Содержание к диссертации
Введение
1 Методы коррекции климактерических расстройств (обзор литературы) 16
1.1 Климактерический синдром 16
1.2 Заместительная гормональная терапия 22
1.3 Альтернативные методы коррекции климактерических расстройств 30
1.3.1 Характеристика растений, содержащих фитоэстрогены классов изофлавонов и лигнанов 33
1.3.2 Спектр фармакологической активности фитоэстрогенов 40
2 Материал и методы исследования 50
3 Результаты собственных исследований 64
3.1 Эффекты этинилэстрадиола и экстракта цимицифуги у крыс
после овариоэктомии 64
3.1.1 Антиклимактерические эффекты этинилэстрадиола и экстракта цимицифуги у крыс после овариоэктомии 64
3.1.1.1 Влияние этинилэстрадиола и экстракта цимицифуги на экспериментальные эквиваленты «приливов» у крыс после овариоэктомии 65
3.1.1.2 Влияние этинилэстрадиола и экстракта цимицифуги на психоэмоциональные и двигательные реакции крыс после овариоэктомии 66
3.1.2 Влияние этинилэстрадиола на гормональный статус и гемореологические показатели у крыс после овариоэктомии 69
3.1.3 Влияние этинилэстрадиола на процессы перекисного окисления липидов и липидный состав мембран эритроцитов у крыс после овариоэктомии 76
3.1.4 Влияние этинилэстрадиола на формирование внутрисосудистого тромба и функциональное состояние
эндотелия у крыс после овариоэктомии 82
3.1.4.1 Влияние этинилэстрадиола на формирование тромба у крыс после овариоэктомии 82
3.1.4.2 Влияние этинилэстрадиола на антиагрегантную активность сосудистой стенки у крыс после овариоэктомии 83
3.1.4.3 Влияние этинилэстрадиола на сосудорасширяющую функцию эндотелия у крыс после овариоэктомии 85
3.1.4.4 Влияние этинилэстрадиола на уровень нитритов в сыворотке крови у крыс после овариоэктомии 86
3.1.5 Влияние этинилэстрадиола на показатели системы гемостаза у крыс после овариоэктомии 88
3.2 Эффекты экстракта маакии амурской у крыс после овариоэктомии 91
3.2.1 Антиклимактерические эффекты экстракта маакии амурской у крыс после овариоэктомии 91
3.2.1.1 Влияние экстракта маакии амурской на экспериментальные эквиваленты «приливов» у крыс после овариэктомии 91
3.2.1.2 Влияние экстракта маакии амурской на психоэмоциональные и двигательные реакции у крыс после овариоэктомии 92
3.2.1.3 Влияние экстракта маакии амурской на процессы остеопороза у крыс после овариоэктомии 94
3.2.2 Антиагрегантная и гемореологическая активность суммарного экстракта маакии амурской и его отдельных фракций в условиях модели гипервязкости крови in vitro 96
3.2.3 Влияние экстракта маакии амурской на гормональный статус и
гемореологические показатели у крыс после овариоэктомии 104
3.2.4 Влияние экстракта маакии амурской на процессы перекисного окисления липидов и липидный состав мембран эритроцитов у
крыс после овариоэктомии 109
3.2.5 Влияние экстракта маакии амурcкой на формирование внутрисосудистого тромба и функциональное состояние эндотелия у крыс после овариоэктомии 115
3.2.5.1 Влияние экстракта маакии амурcкой на формирование тромба у крыс после овариоэктомии 115
3.2.5.2 Влияние экстракта маакии амурcкой на антиагрегантную активность сосудистой стенки у крыс после овариоэктомии 116
3.2.5.3 Влияние экстракта маакии амурской на сосудорасширяющую активность эндотелия у крыс после овариоэктомии 117
3.2.5.4 Влияние экстракта маакии амурcкой на уровень нитритов в сыворотке крови у крыс после овариоэктомии 118
3.2.6 Влияние экстракта маакии амурской на показатели системы гемостаза у крыс после овариоэктомии 120
3.3 Эффекты композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного у крыс после овариоэктомии 122
3.3.1 Антиклимактерические эффекты композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного у крыс после овариоэктомии 122
3.3.1.1 Влияние композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного на экспериментальные эквиваленты «приливов» у крыс после овариэктомии 122
3.3.1.2 Влияние композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного на психоэмоциональные и двигательные реакции у крыс после овариоэктомии 123
3.3.2 Антиагрегантная и гемореологическая активность композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного в условиях модели гипервязкости крови in vitro 126
3.3.3 Влияние композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного на гормональный статус и гемореологические показатели у крыс после овариоэктомии 129
3.3.4 Влияние композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного на процессы перекисного окисления липидов в плазме крови у крыс после овариоэктомии 134
3.3.5 Влияние композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного на формирование внутрисосудистого тромба и функциональное состояние эндотелия у крыс после овариоэктомии 136
3.3.5.1 Влияние композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного на формирование тромба у крыс после овариоэктомии 136
3.3.5.2 Влияние композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного на антиагрегантную активность сосудистой стенки у крыс после овариоэктомии 137
3.3.5.3 Влияние композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного на сосудорасширяющую активность эндотелия у крыс после овариоэктомии 138
3.3.6 Влияние композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного на показатели системы гемостаза у крыс после
овариоэктомии 140
3.4 Эффекты экстракта семян льна у крыс после овариоэктомии 142
3.4.1 Антиклимактерические эффекты экстракта семян льна у крыс
после овариоэктомии 142
3.4.1.1 Влияние экстракта семян льна на экспериментальные эквиваленты «приливов» у крыс после овариэктомии 142
3.4.1.2 Влияние экстракта семян льна на психоэмоциональные и двигательные реакции у крыс после овариоэктомии 143
