Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Иммунодефицитные состояния и этиопатогенетические основы регуляции иммунной системы 12
1.2. Иммунотерапия вторичных иммунодефицитов средствами растительного происхождения 19
1.3. Влияние биологически активных веществ лекарственных растений на иммунный статус 27
1.4. Характеристика Phlomoides tuberosa (L.) Мoench 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 39
Глава 3. Влияние экстракта сухого phlomoides tuberosa (l.) Moench на состояние иммунной системы у интактных животных и оценка его аллергизирующих свойств 53
3.1. Оценка влияния экстракта сухого P. tuberosa на массу и клеточность иммунных органов мышей при азатиоприновой иммуносупрессии 53
3.2. Оценка аллергизирующих свойств экстракта сухого P. tuberosa 59
ГЛАВА 4. Коррекция экстрактом сухим phlomoides tuberosa (l.) moench азатиоприновой иммуносупрессии 62
4.1. Влияние экстракта сухого P. tuberosa на массу и клеточность иммунных органов мышей при экспериментальной азатиоприновой иммуносупрессии 62
4.2. Оценка эффективности экстракта сухого P. tuberosa в отношении клеточного иммунного ответа при азатиоприновой иммуносупрессии 64
4.3. Влияние экстракта сухого P. tuberosa на функциональное состояние гуморального иммунного ответа при азатиоприновой иммуносупрессии. 65 4.4. Коррекция экстрактом сухим P. tuberosa нарушений макрофагального звена иммунитета, обусловленных действием азатиоприна 67
4.5. Оценка влияния экстракта сухого P. tuberosa на морфофункциональное состояние тимуса и селезенки при азатиоприновой иммуносупрессии 68
4.6. К вопросу о механизмах иммуномодулирующего действия экстракта сухого P. tuberosa при азатиоприновой иммуносупрессии 79
4.6.1. Изучение антиоксидантной активности экстракта сухого P. tuberosa при азатиоприновой иммуносупрессии 79
4.6.2. Антиоксидантная активность экстракта сухого P. tuberosa в условиях in vitro 80
4.6.3. Влияние экстракта сухого P. tuberosa на продукцию мононуклеарными клетками периферической крови здоровых доноров провоспалительных цитокинов 83
ГЛАВА 5. Иммуномодулирующие свойства индивиуальных соединений, выделенных из экстракта сухого phlomoides tuberosa (l.) moench, при азатиоприновой иммуносупрессии 85
5.1. Оценка эффективности индивидуальных соединений (форситозида В, шанжизид метилового эфира и -4,6-глюкана), выделенных из экстракта сухого P. tuberosa, в отношении клеточно-опосредованной реакции иммунного ответа 85
5.2. Влияние индивидуальных соединений (форситозида В, шанжизид метилового эфира и -4,6-глюкана), выделенных из экстракта сухого P. tuberosa, на состояние гуморального иммунного ответа 86
5.3. Оценка влияния индивидуальных соединений (форситозида В, шанжизид метилового эфира и -4,6-глюкана), выделенных из экстракта сухого P. tuberosa, на макрофагальное звено иммунного ответа 87
Глава 6. Обсуждение результатов 90
Заключение 102
Выводы 104
Список литературы 105
- Иммунотерапия вторичных иммунодефицитов средствами растительного происхождения
- Оценка аллергизирующих свойств экстракта сухого P. tuberosa
- Оценка влияния экстракта сухого P. tuberosa на морфофункциональное состояние тимуса и селезенки при азатиоприновой иммуносупрессии
- Влияние индивидуальных соединений (форситозида В, шанжизид метилового эфира и -4,6-глюкана), выделенных из экстракта сухого P. tuberosa, на состояние гуморального иммунного ответа
Введение к работе
Актуальность темы. В последнее время в условиях неблагоприятной экологической обстановки в ряде регионов страны, повышенной радиации, массированного воздействия ксенобиотиков, в том числе лекарственных препаратов на организм, происходит нарушение иммунного статуса, что ведет к росту иммунодефицитных состояний, способствует развитию аллергий, аутоиммунных заболеваний, возникновению резистентности микроорганизмов к проти-вомикробной терапии (Козлов И.Г., 2010; Любошенко Т.М., 2014; Parnham M.J., 2011; Dhama К. et al., 2015; Nikamp F.P., Stark A.K. et al., 2015). Уменьшением или устранением иммунных нарушений можно добиться снижения частоты формирования патологических состояний, что является непременным условием успеха комплексной терапии многих заболеваний (Иммунотерапия..., 2014; Федоров Ю.Н. и др., 2015, Nikamp F.P., Parnham M.J., 2011). Поэтому поиск средств и методов коррекции иммунологической реактивности организма является одной из актуальных задач иммунофармакологии (Фе-щенко Ю.И., Рекалова Е.М., 2013; Куркин В.А., Пройков В.В., 2015; Сепиа-швили Р.И., 2015; Patil U.S. et al., 2012).
