Содержание к диссертации
Введение
Глава 1.
Обзор литературы 11
1.1. Принципы взаимодействия опухоли и иммунной системы 11
1.2. Противоопухолевое звено иммунитета
1.2.1. Цитотоксические Т-лимфоциты 16
1.2.2. Натуральные киллеры 18
1.2.3. НКТ-клетки 20
1.2.4. Лимфокин-активированные клетки 21
1.2.5. Дендритные клетки 22
1.3. Цитокины в патогенезе злокачественных новообразований 23
1.3.1. Интерлейкин-2 23
1.3.2. Интерлейкин-4 25
1.3.3. Интерлейкин-6 1.4. Провоспалительные факторы при опухолевом процессе 27
1.5. Фармакологические подходы в терапии рака
1.5.1. Препараты растительного происхождения 31
1.5.2. Таргетные препараты 32
1.5.3. Рекомбинантные интерлейкины 33
1.5.4. Пассивная специфическая иммунотерапия 34
1.5.5. Иммуномодуляторы, полученные методом синтеза 36
1.6. Фармакология синтетических производных 3-ОП и 5-ОПМ 36
1.6.1. Антигипоксическая/антиоксидантная активность 37
1.6.2. Противоопухолевая активность 38
Глава 2. 40
Материалы и методы исследования 40
2.1. Экспериментальные животные 40
2.2. Опухолевые клеточные линии и штаммы 40
2.3. Исследуемые агенты 41
2.4. Препараты для верификации используемых моделей 41
2.5. Материалы 42
2.6. Иммунофармакологические методы
2.6.1. Исследование гуморального иммунного ответа в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) на тимусзависимый антиген (эритроциты барана (ЭБ)) 44
2.6.2. Исследование клеточного иммунного ответа в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) 44
2.6.3. Оценка фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов 45
2.6.4. Оценка генерации активных форм кислорода (АФК) методом люминол-зависимой клеточной хемилюминесценции
2.6.5. Исследование процентного содержания цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и натуральных киллеров (НК-клетки) крови и иммунокомпетентных органов мышей C57BL/6 47
2.7. Методы исследования противовоспалительной активности соединений 48
2.7.1. Реакция воспаления на конканавалин А 48
2.7.2. Острый экссудативный отек на каррагенан у крыс 48
2.8. Методы оценки противоопухолевой активности 49
2.8.1. Модель злокачественной перевиваемой опухоли in vivo 49
2.8.2. Оценка противоопухолевой активности СНК-411 в модели перевиваемой карциномы легкого Lewis 51
2.8.3. Оценка противометастатических свойств СНК-411 в модели перевиваемой карциномы легкого Lewis 51
2.8.4. Мультиплексное исследование цитокинов в сыворотке крови у животных-опухоленосителей методом проточной цитометрии 54
2.8.5. Исследование влияния СНК-411 на рост карциномы легкого Lewis и параметры поведения у мышей-опухоленосителей в условиях зоосоциального конфликта 55
2.8.6. Оценка прямого цитотоксического эффекта СНК-411 in vitro в отношении клеток линии К-562 56
2.8.7. Исследование функциональной/цитотоксической активности мононуклеаров периферической крови (МПК) человека in vitro 58
2.9. Статистическая обработка результатов 59
ГЛАВА 3. 60
Результаты исследования 60
3.1. Оценка иммунофармакологических свойств производных ряда 3-окиспиридина и 5 оксипиримидина 60
3.1.1. Исследование гуморального иммунного ответа в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) на тимусзависимый антиген (эритроциты барана (ЭБ)) 60
3.1.2. Исследование клеточного иммунного ответа в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) 62
3.1.3. Оценка противовоспалительных свойств оригинальных производных 3-ОП и 5-ОПМ в реакции воспаления на конканавалин А при внутрибрюшинном введении 62
3.1.4. Оценка противовоспалительных свойств соединения СНК-411 в реакции воспаления на конканавалин А при пероральном введении 63
3.1.5. Острый экссудативный отек на каррагенан у крыс 64
3.1.6. Оценка фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов 65
3.1.7. Оценка генерации активных форм кислорода (АФК) методом люминол-зависимой клеточной хемилюминесценции 65
3.2. Оценка противоопухолевой и противометастатической активностей 68
3.2.1. Оценка противоопухолевой активности СНК-411 на модели перевиваемой опухоли in vivo 68
3.2.2. Мультиплексное исследование цитокинов в сыворотке крови у животных-опухоленосителей методом проточной цитометрии 72
3.2.3. Исследование противометастатических свойств соединения СНК-411 у мышей с LLC 3.2.5. Исследование влияния СНК-411 на рост LLC и параметры поведения у мышей-опухоленосителей в условиях зоосоциального конфликта 83
3.2.6. Оценка прямого цитотоксического эффекта СНК-411 in vitro в отношении клеток линии К-562 85
3.2.5. Исследование функциональной активности МПК человека (НК-клеток) in vitro 88
Обсуждение результатов 90
Выводы 107
Практические рекомендации 108
Список сокращений 109
Список литературы 113
- Цитокины в патогенезе злокачественных новообразований
- Препараты для верификации используемых моделей
- Методы исследования противовоспалительной активности соединений
- Исследование клеточного иммунного ответа в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Ежегодно в мире регистрируется более 10 миллионов новых случаев заболевания раком и более 6 миллионов случаев смертности от раковых заболеваний. По данным ВОЗ, в 2014 году в России зарегистрировано 248 тыс. новых случаев онкологических заболеваний населения, а смертность от рака составила 176,9 тыс. случаев у мужчин и 148,7 тыс. – у женщин. (Всемирная Организация Здравоохранения. Профили рака в странах. 2014).