3.4.1.3 Влияние экстракта семян льна на процессы остеопороза у крыс после овариоэктомии 145
3.4.2 Антиагрегантная и гемореологическая активность экстракта семян льна в условиях модели гипервязкости крови in vitro 147
3.4.3 Влияние экстракта семян льна на гормональный статус и гемореологические показатели у крыс после овариоэктомии 150
3.4.4 Влияние экстракта семян льна на процессы перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов у крыс после овариоэктомии 155
3.4.5 Влияние экстракта семян льна на формирование внутрисосудистого тромба и функциональное состояние эндотелия у крыс после овариоэктомии 157
3.4.5.1 Влияние экстракта семян льна на формирование тромба у крыс после овариоэктомии 157
3.4.5.2 Влияние экстракта семян льна на антиагрегантную активность сосудистой стенки у крыс после овариоэктомии 158
3.4.5.3 Влияние экстракта семян льна на сосудорасширяющую активность эндотелия у крыс после овариоэктомии 159
3.4.6 Влияние экстракта семян льна на показатели системы гемостаза у крыс после овариоэктомии 160
Заключение 162
Выводы 186
Список сокращений 188
Список использованной литературы 190
- Характеристика растений, содержащих фитоэстрогены классов изофлавонов и лигнанов
- Влияние этинилэстрадиола и экстракта цимицифуги на экспериментальные эквиваленты «приливов» у крыс после овариоэктомии
- Влияние этинилэстрадиола на показатели системы гемостаза у крыс после овариоэктомии
- Влияние композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного на формирование тромба у крыс после овариоэктомии
Введение к работе
Актуальность темы исследования. За последние 30 лет доля населения в возрасте 60 лет и старше возросла с 11 до 15% и к настоящему времени 70% женщин переступают порог менопаузы, а 55% - достигают возраста 75 лет [Минеев В.Н., 2005]. По прогнозам ВОЗ к 2015 г. 46% женщин окажется в возрасте старше 45 лет. Современные женщины проживают треть своей жизни в периоды пери- и постменопаузы, сопровождающиеся существенным изменением гормонального статуса, связанным с прекращением функции яичников [Сметник В.П., 2007]. Проблема сохранения здоровья женщин 45-65 лет актуальна и для России в XXI веке, где данная возрастная группа составляет почти одну пятую часть населения (29,6 млн.) [Аккер Л.В. и др., 2004]. Климактерический период является физиологическим процессом возрастной инволюции организма, однако у большинства женщин возникает патологический симптомокомплекс - климактерический синдром, наличие которого существенно снижает качество жизни. При климактерическом синдроме кроме вегетативных и психоэмоциональных нарушений отмечен значительный рост сердечно-сосудистых заболеваний, в патогенезе которых важную роль играют нарушения реологических свойств крови, гемостаза, липидного обмена и эндотелиальная дисфункция [Тихомиров А.Л., 2007; Сметник В.П. и др., 2007; Okeke Т.С. et al, 2013; Papadopoulou S.A. et al, 2013]. В связи с этим не вызывает сомнения значимость адекватного лечения климактерических проблем, возникающих в постменопаузальный период более, чем у 70% женщин [Сметник В.П. и др., 2007; Тихомиров А.Л., 2007].
Патогенетическим методом коррекции климактерических нарушений является гормональная заместительная терапия (ГЗТ). В настоящее время ГЗТ назначают пациенткам для купирования менопаузальных симптомов, урогенитальных нарушений, для профилактики потери массы костной ткани, колоректального рака, развития метаболических и других расстройств, возникающих при климактерическом синдроме [Thielemann A. et al, 2010; Kapur P. et al., 2010]. Однако многими авторами установлено, что при длительном применении ГЗТ у женщин с эстрогенной недостаточностью повышается риск развития венозных тромбозов, ИБС, инсультов, а также рака молочной железы [Vickers M.R. et al, 2007; Canonico M. et al, 2009; Canonico M. et al, 2011]. Следовательно, эффективность ГЗТ при климактерическом синдроме сочетается с относительно высоким риском развития серьезных побочных эффектов. На успех применения гормональной терапии можно рассчитывать у пациенток с хирургической менопаузой и в ранние сроки естественной менопаузы, тогда как у пожилых женщин с преморбидными состояниями преобладают отрицательные эффекты ГЗТ [Rosano G.M. et al, 2006; Сметник В.П. и др., 2007]. Учитывая вышесказанное, предпринимаются попытки найти адекватную замену ГЗТ таким образом чтобы, сохранив позитивные эффекты гормональной терапии свести к минимуму ее серьезные побочные эффекты. С этих позиций несомненный интерес представляют фитопрепараты, обладающие эстрогеноподобной активностью. Развитие данного направления в настоящее
время может быть успешным в связи со значительным повышением качества фитопрепаратов, что обусловлено совершенствованием технологии их получения и стандартизации, возможностью выделения индивидуальных действующих веществ [Ледина А.В., Прилепская В.П., 2012]. Следовательно, перспективным направлением поиска альтернативных гормональной терапии методов коррекции климактерических расстройств представляется исследование фитоэстрогенных препаратов различных химических классов, в частности, изофлавоноидов и лигнанов. Фитоэстрогены структурно близки 17р-эстрадиолу, что позволяет им связываться с эстрогеновыми рецепторами и воспроизводить эффекты естественных гормонов [Zhang E.J. et al, 2007; Vitale D.C. et al., 2012]. Вместе с тем, изофлавоноиды и лигнаны, обладая большим аффинитетом к Р-эстрогеновым рецепторам, могут обладать определенной тканеспецифичностью [Djioque S. et al., 2010; Vitale D.C. et al, 2012], что позволяет надеяться на разделение нежелательных пролиферативных эффектов в системе репродукции и терапевтического воздействия на другие эстрогенчувствительные ткани и органы.