Значительная доля иммунокорригирующих препаратов на сегодняшний день в Государственной Фармакопее РФ представлена препаратами животного, микробного, а также синтетического происхождения (Федеральное руководство…, 2011; Фещенко Ю.И., Рекалова Е.М., 2013; Иммунотерапия…, 2014), тогда как арсенал иммуномодулирующих средств растительного происхождения ограничен. В отличие от синтетических препаратов фитосредства имеют ряд преимуществ: незначительное число побочных эффектов, возможность применения у всех возрастных групп, наличие комплекса биологически активных веществ, действующих на весь организм в целом и активирующих функции нервной и эндокринной систем на фоне иммуномодулирующего действия (Тозлиян Е.В., 2013; Беседнова Н.Н., 2014; Kumar S. et al., 2011; Sultan M.T. et al., 2014; Pozharitskaya O.N. et al., 2015). В рамках импортозамеще-ния первостепенной задачей отечественной фармакологии является изыскание новых лекарственных средств, конкурентоспособных с производимыми за рубежом (Вельмяйкина Е.И., 2012; Куркин В.А., 2012; Хабирова С.Х., 2013).
Все эти аспекты диктуют необходимость создания фитосредств, направленных на восстановление иммунного статуса организма, безопасных и эффективных в условиях коррекции вторичных иммунодефицитов (Лазарева Д.Н. и др., 2005; Gertsch J. et al., 2011; Kumar S. et al., 2011; Vajdy М., 2011; Belapurkar P. et al., 2014).
Имеющиеся в литературе сведения о влиянии препаратов из лекарственных растений на иммунную систему весьма ограничены, практически мало изучено их влияние при иммунодефицитах, не всегда определяется механизм их иммунотропного действия (Шмагель К.В., 2008; Sanz J.M. et al., 2009; Ghonime М. et al., 2011; Sultan M.T. et al., 2014).
Отечественные лекарственные растения, характеризующиеся значительными запасами в природе и обладающие широким фармакотерапевтическим эффектом, являются наиболее перспективными для создания на их основе лекарственных препаратов. К числу таких растений относится зопничек клубненосный (Phlomoides tuberosa (L.) Мoench). В Институте общей и экспери-
ментальной биологии СО РАН был разработан способ получения экстракта сухого из клубней P. tuberosa, представляющего собой сумму экстрактивных веществ: фенилпропаноидов, иридоидов, полисахаридов, витаминов и др. Высокая эффективность суммарных препаратов и индивидуальных извлечений, полученных из P. tuberosa, при хронических воспалительных, инфекционных и аллергических заболеваниях, в патогенезе которых существенное значение имеют нарушения иммунологической реактивности организма, аргументирует целесообразность его исследований с последующей разработкой нового им-муномодулирующего средства (Водолазова С.В. и др., 2011; Баторова С.М., 2013).
Целью работы явилось определение иммуномодулирующей активности экстракта сухого из клубней Phlomoides tuberosa в условиях экспериментальной иммуносупрессии.
Для достижения указанной цели были сформулированы следующие задачи:
-
определить влияние экстракта сухого P. tuberosa на состояние иммунной системы интактных мышей и оценить его аллергизирующее действие;
-
определить фармакотерапевтическую эффективность экстракта сухого P. tuberosa при экспериментальном вторичном иммунодефиците, вызванном азатиоприном;
-
оценить влияние индивидуальных веществ, выделенных из экстракта сухого P. tuberosa, на состояние основных звеньев иммунной системы мышей при азатиоприновой иммуносупрессии.
