижение концентрации антибиотика от 32 до 2 мкг/мл приводило к значительному росту оптической плотности, значения которой превышали контрольные в 3,77-4,21 раза.
Комплекс цефепима и полимерного соединения ПААГ-М оказывал выраженное ингибирующее действие в отношении как стандартного, так и клинического штаммов S. aureus, поскольку воздействие всех исследуемых рабочих разведений препаратов приводило к эффективному снижению оптической плотности в лунках планшетов, причем показатели достоверно не отличались от контрольных значений.
Оценка действия цефепима на клетки исследуемых штаммов P. aeruginosa показала их низкую чувствительность к данному препарату по сравнению с грамположительными бактериями (рисунок 53). Так значения оптической плотности при культивировании стандартного штамма P. aeruginosa АТСС 27853 были высокими при использовании всех рабочих разведений антибиотика от 1000 до 2 мкг/мл и превышали контрольные значения в 3,49-8,26 раза. Аналогичные результаты были получены и для клинического штамма P. aeruginosa № 26: показатели оптической плотности при действии рабочих разведений были выше контрольных значений в 3,9-9,03 раза.
Композиционная смесь цефепима и сублетальной концентрации ПААГ-М оказывала выраженное антибактериальное действие в отношении стандартного и клинического штамма P. aeruginosa, что проявлялось в достоверном снижении оптической плотности по сравнению с действием немодифицированного антибиотика. Показатели оптической плотности при действии комплекса препаратов вне зависимости от штамма P. aeruginosa были низкими и либо достоверно не отличались от контрольных значений, либо незначительно превышали их в 1,18-1,46 раза.
Полученные результаты согласуются с данными представленными в работах Ананьевой Е.П., Караваевой А.В., Соловского М.В., 2014, Соловского М.В., Борисенко М.С., Смирновой М.Ю., 2011; Афиногенова Г.Е., Панарина Е.Ф., 2000; Kaneko Y. et al., 2013, в которых показана большая эффективность антибиотиков, модифицированных различными полимерными соединениями, что выражалось в снижении показателей МІЖ в 2-3 раза, а также снижение их токсического действия.
Поскольку полимерное соединение ПААГ-М относится к группе катионных поверхностно-активных веществ, то для него мишенями в клетке являются карбоксильные группы аминокислот и кислых полисахаридов бактерий. Вероятно, неполярная часть молекулы ПААГ-М, погружаясь в гидрофобную часть мембраны, разрыхляет ее и приводит к повышению проницаемости для крупных молекул антибиотиков и обеспечивает их эффективное взаимодействие с соответствующими мишенями.
Таким образом, полученные результаты позволяют рассматривать возможность разработки комплексов антибиотиков с ПААГ-М для повышения их эффективности и доступности в борьбе с распространением антибиотикорезистентных возбудителей инфекционных заболеваний.