Кроме того, фитоэстрогены обладают выраженными антиоксидантными свойствами, способны ингибировать активность ряда ферментов, обеспечивая противоопухолевый эффект в отношении гормонозависимых новообразований [Ding W., Liu Y., 2011; Mestre-Alfaro A. et al, 2011].
Совокупность биологических эффектов фитоэстрогенов позволяет предположить, что эти вещества могут быть реальной альтернативой ГЗТ в условиях эстрогенной недостаточности. Несмотря на высокую потребность, фитоэстрогенные препараты на фармацевтическом рынке представлены весьма скромно. Отечественных лекарственных средств, обладающих фитоэстрогенной активностью, нет. Для профилактики и лечения климактерических расстройств разработаны лекарственные средства из корней и корневищ цимицифуги (Cimicifuga racemosa L.) (Bionorica AG, Германия). Эффективность препаратов цимицифуги в качестве негормональных антиклимактерических средств делает перспективным поиск фитоэстрогенных препаратов, относящихся к двум основным классам - изофлавонов и лигнанов.
Высокое содержание изофлавоноидов в экстрактах маакии амурской (ЭМА), люцерны посевной и клевера красного (ЭЛиК), а также лигнана -секоизоларицирезинола диглюкозида в экстракте семян льна (ЭСЛ), явилось основанием для изучения указанных экстрактов в качестве фитоэстрогенов при экспериментальной овариоэктомии.
Степень разработанности. В плане изучения альтернативных гормональной заместительной терапии методов коррекции климактерического синдрома особое внимание уделяется фитопрепаратам, обладающим эстрогеноподобным действием. Однако в качестве негормональных антиклимактерических средств используют только препараты из корней и корневищ цимицифуги и в основном для коррекции вазомоторных и психоэмоциональных нарушений. Фитопрепаратов для профилактики и лечения сердечно-сосудистых осложнений климактерического синдрома нет. Фитоэстрогены классов изофлавонов и лигнанов обладают структурным
сходством с 17р-эстрадиолом, выраженными антиоксидантными свойствами, противоопухолевым эффектом, но практически неисследованным остается их влияние на такие факторы, повышающие риск возникновения сердечнососудистых осложнений при гипоэстрогенемии, как эндотелиальная дисфункция, нарушения реологических свойств крови и системы гесостаза.
Цель исследования. Изыскание новых фитоэстрогенных средств классов изофлавонов и лигнанов, изучение их антиклимактерического действия и влияния на сердечно-сосудистые нарушения при экспериментальной овариоэктомии.
Задачи исследования.
-
Исследовать влияние экстрактов, содержащих изофлавоноиды (маакия амурская, люцерна посевная и клевер красный) и растительные лигнаны (экстракт семян льна) на психоэмоциональные и вазомоторные реакции у крыс с гипоэстрогенемией, вызванной овариоэктомией.
-
Изучить влияние экстрактов маакии амурской и семян льна на процессы остеопороза у крыс после овариоэктомии.
-
В исследованиях in vitro среди экстрактов маакии амурской различного полифенольного состава выявить наиболее эффективный по его влиянию на вязкость крови и агрегацию тромбоцитов.
-
Осуществить углубленное изучение гемореологической активности и влияния на эффективность доставки кислорода тканям экстрактов, содержащих изофлавоноиды (маакия амурская) и растительные лигнаны (экстракт семян льна) при экспериментальной овариоэктомии.
-
Оценить влияние экстрактов маакии амурской и семян льна на перекисное окисление липидов в мембранах эритроцитов у крыс после овариоэктомии.
-
Изучить действие экстрактов, содержащих изофлавоноиды (маакия амурская, люцерна посевная и клевер красный) и растительные лигнаны (экстракт семян льна) на эндотелиальную дисфункцию у овариоэктомированных крыс.
-
Оценить влияние экстрактов маакии амурской, люцерны посевной и клевера красного, семян льна на показатели сосудисто-тромбоцитарного и плазменного гемостаза у крыс после овариоэктомии.
Научная новизна.
Впервые установлено, что фитоэстрогены классов изофлавоноидов (экстракты маакии амурской, люцерны посевной и клевера красного) и лигнанов (экстракт семян льна) оказывают антиклимактерическое действие, устраняя экспериментальные эквиваленты ранних симптомов климактерического синдрома (тревогу, «приливы жара») и поздние метаболические расстройства (остеопороз) в условиях овариоэктомии.
При экспериментальной гипоэстрогенемии впервые выявлена способность экстрактов маакии амурской и семян льна ослаблять выраженность синдрома повышенной вязкости крови за счет улучшения реологических свойств эритроцитов, что обеспечивает повышение эффективности доставки кислорода тканям.
Впервые показано, что у крыс после овариоэктомии экстракты, содержащие изофлавоноиды (маакии амурской, люцерны посевной и клевера красного) и растительные лигнаны (экстракт семян льна) эффективно снижают процессы липидной пероксидации в мембранах эритроцитов и предупреждают их окислительную модификацию.
Новыми являются данные о наличии у фитоэстрогенов классов изофлавонов и лигнанов эндотелийпротективной активности, выявленной в условиях экспериментальной овариоэктомии. Установлено, что экстракты маакии амурской, люцерны посевной и клевера красного, семян льна уменьшают агрегацию тромбоцитов при экспериментальной гипоэстрогенемии.