Научная новизна. Впервые установлена иммуномодулирующая активность экстракта сухого, полученного из клубней P. tuberosa, при экспериментальной иммуносупрессии, вызванной введением классического иммуноде-прессанта – цитостатика азатиоприна. Показано, что курсовое введение per os животным экстракта сухого P. tuberosa в экспериментально-терапевтических дозах 200-400 мг/кг ослабляет супрессивное действие азатиоприна, что выражается в повышении массы и клеточности иммунных органов – тимуса и селезенки, индекса реакции гиперчувствительности замедленного типа, абсолютного и относительного числа антителообразующих клеток, а также фагоцитарного индекса. При этом действие исследуемого экстракта сопоставимо с таковым препарата сравнения – «Иммунал». Курсовое введение мышам экстракта сухого P. tuberosа ограничивает иммунодепрессивное влияние азатио-прина, стимулируя пролиферативную активность лимфоидной ткани тимуса и селезенки, нормализуя параметры их структурных компонентов. Экстракт сухой P. tuberosa не оказывает существенного влияния на показатели основных звеньев иммунного ответа у интактных мышей, а также не вызывает развитие аллергических реакций у белых крыс и морских свинок.
Иммуномодулирующая активность экстракта сухого P. tuberosa обусловлена его способностью снижать интенсивность свободнорадикальных процессов в гомогенате селезенки, вызванных экспериментальной иммуносупресси-ей, повышать активность ферментов антиоксидантной защиты организма, а также стабилизировать мембраны иммунокомпетентных клеток. Установлено, что введение мышам, подвергнутым иммуносупрессии, индивидуальных соединений (фенилпропаноида форситозида В, иридоида шанжизид метилового эфира и полисахарида -4,6-глюкана), выделенных из экстракта сухого P. tuberosa, способствует восстановлению показателей иммунитета в реакциях
гиперчувствительности замедленного типа, антителообразования и фагоцитоза перитонеальных макрофагов. В частности, шанжизид метиловый эфир оказывает преимущественное действие на фагоцитарную активность макрофагов, форситозид В и -4,6-глюкан в равной степени ослабляют супрессивное действие азатиоприна в отношении клеточного звена иммунного ответа, а в реакции антителообразования более выраженное действие проявляет -4,6-глюкан.
Практическое значение. Полученные результаты исследований обосновывают возможность и целесообразность коррекции экстрактом сухим из клубней P. tuberosa иммуносупрессии, вызванной введением азатиоприна. Наличие иммунокорригирующих свойств у экстракта сухого позволяет рекомендовать его для дальнейшего изучения с целью создания новых эффективных и безопасных растительных иммуномодулирующих препаратов.
Материалы исследований используются в учебном процессе на кафедрах общей патологии человека; фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии медицинского института ФГБОУ ВО «Бурятский государственный университет» Минобрнауки РФ.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Экстракт сухой из клубней P. tuberosa не вызывает существенных изменений показателей основных реакций иммунной системы у интактных мышей и не оказывает влияния на развитие аллергических реакций у морских свинок и белых крыс.
-
Введение мышам экстракта сухого P. tuberosa в условиях иммуносупрессии способствует восстановлению показателей основных звеньев иммунного ответа организма, а также величин структурных компонентов иммунных органов - тимуса и селезенки.
-
Иммуномодулирующий эффект экстракта сухого P. tuberosa обусловлен его способностью снижать интенсивность свободнорадикальных процессов, вызванных экспериментальной иммуносупрессией, повышать активность ферментов антиоксидантной защиты организма и стабилизировать мембраны иммунокомпетентных клеток.
-
Индивидуальные вещества, выделенные из P. tuberosa: фенилпропа-ноид форситозид В, иридоид шанжизид метиловый эфир и полисахарид -4,6-глюкан оказывают иммуномодулирующее влияние на клеточное, гуморальное звенья иммунитета и фагоцитоз макрофагов при экспериментальной иммуносупрессии, вызванной азатиоприном.
Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:
IV Международной научной конференции «Traditional medicine: Ways of Integration with Modern Health Care» (Улан-Удэ, 2013);
The 20th International Congress on Rehabilitation in Medicine and Immu-norehabilitation and the 7th World Congress on Asthma and Respiratory Allergy (New York, 2014);
Международном форуме «Клиническая иммунология и аллергология - междисциплинарные проблемы» (Казань, 2014);
IV Всероссийской международной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 25-летию Центра восточной медицины (Улан-Удэ, 2014);
The 7th International Simposium on Mongolian Medicine and Natural Medicine Inner Mongolia «First Mongolian Medicine Industry Expo» (Tongliao, 2015);
Международном конгрессе «Инновационные технологии в иммунологии и аллергологии» (Москва, 2015);
объединенном заседании I Конгресса по традиционной медицине стран ШОС, БРИКС, ЕАЭС и III Российского Конгресса по комплементарной медицине (Москва, 2015);
III научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые и фармация XXI века» (Москва, 2015);
The 5 International Conference of Traditional Medicine «The best practices of Traditional medicine» (Ulaanbaatar, 2016);
IV научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые и фармация XXI века» (Москва, 2016).