Теоретическая и практическая значимость работы. Получены данные фундаментального характера о механизмах коррекции реологических свойств крови при экспериментальной овариоэктомии фитоэстрогенами различных классов. Установлены принципиальные различия влияния гормональной терапии и фитоэстрогенов на реологические свойства крови и гемостаз в условиях экспериментальной гипоэстрогенемии.
Получены приоритетные данные об антиклимактерическом действии экстракта маакии амурской и его влиянии на реологические свойства крови при экспериментальной овариоэктомии (патенты РФ № 2342944 от 10.01.2009 и №2398592 от 10.09.2010), об эндотелийпротекторной активности экстракта семян льна при овариоэктомии у крыс (патент РФ №2455018 от 10.07.2012).
Материалы доклинических исследований экстракта маакии амурской представлены в Министерство здравоохранения Российской Федерации с целью получения разрешения на клинические исследования препарата по новому показанию в качестве антиклимактерического средства.
Методология и методы исследования. Согласно поставленным задачам выбраны современные высокоинформативные методические подходы, имеющиеся в научно-исследовательских лабораториях ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН. В качестве объекта исследования использованы аутбредные самки крыс сток Вистар в условиях овариоэктомии. Основные методы исследования: физиологические (изучение двигательной активности, ориентировочно-исследовательского поведения, «приливов жара» и функциональной активности эндотелия), гистологический (изучение процессов остеопороза), иммуно ферментные (исследование содержания эстрадиола в пробах сыворотки), гемореологические (оценка вязкости цельной крови, вязкости плазмы, гематокрита, спонтанной агрегации и деформируемости эритроцитов), гемостазиологические (определение агрегации тромбоцитов, активированного частичного тромбопластинового времени и протромбинового времени), биохимические методы (исследование липидного и фосфолипидного состава мембран эритроцитов, перекисного окисления липидов), статистический анализ результатов.
Положения, выносимые на защиту: 1. При экспериментальной овариоэктомии формируется специфический синдром повышенной вязкости крови, обусловленный изменением как макрореологических показателей (повышение гематокрита и фибриногена в
плазме крови), так и клеточных параметров (нарушение деформируемости и повышение агрегации эритроцитов).
-
Фитоэстрогены классов изофлавонов и лигнанов уменьшают вазомоторные нарушения («приливы жара») и снижают проявления экспериментальных тревоги и страха, существенно не влияя на двигательную активность крыс после овариоэктомии. Экстракт маакии амурской уменьшает также и эстрогензависимые процессы резорбции костной ткани при экспериментальной овариоэктомии.
-
Уменьшения повышенной вязкости крови у крыс после овариоэктомии можно достичь как курсовым применением этинилэстрадиола, так и фитоэстрогенов классов изофлавонов и лигнанов, но при этом фитоэстрогены, в отличие от этинилэстрадиола, не влияют на уровень половых гормонов в крови и обеспечивают восстановление индекса эффективности доставки кислорода тканям.
-
Фитоэстрогены, как и этинилэстрадиол, ограничивают выраженность основных факторов, повышающих риск сердечно-сосудистых нарушений при экспериментальной гипоэстрогенемии: уменьшают вязкость крови и эндотелиальную дисфункцию (восстанавливают антиагрегантные и вазодилятационные свойства эндотелия). При этом фитоэстрогены замедляют и даже предупреждают в отсроченном периоде образование внутрисосудистого тромба, а этинилэстрадиол оказывает протромбогенное действие.
Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом экспериментального материала, использованием современных методов и методических подходов, высокотехнологичного оборудования, а также адекватных критериев для статистической обработки результатов.
Основные положения диссертации представлены на VI международной конференции «Микроциркуляция и гемореология» (Ярославль, 2007); II международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, 2007); конференции НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007); IV Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); IX конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008); XII международной научной конференции «Здоровье семьи - XXI век» (Израиль, 2008); V Всероссийской конференции-школе «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008); симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств» (Москва, 2008); IV Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2009); XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009); VII Всероссийской научной конференции «Химия и медицина, Орхимед-2009» с Молодежной научной школой (Уфа, 2009); VIII Всероссийской научной конференции «Химия и медицина, Орхимед-2010» с Молодежной научной школой (Уфа, 2010); 2ndAnnual Russian Korean Conference «Curren tissues of natural products chemistry and biotechnology» (Novosibirsk, 2010); XVIII
Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011); VIII международной конференции «Системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология» (Ярославль, 2011); XII конгрессе молодых ученых с международным участием «Науки о человеке» (Томск, 2011); XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012); ІУсьезде фармакологов России (Казань, 2012); конференции молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2012).
Исследования частично проведены при финансовой поддержке ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» в рамках госконтракта 16.N08.12.1006 по теме «Доклинические исследования лекарственного средства на основе секоизоларицирезинола для лечения климактерических расстройств и эстрогензависимых опухолей».
По теме диссертации опубликовано 38 печатных работ, из них 16 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, по материалам исследования получено 3 патента РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 226 странице машинописного текста. Состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 336 источников, из них ПО отечественных и 226 зарубежных. Иллюстративный материал представлен 15 рисунками и 59 таблицами. Автор принимал непосредственное участие в планировании работы и разработке дизайна исследования, постановке его цели и задач. Автором лично осуществлен анализ литературных данных, получение и интерпретация основных результатов исследования, их статистическая обработка и подготовка к печати статей и тезисов по теме диссертации.