Личный вклад автора в получении научных результатов. Автором диссертационной работы проведен поиск и анализ данных по теме, осуществлены планирование и проведение экспериментальных исследований, обработка, интерпретация и обсуждение полученных результатов. Согласно сформулированным задачам подготовлены публикации по основным положениям диссертационной работы; оформлена рукопись диссертации.
Работа выполнена в Отделе биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН в соответствии с задачами по проекту № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация», утвержденным Президиумом СО РАН.
Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 16 научных работ, из них 8 - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 133 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных экспериментальных исследований (3 глав), обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка литературы, включающего 240 источников, из которых 82 - на иностранных языках. Работа иллюстрирована 20 таблицами, 15 рисунками, включая микрофотографии.
Иммунотерапия вторичных иммунодефицитов средствами растительного происхождения
Коррекция нарушенного состояния иммунной системы осуществляется с помощью иммунотропных лекарственных средств, лечебный эффект которых связан с преимущественным или селективным действием на иммунную систему организма. Они включают три основные группы: иммуномодуляторы (восстанавливают нарушенные функции иммунной системы), иммуностимуляторы (преимущественно усиливают иммунитет) и иммунодепрессанты (подавляют иммунный ответ). Иммуномодуляторы оказывают разнонаправленное воздействие на иммунную систему, в связи с чем, их применяют в комплексной терапии заболеваний с признаками вторичной иммунологической недостаточности. Отдельные иммуномодуляторы могут избирательно влиять на соответствующее звено иммунной системы, но конечный эффект оказывается многогранным, поскольку изменяется функциональная активность всей иммунной системы [22; 45; 113; 130].
Иммунотропные препараты широко применяются в практической медицине, повышая эффективность лечения иммунозависимых заболеваний, но их применение должно контролироваться квалифицированными специалистами с позиций доказательной медицины. Диагностические критерии контроля назначения иммунотропных препаратов осуществляются с помощью оценки показателей иммунограммы, интерферонового статуса, местного иммунитета. Клинические критерии эффективности определяют клиницисты. Применение иммунотропных препаратов будет более безопасным после консультации специалиста, аллерголога-иммунолога и проведения иммунологического обследования больного [36; 113; 130].
По химической структуре и биологическим свойствам все иммуномодуляторы можно разделить на 7 групп: иммуноактивные компоненты поверхностных структур патогенов (микробные), тимические гормоны, костномозговые регуляторы — миелопептиды или их аналоги, цитокины, нуклеиновые кислоты, растительные и синтетические [134]. Арсенал современных иммуномодуляторов представлен, в основном, синтетическими лекарственными средствами, однако их широкое применение ограничено, ввиду наличия большого числа побочных эффектов. В последнее время большое внимание исследователей уделяется иммунотропным препаратам растительного происхождения, которые, благодаря наличию в них комплекса биологически активных веществ (БАВ), мягко воздействуют на организм, не кумулируются, не вызывают привыкания, имеют значительную разницу между терапевтической и токсической дозами, могут применяться у лиц с сочетанными патологиями и оказывают устойчивый терапевтический эффект [8; 73; 87; 123; 198]. Известно также, что БАВ растений оказывают противовоспалительное, бактерицидное, противоаллергическое, противоопухолевое действие и являются также антиоксидантами, которым отводится главная регулирующая роль при иммунологических и цитогенетических нарушениях [135; 163; 186; 213; 224]. Поэтому поиск новых иммунокорригирующих средств растительного происхождения в настоящее время остается актуальной задачей иммунофармакологии [113; 130].
Иммуномодуляторы растительного происхождения (препараты эхинацеи, иммуномакс, алпизарин, мебавин, кагоцел, панавир) действуют на макрофаги, Т- и В-лимфоциты, NK-клетки, являются индукторами интерферонов [22; 130].
На рынке фармацевтических препаратов РФ среди иммуномодуляторов растительного происхождения более 80% занимают препараты на основе сырья эхинацеи пурпурной - Echinacea purpurea (L.) Moench [20; 127; 130]. В качестве лекарственного сырья используются трава, корневища и корни эхинацеи в свежем или высушенном виде. Ведущими БАВ эхинацеи пурпурной являются фенилпропаноиды – производные коричной кислоты, полисахариды и алкиламиды [68; 126]. БАВ эхинацеи пурпурной способствуют активации неспецифических факторов иммунитета и клеточного иммунитета, повышают фагоцитарную активность макрофагов и хемотаксис гранулоцитов, способствуют высвобождению цитокинов, увеличивают продукцию интерлейкина-1 (IL-1) макрофагами, ускоряют трансформацию В-лимфоцитов в плазматические клетки, усиливают антителообразование и Т-хелперную активность [36; 48; 211]. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют об эффективности и безопасности лекарственных средств на основе сырья эхинацеи пурпурной [76; 109; 147]. На территорию России эхинацея пурпурная была интродуцирована из Северной Америки, в настоящее время для фармацевтической промышленности культивируется лишь на Урале, в Ставрополье и Самарской области, что, при большом спросе на препараты из ее сырья, несомненно, недостаточно [14; 68].
Е.В. Литвиновой и др. (2014) выявлено иммуномодулирующее действие комбинированного препарата «Эхинавит-М» на основе эхинацеи пурпурной и витаминов С и Р в отношении специфического (гуморальное и клеточное) и неспецифического звеньев иммунной системы в условиях иммунодефицита, индуцированного гидрокортизоном. Сравнительный анализ показал, что по эффективности «Эхинавит-М» (таблетки) не уступает настойке Эхинацеи, а по отдельным показателям превосходит ее [76].
Н.В. Исайкиной и др. (2008) изучены иммуномодулирующие свойства водно-спиртового экстракта «Эхиносол» на основе травы эхинацеи пурпурной (Echinacea purpurea (L.) Moench), череды трёхраздельной (Bidens tripartita L.), солянки холмовой (Salsola collina Pall.), листьев крапивы двудомной (Urtica dioica L.), корней солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.) и слоевищ ламинарии японской (Laminaria japonica Aresch.). Установлено, что применение «Эхиносола» стимулирует продукцию антителообразующих клеток в селезенке, иммуноглобулинов, лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов, Т-клеток-предшествеников и Т-клеток эффекторов [46].
Оценка аллергизирующих свойств экстракта сухого P. tuberosa
Для проведения экспериментальных исследований использовали 220 половозрелых мышей самцов линии CBA, 260 гибридов F1 (CBAxC57Bl/6) массой тела 20-22 г., 8-10-недельного возраста, 96 белых крысах обоего пола линии Wistar массой 150-250 г., 40 морских свинок-альбиносов обоего пола массой 350-400 г. Линейные животные получены из питомника РАМН «Столбовая». Содержание животных соответствовало «Правилам лабораторной практики» (GLP) и Приказу МЗ РФ № 708Н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики». Перед началом экспериментов животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, распределялись на группы с учетом пола, возраста, массы и принципа рандомизации. Экспериментальную работу осуществляли в соответствии с приказом МЗ РФ № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики» от 19.06.2003 и «Правилами Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целях» (Страсбург, 1986). Протокол исследований согласован с этическим комитетом ИОЭБ СО РАН (протокол №7 от 12.11.2013г.).
Острую токсичность исследуемого средства определяли по методу Кербера [106] при однократном внутрибрюшинном введении вещества в диапазоне доз: от 500 до 6000 мг/кг и внутрижелудочном введении в диапазоне доз: от 2000 до 5000 мг/кг. Все испытанные дозы доводили дистиллированной водой до конечного объема, составляющего 1,0 мл / 100 г массы животного. Наблюдение за общим состоянием экспериментальных животных и их поведением осуществляли в течение 14 дней. Определение массы и клеточности органов иммунной системы
Эвтаназию животных осуществляли с помощью дислокации шейных позвонков под легким эфирным наркозом, извлекали тимус и селезенку, взвешивали на торсионных весах и рассчитывали отношение их маасы к массе тела мыши в %.
Для определения клеточности лимфоидные органы гомогенизировали в среде 199. Суспензию клеток отделяли от элементов стромы фильтрованием через капроновое сито и 3 раза отмывали от частиц жировой ткани центрифугированием при 200 g в течение 5 минут. При подсчете ядросодержащих клеток (ЯСК) каплю клеточной суспензии для освобождения от сопутствующих эритроцитов помещали в 3%-ый раствор уксусной кислоты и вносили в камеру Горяева [107].