Характеристика растений, содержащих фитоэстрогены классов изофлавонов и лигнанов
Альтернативные методы коррекции климактерических нарушений предполагают применение лекарственных средств, обладающих сходным с гормонами механизмом действия, но не вызывающих побочных эффектов, свойственных эстрогенам [Сметник В.П., 2007; Балан В.Е. и др., 2007]. Основное требование к альтернативной терапии климактерических расстройств – наличие относительной избирательности действия: проявление эстрогенной активности в центральной нервной системе, костной ткани, урогенитальном тракте, сердечно-сосудистой системе и анти-эстрогенного действия в молочной железе и эндометрии [Балан В.Е. и др., 2007].
В настоящее время во многих исследованиях предпринимаются попытки определить реальность тканеспецифичности действия ряда растительных препаратов с фитоэстрогенной активностью и доказать их эффективность при лечении климактерического синдрома [Cherdshewasart W. еt al., 2007; Powell Е. еt al., 2012]. Фи-тоэстрогены – вещества растительного происхождения, структурно близкие 17-эстрадиолу, что позволяет им связываться с эстрогеновыми рецепторами и вызывать эстрогеноподобные эффекты. Согласно химической классификации они подразделяются на три подгруппы: изофлавоны, лигнаны и куместаны [Никитин А.И., 2000; Тутельян В.А. и др., 2002; Тутельян В.А. и др., 2003; Балан В.Е. и др., 2007].
Биологические эффекты фитоэстрогенов крайне разнообразны и зависят от множества факторов, включая уровень эстрогенов в крови, аффинитет к ER- или ER-, относительное преобладание рецепторов на клетках-мишенях. Фитоэстроге-ны некоторых растений, например, Puraria minifica, обладая высоким аффинитетом к ER-, блокируют этот рецептор и предотвращают развитие экспериментальной опухоли грудной железы [Cherdshewasart W. еt al., 2007]. По механизму действия фитоэстрогены близки к синтетическим селективным модуляторам эстрогеновых рецепторов – СМЭР (тамоксифен, ралоксифен и др.), которые блокируют ER- и стимулируют ER-. Применяют их для лечения рака молочной железы. Следова 31 тельно, фитоэстрогены можно отнести в группу фито-СМЭР.
Кроме фитоэстрогенов, имеющих структурное сходство с эстрадиолом, для лечения климактерического синдрома используют растительные препараты, не обладающие аффинитетом к эстрогеновым рецепторам [Wuttke W. et al., 2002; Seidlova-Wuttke D. еt al., 2012]. Это препараты, полученные из корней и корневищ клопагона кистевидного (Cimicifuga racemosa).
Цимицифуга (Cimicifuga racemosa) более 100 лет используется в США для лечения климактерических расстройств и часто встречается в рецептах традиционной и альтернативной медицины под названием Black cohosh [Mahady G.B., 2005]. Химическими компонентами корней и корневищ цимицифуги являются тритерпеноиды, производные циннамовой кислоты и эфиры инозидиновой и фук-ниновой кислот, не имеющие структурного сходства с 17 -эстрадиолом. Тем не менее, препараты из цимицифуги уменьшают проявления климактерического синдрома, что выражается в снижении частоты и тяжести приливов, нормализации сна, уменьшении раздражительности, повышении работоспособности [Kligler В., 2003; Osmers R. еt al., 2005; Mahady G.B., 2005; Балан В.Е., 2007; Kapur P. еt al., 2010]. При этом цимицифуга не влияет на пролиферативные процессы в эндометрии и молочной железе [Borrelli F., 2003; Сметник В.П., 2007; Балан В.Е., 2007]. Cimicifuga racemosa оказывает остеопротективное воздействие в результате повышения активности остеобластов [Wuttke W. et al., 2003; Kolios L. et al. 2010; Seidlova-Wuttke D. et al., 2012].
Точный механизм действия Cimicifuga racemosa при климактерическом синдроме до конца не выяснен. Некоторые ученые считают, что эффективность Cimicifuga racemosa обусловлена ингибиторным воздействием на центры гипоталамуса, способностью нормализовать синтез и обмен катехоламинов мозга, серото-нина, дофамина, повышать уровень -эндорфина, увеличивать уровень нейротензи-на. Препараты Cimicifuga racemosa нормализуют активность центра терморегуляции, не связываясь с и -эстрогеновыми рецепторами [Davis S.R., 2001; Балан В.Е., 2007]. По данным других авторов Cimicifuga racemosa обладает прямым эст-рогеноподобным эффектом [Muroz G.H., 2005], что подтверждается снижением уровня в крови лютеинизирующего гормона [Dker Е.М. et al., 1991]. Имеются сведения о ее антиэстрогенной активности [Wuttke W. et al., 2002; Wuttke W. et al., 2003].
Изучено влияние препаратов цимицифуги на липидный обмен. Назначение препаратов цимицифуги в сочетании с гипохолестеринемической диетой нормализует обмен липидов к 6-12 месяцу терапии [Wuttke W., et al. 2003]. Применение Cimicifuga racemosa уменьшает прибавление в весе, накопление внутрибрюшинного жира, снижает уровень инсулина и триглицеридов в плазме крови [Racho D. et al., 2008].
Из корней и корневищ Cimicifuga racemosa разработан лекарственный препарат «Климадинон» производства компании «Бионорика АГ» (Германия). Препарат купирует приливы, нивелирует психовегетативные проявления климактерического синдрома. В комплексном лечении женщин с артериальной гипертензией в постменопаузальном периоде «Климадинон» способствует нормализации суточного профиля артериального давления, приводит к повышению переносимости физической нагрузки по сравнению с традиционной антигипертензивной терапией [Балан В.Е., 2007].
Препараты цимицифуги обладают следующими побочными эффектами: тошнота, рвота, головная боль, головокружение, масталгия, увеличение массы тела, боль в эпигастральной области. С осторожностью следует применять препарат при заболеваниях печени [Mahady G.B., 2005; Lde S. еt al, 2007; Teschke R. еt al, 2011]. Большое значение имеет безопасность применения Cimicifuga racemosa для женщин, страдающих раком молочной железы [Davis V.L. еt al, 2008].
Фитоэстрогены - средства, содержащие в своем составе изофлавоноиды и лигнаны, также могут быть использованы для первичной и вторичной профилактики осложнений постменопаузального синдрома и, прежде всего, ССЗ. Они могут применяться и как альтернатива ГЗТ при абсолютных противопоказаниях к ее применению, и как дополнение к ней для профилактики сердечно-сосудистых осложнений климактерического синдрома.
Влияние этинилэстрадиола и экстракта цимицифуги на экспериментальные эквиваленты «приливов» у крыс после овариоэктомии
Изучение гемореологических и антиагрегантных эффектов исследуемых экстрактов осуществляли в условиях in vitro и in vivo. Модель гипервязкости крови в условиях in vitro воспроизводили инкубацией крови при температуре 20,0±0,4 оС в течение 60 мин, а в условиях in vivo – удалением яичников у половозрелых самок крыс.
Эксперименты по изучению гемореологической и антиагрегантной активности суммарного экстракта маакии амурской и его отдельных фракций, композиции экстракта люцерны посевной и экстракта клевера красного, экстракта семян льна на модели гипервязкости крови в условиях in vitro были проведены на 75 аутбредных самках крыс сток Вистар массой 250–300 г. Все исследованные экстракты вводили ежедневно внутрижелудочно в течение 5 дней. Экстракт 1 – суммарный экстракт маакии амурской, экстракт 2 – экстракт маакии амурской, содержащий изофлавоноиды и экстракт 3 – экстракт маакии амурской, содержащий димерные стильбены вводили внутрижелудочно ежедневно в дозах 200 мг/кг, 40 мг/кг и 35 мг/кг соответственно. Дозы экстрактов 2 и 3 подбирались так, чтобы вводимое количество изофлавоноидов и стильбенов соответствовало их содержанию в экстракте 1. Доза для внутрижелудочного введения композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного составляла 200 мг/кг (в соотношении 1:1, 100 мг/кг экстракта люцерны посевной и 100 мг/кг экстракта клевера красного). Дозы экстрактов подобраны таким образом, чтобы содержание изофлавонов, в смеси (11,2%) соответствовало уровню изофлавоноидов в суммарном экстракте маакии амурской (12,7%). Экстракт семян льна вводили в дозе 40 мг/кг. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество 1%-ной крахмальной слизи. Кровь для исследования забирали через 2 часа после последнего введения препаратов. После забора крови у опытных и контрольных животных в одних образцах регистрировали все исследуемые показатели, а другие пробы крови инкубировали при температуре 20,0±0,4 оС в течение 60 мин и затем производили из 62 мерение исследуемых показателей. Инкубация крови в течение 1 часа в этих условиях сопровождалась формированием модели гипервязкости крови [Плотников М.Б., Колтунов А.А., 1996].
Для воспроизведения синдрома повышенной вязкости крови (СПВК) у самок крыс in vivo использовали модель гормональной недостаточности, так как известно, что гипоэстрогeнемия сoпровождается повышением вязкости крови [Vaya А. et al., 2004; Безрукова О.Д. и др., 1986; Мелкозерова О.А., 2002; Armstrong B.K. et al., 1999]. Удаление яичников осуществляли согласно общепринятой методике [Киршенблат Я.Д., 1969]. В асептических условиях под эфирным наркозом у крыс осуществляли лапаротомию, выделяли внутренние половые органы самок крыс. Яичники перевязывали лигатурами, изолировали от рогов матки и кровеносных сосудов и иссекали. Рану послойно ушивали и проводили обработку операционного поля антисептиками. Крысы, у которых проводили лапаротомию и затем ушивали рану, составили группу ложнооперированных животных. Через неделю после овариоэктомии животным начинали вводить препараты. Для проведения гормональной заместительной терапии животным вводили внутрижелудочно эти-нилэстрадиол в дозе 25 мкг/кг в течение 14 дней. Препарат сравнения экстракт цимицифуги (ЭЦ) в дозе 100 мг/кг, суммарный экстракт маакии амурской (экстракт 1, ЭМА) в дозе 200 мг/кг, композицию экстрактов люцерны посевной и клевера красного (ЭЛиК) в дозе 200 мг/кг, экстракт семян льна (ЭСЛ) в дозе 40 мг/кг вводили по той же схеме, что и этинилэстрадиол. Контрольным животным аналогично вводили эквиобъемное количество 1% крахмальной слизи. Кровь для исследования забирали через 2 часа после последнего введения препаратов.
Для изучения влияния препаратов на процессы остеопороза, длительность курса лечения овариоэктомированных животных исследуемыми экстрактами в вышеперечисленных дозах составила 60 дней.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ «Statistica 8.0». Данные представлены в виде M±m, где M – среднее значение, m – стандартная ошибка среднего значения. Для оценки достоверности межгрупповых различий использовали непараметриче 63 ский критерий Mann-Whitney U test и метод х-квадрата. 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Эффекты этинилэстрадиола и экстракта цимицифуги у крыс после овариоэктомии В экспериментах использовали два препарата сравнения - этинилэстрадил и экстракт цимицифуги. Этинилэстрадиол был выбран в качестве препарата сравнения как эквивалент ГЗТ у женщин при климактерическом синдроме, а стандартизованный экстракт цимицифуги, как единственный фитопрепарат («Климади-нон»), который рекомендован для устранения психоэмоциональных и вазомоторных реакций при данной патологии.