Воспроизведение экспериментальной иммуносупрессии Экспериментальную модель иммуносупрессии у животных создавали введением цитостатика азатиоприна (OAO «Мосхимфармпрепараты» им. Н.А. Семашко, лекарственная форма - таблетки), в дозе 50 мг/кг перорально в объеме 0,1 мл/мышь 1 раз в сутки в течение 5 дней [72]. Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) Сенсибилизацию мышей корпускулярным тимусзависимым антигеном, с последующим введением разрешающей дозы эритроцитов барана (ЭБ) для воспроизведения реакции ГЗТ, производили согласно стандартной методике локальной ГЗТ [106].
Мышей сенсибилизировали внутрибрюшинно введением 0,1%-ой взвеси ЭБ в физиологическом растворе. На 4-е сутки под подошвенный апоневроз задней лапки вводили разрешающую дозу антигена – 50 мкл 50% 44 ой взвеси ЭБ. В контрлатеральную лапку инъецировали физиологический раствор в том же объеме. Оценку реакции ГЗТ проводили спустя 24 часа по разнице массы опытной (Ро) и контрольной (Рк) лапок. Обе лапки отрезали сразу же после забоя животных по голеностопному суставу. Индекс реакции (ИР) вычисляли по формуле: ИР = Ро - Рк х 100% Рк Метод определения антителообразующих клеток (АОК)
Количество АОК определяли с использованием модифицированного A.J. Cunningham (1965) метода, предложенного N. Jerne, A. Nordin (1963). Метод основан на способности антиэритроцитаных антител, секретируемых АОК иммунизированных животных, лизировать в присутствии комплемента ЭБ. Если в монослое эритроцитов содержатся клетки-антителопродуценты, в месте их расположения формируются прозрачные зоны локального гемолиза - бляшки [170].
Мышей иммунизировали внутрибрюшинно в дозе 2 х 108 клеток на мышь. Реакцию ставили на 5-е сутки после иммунизации. Готовили смесь равных объемов суспензии лимфоидных клеток (1 селезенка гомогенизирована в 5 мл среды), ЭБ (10%) и комплемента (1:5) непосредственно перед постановкой реакции. Полученную смесь разливали в стеклянные камеры, представляющие собой два предметных стекла, соединенных между собой по краям парафином, учитывая объем входящей суспензии. Камеры инкубировали в течение 1 часа при 37С и подсчитывали с помощью лупы зоны гемолиза по всей камере.
Оценка влияния экстракта сухого P. tuberosa на морфофункциональное состояние тимуса и селезенки при азатиоприновой иммуносупрессии
Острую токсичность экстракта сухого P. tuberosa определяли по методу Кербера [106] на белых крысах обоего пола линии Wistar с исходной массой 150-170 г. при внутрибрюшинном и внутрижелудочном однократном введении экстракта. В результате проведенных исследований установлено, что при внутрижелудочном введении экстракта сухого P. tuberosa в дозах от 2000 мг/кг до 6000 мг/кг в течение первых 2 суток у животных наблюдались признаки общей интоксикации в виде гиподинамии, потери аппетита, учащения дыхания, при этом гибели животных не наблюдалось. При внутрибрюшинном введении изучаемого средства DL50 составила 2115 ± 162,3 мг/кг массы животных. На основании полученных данных экстракт сухой P. tuberosa относится к группе малотоксичных средств по классификации К.К. Сидорова [115].
Эксперименты проведены на мышах-самцах линии F1 (CBAxC57Bl/6). Экстракт сухой P. tuberosa вводили в дозах 100, 200 и 400 мг/кг, препарат сравнения «Иммунал» - в дозе 5 мл/кг массы тела перорально ежедневно в течение 14 дней. Интактная группа животных получала по аналогичной схеме в соответствующем объеме очищенную воду. Данные о влиянии экстракта сухого P. tuberosa на относительную массу иммунных органов (тимус и селезенка) и их клеточность (количество ядросодержащих клеток) представлены в таблице 3.1.1. Полученные данные позволяют заключить, что введение экстракта P. tuberosa в дозах 100, 200 и 400 мг/кг и референтного препарата «Иммунал» не привело к изменению массы и клеточности тимуса и селезенки (Таблица 3.1.1).
Введение животным экстракта сухого P. tuberosa во всех исследуемых дозах, также как и препарата сравнения «Иммунал» не оказывает влияния на интенсивность клеточного иммунного ответа. Индекс реакции ГЗТ у животных, которым вводили экстракт и препарат сравнения, существенно не отличается от соответствующих показателей интактной группы (Таблица 3.1.2).