Терапевтический эффект ГЗТ и экстракта цимицифуги на ранние симптомы климактерического синдрома у женщин хорошо известен [Сметник В.П., 2008; Thielemann A.et al, 2010; Балан В.Е., 2007]. В данной главе представлены результаты по влиянию этинилэстрадиола и экстракта цимицифуги на психоэмоциональные и вазомоторные реакции в условиях использованной нами модели гипоэстроге-немии.
Влияние этинилэстрадиола на показатели системы гемостаза у крыс после овариоэктомии
У животных после овариоэктомии, получавших композицию экстрактов люцерны посевной и клевера красного, в отличие от овариоэктомированных крыс без лечения, температура у основания хвоста была постоянной в течение всего периода наблюдения с 900 до 1200 ч (Рисунок 10), что является доказательством способности исследуемой композиции экстрактов устранять экспериментальные эквиваленты «приливов» у животных после удаления яичников.
Таким образом, композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного обладает способностью нормализовать вазомоторные реакции у крыс после овариоэктомии. исунок 10 – Влияние композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного (ЭЛиК, 200 мг/кг в течение 14 дней) на температуру у основания хвоста у крыс после овариэктомии Примечание – – р 0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + – р 0,05 по сравнению со значениями у животных контрольной группы.
Влияние композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного на психоэмоциональные и двигательные реакции у крыс после овариоэктомии
Как было отмечено выше (глава 3.1.2), овариоэктомия способствовала формированию пассивного типа поведения крыс с уменьшением ориентировочно-исследовательской активности и повышением уровня тревожности.
Композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного при курсовом введении в этих условиях не оказывала существенного влияния на ориентировочно-исследовательскую активность в тесте «открытое поле»: сохранялось снижение двигательной активности животных, прежде всего – горизонтальных перемещений на 33%, существенно не изменялось число вертикальных стоек и количество обследованных отверстий (норковый рефлекс) по сравнению с показателями у ложнооперированных крыс (Таблица 34). Вместе с тем, композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного уменьшала в 3 раза время выхода крыс из центрального квадрата в тесте «открытое поле», а также снижала в 2,5 раза количество болюсов, по сравнению с соответствующими показателями у овариоэктомированных животных (Таблица 34).
Следовательно, композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного при курсовом введении крысам после овариоэктомии, существенно не влияя на двигательную активность, оказывала выраженное противотревожное действие.
Антиагрегантная и гемореологическая активность композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного на модели гипервязкости крови in vitro
Люцерна посевная и клевер красный относятся к семейству бобовые и содержат изофлавоноиды (в частности, генистеин, дайдзеин, формононетин и др.), относящиеся к фитоэстрогенам [Burdette J.E. et al., 2002; Beck V. et al., 2005]. Кроме того, совокупность биологически активных веществ, содержащихся в этих растениях, обеспечивает и другие виды фармакологической активности (антиоксидантную, антиагрегантную), которые могут уменьшать риск сердечнососудистых осложнений климактерического синдрома. Вместе с тем, отсутствуют сведения о влиянии экстрактов этих растений или их индивидуальных действующих начал на реологические свойства крови, нарушения которых также являются серьезным фактором риска ССЗ у женщин в постменапаузальном периоде [De Backer et al., 2002].
В связи с этим на первом этапе были выполнены эксперименты по исследованию антиагрегантной и гемореологической активности композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного в условиях модели гипервязкости крови in vitro.
При исследовании влияния экстрактов люцерны посевной и клевера красного на агрегацию тромбоцитов, было установлено, что ежедневное введение крысам в течение 5 дней указанной композиции экстрактов существенно снижало АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов – на 56% по сравнению с показателем в группе контроля (Таблица 35). Следовательно, композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного обладает выраженной антиагрегантной активностью в отношении тромбоцитов.
В опытах in vitro по изучению влияния композиции экстрактов клевера красного и люцерны посевной на вязкость крови было установлено, что инкубирование проб крови контрольных животных в течение 60 минут при температуре С приводило к достоверному повышению ее вязкости при всех исследованных скоростях сдвига на 9-28%. Таблица 35 – Влияние композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного (ЭЛиК, 200 мг/кг в течение 5 дней) на амплитуду АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (%) у интактных самок крыс
У крыс, получавших композицию экстрактов, вязкость крови до инкубации не отличалась от значений в группе контроля. Инкубирование крови крыс этой группы приводило к повышению вязкости крови во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига на 5–9%, однако при этом значения вязкости крови были ниже по сравнению с соответствующими значениями в контроле во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига от 3 до 300 с-1 на 9–17% (Таблица 36).
Таким образом, при воспроизведении СПВК в условиях in vitro композиция экстрактов люцерны посевной и клевера красного оказывала выраженное антиа-грегантное действие в отношении тромбоцитов и ограничивала рост вязкости крови, вызванный ее инкубацией.
Полученные результаты явились основанием для исследования влияния композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного на реологические свойства крови в условиях овариоэктомии у крыс – модели, при которой формируется СПВК [Плотникова А.М. и др., 2008].
Влияние композиции экстрактов люцерны посевной и клевера красного на формирование тромба у крыс после овариоэктомии
Климактерический период у женщин является переходной ступенью от репродуктивного периода к старости и характеризуется гормональными сдвигами, связанными со старением яичников [Сметник В.П., 2007]. Физиологическое течение климакса характеризуется отсутствием вазомоторных, нейропсихических и обменно-эндокринных расстройств. Однако у большинства женщин снижение уровня циркулирующих в крови эстрогенов становится пусковым механизмом для развития многих вегетативных и психоэмоциональных симптомов, ухудшающих качество жизни [Kravitz H.M. et al., 2003; Meyer P.M. et al., 2003; Минеев В.П., 2005]. Частота патологического течения менопаузы составляет 60–80% и наиболее часто (до 90%) у женщин возникают вазомоторные нарушения – «приливы жара» и психоэмоциональные расстройства [Сметник В.П., 2008].
Выбранная нами модель гипоэстрогенного состояния, созданная двусторонней овариоэктомией у половозрелых крыс, приводила к снижению уровня эстра-диола в крови и, как следствие, возникновению вегетативных и вазомоторных нарушений. У овариоэктомированных животных наблюдались либо повышение температуры, измеренной у основания хвоста на 2–2,5оС, либо ее скачки в течение трехчасового наблюдения, что в эксперименте является эквивалентом «приливов жара» у женщин в климактерический период [Bowe J. et al., 2006]. «Приливы жара» в условиях гипоэстрогении, вероятно, являются результатом изменения работы центральных нейромедиаторов, ответственных за деятельность центра терморегуляции в гипоталамусе, обусловлены расширением периферических сосудов, сопровождаются учащением сердцебиения и потоотделением [Okeke T.C. et al., 2013].
Психоэмоциональные расстройства, как и вазомоторные нарушения, относятся к ранним симптомам климактерического синдрома, включают в себя изменение настроения в виде появления раздражительности, чувства тревоги, плаксивости, а также быструю утомляемость, нарушение сна, снижение когнитивных функций [Kravitz H.M. et al., 2003, Meyer P.M. et al., 2003, Поворознюк В.В. и др., 2004.]. В наших экспериментах у овариоэктомированных животных наблюдалось формирование пассивного типа поведения в тесте «открытое поле» с уменьшением ориентировочно-исследовательской активности и повышением уровня тревожности. Изменение эмоциональных и поведенческих реакций у животных после овариоэк-томии, вероятно, связано с дезорганизацией работы лимбико-ретикулярного комплекса в результате нарушения синтеза нейромедиаторов: снижения дофаминерги-ческого тонуса, ухудшения функционирования серотонинергической системы и активации адренергического комплекса [Сметник В.П., 2007; Тихомиров А.Л., 2007; Клиническая фармакология по Гудману и Гилману, 2006].
Одним из поздних нарушений, возникающих при климактерическом синдроме, является постменопаузальный остеопороз. Постменопаузальный остеопороз характеризуется прогрессирующей потерей массы костной ткани, которая начинается после естественной или хирургической менопаузы и приводит к повышению риска переломов костей [Сметник В.П., 2007; Seeman E. et al., 2006; Сметник В.П., 2010]. В наших экспериментах в отсроченный период – через 68 дней после овариоэкто-мии, наблюдалось достоверное снижение относительной плотности костных балок метафиза бедренных костей, по сравнению с ложнооперированными животными, что является морфологическим маркером снижения плотности костной ткани.
Таким образом, экспериментальная овариоэктомия воспроизводит основные ранние и поздние симптомы климактерического синдрома и может быть его адекватной моделью, пригодной для оценки антиклимактерических эффектов препаратов, поиска средств профилактики и лечения указанных постменопаузальных нарушений. Первый этап исследования и был посвящен оценке возможных антиклимактерических эффектов экстрактов маакии амурской, люцерны посевной и клевера красного, содержащих в качестве действующих начал с фитоэстрогенной активностью изофлавоноиды, а также экстракт семян льна, содержащий растительные лигнаны, также обладающие данным видом активности.
Наиболее распространенным и эффективным способом лечения указанных симптомов климактерического синдрома является ГЗТ. ГЗТ назначают пациенткам для уменьшения нейровегетативных и урогенитальных расстройств, с целью профилактики потери массы костной ткани и предупреждения развития других метаболических нарушений, возникающих в климактерии [Thielemann A. et al., 2010; Сметник В.П., 2008; Chanawirat A. et al., 2006]. Результаты многих исследований подтвердили эффективность ГЗТ в отношении остеопороза и профилактики коло-ректального рака [Anderson G.L. et al., 2004; Chanawirat A. et al., 2006; Kapur P. et al., 2010]. Вместе с тем длительная практика применения ГЗТ позволила установить, что положительные эффекты ГЗТ отмечаются у женщин, которых начинали лечить в ранние сроки после менопаузы [Schierbeck L.L. et al., 2012], тогда как у пожилых женщин с преморбидными состояниями преобладают отрицательные эффекты гормональной терапии [Макацария А.Д., 2007; Сметник В.П., 2007, Rosano G.M. et al., 2006].
Учитывая вышесказанное, предпринимаются попытки найти адекватную замену ГЗТ таким образом, чтобы, сохранив позитивные эффекты гормональной терапии, свести к минимуму ее серьезные побочные эффекты. С этих позиций несомненный интерес представляют фитопрепараты, обладающие эстрогенопо-добной активностью. Развитие данного направления в настоящее время может быть успешным в связи со значительным повышением качества фитопрепаратов, что обусловлено совершенствованием технологии их получения и стандартизации, возможностью выделения индивидуальных действующих веществ [Ледина А.В., Прилепская В.П., 2012]. Актуальность этого направления и надежда на успех подтверждается большим количеством научных исследований, направленных на изучение эффективности и разработку фитопрепаратов с эстрогеноподоб-ной активностью. Вместе с тем, к настоящему времени на фармацевтическом рынке присутствует только один препарат, полученный из корней и корневищ цимицифуги – «Климадинон» (Бионорика АГ, Германия), имеющий статус лекарственного средства [Регистр лекарственных средств России, 2013] и рекомендованный для устранения психоэмоциональных и вазомоторных нарушений при климактерическом синдроме.