При исследовании влияния экстракта сухого P. tuberosa и референтного препарата «Иммунал» на процессы антителообразования установлено, что испытуемые средства во всех указанных дозах значимо не изменяют как абсолютное число АОК, так и число АОК на 106 спленоцитов по сравнению с теми же показателями в интактной группе (Таблица 3.1.3).
Из данных, представленных в таблице 3.1.4, следует, что введение животным экстракта сухого P. tuberosa во всех исследуемых дозах, а также препарата сравнения «Иммунал» значимо не влияет на процент фагоцитирующих клеток в отношении частиц коллоидной туши по сравнению с данными в интактной группе.
При оценке влияния экстракта сухого P. tuberosa на поглотительную активность нейтрофилов периферической крови человека в отношении S. aureus, меченного зеленым флюорохромом ФИТЦ, отмечено, что данное средство не оказывает достоверного влияния на способность нейтрофилов поглощать S. aureus. Так, количество фагоцитирующих нейтрофилов под влиянием экстракта сухого P. tuberosa не изменялось по сравнению с таковым в контрольной группе (Рисунок 3.2.1).
При исследовании влияния экстракта сухого P. tuberosa на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами установлено, что указанное средство значимо не изменяет процент ФМА-активированных нейтрофилов, продуцирующих активные формы кислорода, по сравнению с данными в контрольной группе (Рисунок 3.2.2). Однако использование экстракта сухого P. tuberosa по сравнению с введением в систему классического стимулятора ФМА, индуцирующего кислородный «взрыв», достоверно снижает интенсивность флуоресценции нейтрофилов в 1,5 раза (Таблица 3.2.1).
Влияние экстракта сухого P. tuberosa на продукцию активных форм кислорода в тесте ФМА-индуцированного кислородного «взрыва»: а) контроль (спонтанная флуоресценция), б) ФМА (стимулированная флуоресценция), в) ФМА + экстракт сухой P. tuberosa (в % - нейтрофилы, продуцирующие активные формы кислорода) 3.2. Оценка аллергизирующих свойств экстракта сухого P. tuberosa Влияние экстрактa сухого P. tuberosа на развитие реакции общей анафилаксии (анафилактический шок) Исследования выполнены на морских свинках-альбиносах массой 350-400 г. В группах было по 3 животных.
В результате проведенных экспериментов установлено, что у животных контрольной группы после введения лошадиной сыворотки развивалась анафилактическая реакция, признаками которой являлись: сильное беспокойство, кашель, чихание, почесывание.
Животные опытных групп признаков беспокойства не проявляли, изменения в их поведении и внешнем виде не обнаруживались. Таким образом, полученные результаты исследования показали, что экстракт сухой P. tuberosa во всех указанных дозах не оказывает заметного влияния на развитие анафилактического шока у морских свинок. Влияние экстрактa сухого P. tuberosа на развитие непрямой реакции дегрануляции тучных клеток Влияние экстракта сухого P. tuberosa на развитие непрямой реакции дегрануляции тучных клеток определяли на крысах-самцах Wistar массой 150-170 г.
На основании проведенных исследований установлено, что показатели дегрануляции тучных клеток ни в одном из случаев не превышали значение 0,2, после которого эта реакция считается положительной. Во всех случаях показатель был ниже этого значения (Таблица 3.3.1).
Влияние индивидуальных соединений (форситозида В, шанжизид метилового эфира и -4,6-глюкана), выделенных из экстракта сухого P. tuberosa, на состояние гуморального иммунного ответа
С целью выяснения молекулярно-клеточного механизма иммуномодулирующего действия экстракта сухого P. tuberosa нами проведена оценка его антиоксидантной активности с использованием модельных систем in vitro и мембраностабилизирующей активности с использованием метода перекисного и осмотического гемолиза 1%-ной суспензии эритроцитов донорской крови в условиях in vitro.
Антиоксидантную активность экстракта сухого P. tuberosa в модельных системах in vitro оценивали посредством определения железосвязывающей активности, степени связывания оксида азота (II), антиокислительной активности с применением желточных липопротеидов в условиях in vitro (Таблица 4.6.2.1).
В результате проведенных исследований установлено, что растительное средство проявляет умеренную хелатирующую активность в отношении металла переменной валентности - Fe2+ (IC50=2,14 мг/мл), превышающую таковую кверцетина (IC50 5,00 мг/мл). Объект 2+Fe NO МБС-ЖЛП Экстракт P. tuberosa 2140 ± 109,2 1310 ± 94,5 883 ± 57,6 кверцетин а 5000 150 ± 4,2 101 ± 3,2 аскорбиновая кислота а 150 ± 9,1 1045 ± 24,1 270 ± 13,1 Примечание: Fe2+ – Fe2+-хелатирующая активность, NO – связывание молекул оксида азота (II); МБС-ЖЛП – модельная биологическая система желточных липопротеидов, а - вещество сравнения.
В отношении молекул оксида азота выявлена умеренная нейтрализующая способность экстракта сухого P. tuberosa. При этом его антиоксидантная активность (ICNO50=1,31 мг/мл) в отношении первичных активных форм кислорода – NO – сопоставима с таковой вещества сравнения – аскорбиновой кислоты (ICNO50=1,05 мг/мл).
Внесение исследуемого экстракта в модельную биологическую систему желточных липопротеидов оказывает протективное действие по отношению к белковым молекулам, предупреждая их окислительную (металлокатализируемую) модификацию. Величина IC50 при определении антиокислительной активности экстракта сухого P. tuberosa составила 883 мкг/мл. При этом для аскорбиновой кислоты данный показатель составил 270 мкг/мл.
Таким образом, в эксперименте in vitro выявлена выраженная антиокислительная активность в отношении инициаторов свободнорадикальных реакций. При исследовании мембраностабилизирующей активности экстракта сухого P. tuberosa с использованием метода перекисного и осмотического гемолиза установлено, что внесение испытуемого средства снижает интенсивность перекисного и осмотического гемолиза эритроцитов (показатель IC50 экстракта сухого P. tuberosa при перекисном гемолизе составил 832,00 мкг/мл, осмотическом – 9,91 мкг/мл) (Таблица 4.6.2.2).
Таким образом, выявленное мембраностабилизирующее действие экстракта сухого P. tuberosa, по-видимому, обусловлено его способностью инактивировать свободные радикалы, снижая интенсивность свободнорадикальных реакций, препятствуя деструкции плазматической мембраны эритроцитов, а также уменьшая ее проницаемость в гипотонических условиях. 4.6.3. Влияние экстракта сухого P. tuberosa на продукцию мононуклеарными клетками периферической крови здоровых доноров провоспалительных цитокинов
В условиях in vitro изучено влияние экстракта сухого P. tuberosa на продукцию мононуклеарными клетками периферической крови человека провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6 и TNF-. Под влиянием экстракта сухого P. tuberosa происходило повышение содержания провоспалительных цитокинов IL-1 и TNF- на 26 и 27% соответственно по сравнению с контролем. Стимулирующего или ингибирующего влияния экстракта сухого P. tuberosa на синтез и секрецию IL-6 клетками не обнаружено (Таблица 4.6.3.1).
Влияние экстракта сухого P. tuberosa на продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови здоровых доноров Вариант опыта IL-1, пг/мл IL-6, пг/мл TNF-, пг/мл Контроль 290,0 ± 23,21 1103,3 ± 87,19 261,3 ± 18,25 экстракт P. tuberosa 365,7 ± 6,98 1147,2 ± 43,91 332,3 ± 10,92 Обобщая приведенные данные исследования, можно отметить, что экстракт сухой P. tuberosa в экспериментально-терапевтической дозе 200 мг/кг оказывает выраженное иммуномодулирующее действие при азатиоприновой иммуносупрессии, активируя гуморальное, клеточное и макрофагальное звенья иммунитета. Курсовое применение испытуемого фитосредства ограничивает развитие нарушений процессов пролиферации лимфоидных клеток в паренхиме иммунных органов - тимуса и селезенки в условиях повреждающего действия азатиоприна, восстанавливает их цитоархитектонику. В основе иммунопротективного действия экстракта сухого P. tuberosa лежит его способность стабилизировать мембраны иммунокомпетентных клеток, реализация которой связана с ингибированием процессов свободнорадикального окисления биомакромолекул (снижение МДА в гомогенате селезенки), повышением активности ферментов антиоксидантной защиты организма (увеличение активности каталазы), способностью дезактивировать активные формы кислорода и другие инициаторы перекисного окисления липидов, а также стимулировать продукцию мононуклеарными клетками периферической крови здоровых доноров провоспалительных цитокинов IL-1 и TNF-.