Классическими средствами для лечения рака являются цитостатические химиотера-певтические препараты, мишенями которых являются нуклеиновые кислоты и сигнальные системы, регулирующие клеточную пролиферацию (Ali A., Bhattacharya S. // Bioor-ganic and Medicinal Chemistry. 2014. Vol. 22, Issue 16. P. 4506-4521). Эффективность традиционных методов лечения (хирургического, химио- и лучевой терапии) в последние годы не увеличивается, что обуславливает поиск новых подходов (Yang C. J. et al. // The Journal of Thoratic and Cardiovascular Surgery. 2015. Vol. 150, Issue 6. P. 1484-1493).
Приоритетным направлением является поиск таргетных средств лечения рака. Объединяемые общим принципом молекулярно-нацеленного воздействия таргетные препараты имеют основными мишенями тканеспецифические гормоны и их рецепторы, факторы роста сосудов, белки сигнальной трансдукции, регуляторы клеточного цикла, различные киназы (Dorel M. et al. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2015. Vol. 464, Issue 2. P. 386-391).
Наряду с этим, востребована разработка средств, активирующих противоопухолевые механизмы иммунной защиты, оптимизирующих содержание и функциональную активность натуральных киллеров (НК-клетки) и цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), содержание цитокинов, ассоциированных с опухолевым ростом, в частности, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 (Ito F. // Surgical Oncology Clinics of North America. 2013. № 22. P. 765-783; Klemm F., Joyce J. A. // Trends in Cell Biology. 2015. Vol. 25, Issue 4. P. 198-213; Noguchi A. // International Immunopharmacology. 2014. Vol. 18, Issue 1. P. 90-97). Однако, такие соединения не обладают прямым противоопухолевым действием, что сужает границы их использования.
В противоопухолевой терапии часто используется сочетанное применение противоопухолевых и иммуномодулирующих препаратов, что повышает эффективность терапии, последние часто обладают противовоспалительной активностью (Simoes M. et al. // Cancer Letters. 2015. Vol. 357, Issue 1. P. 8-42; Soto B. et.al. // International Immunopharmacolo-gy. 2011. Vol. 11, Issue 11. P. 1877-1886).
В связи с этим актуальна разработка соединений, сочетающих противоопухолевую,
иммунологическую и противовоспалительную активность. Внимание привлекают синтетические производные 3-оксипиридинов (3-ОП) и 5-оксипиримидинов (5-ОПМ) (Alam M. P. // Bioorganic and Medicinal Chemistry. 2014. Vol. 22, Issue 17. P. 4935-4947), поскольку среди этих производных представлены нарушающие синтез ДНК и РНК (фторафур), с антиоксидантной/противовоспалительной активностью (мексидол).
В связи с этим, перспективными к разработке представляются синтезированные в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова» оригинальные соединения 3-ОП и 5-ОПМ, которые могут сочетать иммунофармакологические, противовоспалительные, противоопухолевые свойства.
Степень разработанности проблемы. В настоящее время разработка новых лекарственных препаратов для иммунотерапии злокачественных новообразований, выбор оптимального лечения и повышение качества жизни онкологических больных является актуальной задачей. Фторпиримидины используются в клинической онкологии, но обладают высокой токсичностью, поэтому ведется поиск их малотоксичных аналогов и активных противоопухолевых средств с другим механизмом действия.
В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова» проводится скрининг производных 3-оксипиридина и 5-оксипиримидина, в результате которого было выявлено соединение СНК-411 с выраженными иммунофармакологическими, противовоспалительными и противоопухолевыми свойствами.
Цель исследования. Провести фармакологический скрининг в ряду производных 3-оксипиридина и 5-оксипиримидина и отобрать соединения, обладающие иммуномодули-рующими и противовоспалительными свойствами, определить лекарство-кандидат и провести комплексное исследование его иммунофармакологических свойств и противоопухолевой активности в моделях in vitro и in vivo.
Задачи исследования.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Провести скрининг иммунофармакологической активности 11 новых оригинальных производных 3-оксипиридина и 5-оксипиримидина в реакциях пассивной гемагглю-тинации, гиперчувствительности замедленного типа, фагоцитоза, индуцированного воспаления на конканавалин А у мышей и выявить наиболее активное соединение.
-
Исследовать противовоспалительные свойства производного 5-оксипиримидина (СНК-411) в зависимости от дозы, пути введения и вида экспериментальных животных на моделях острого экссудативного воспаления.
-
Методом проточной цитометрии исследовать влияние СНК-411 на содержание ЦТЛ и НК-клеток в крови и иммунокомпетентных органах у мышей с помощью флуо-4
ресцентных моноклональных антител.
-
Оценить влияние СНК-411 на выживаемость, рост опухоли, метастазирование и содержание цитокинов, ассоциированных с опухолевым ростом, в сыворотке крови мышей в модели перевиваемой эпидермоидной карциномы легкого Lewis.
-
Провести сравнительное исследование эффектов СНК-411 и субстанций противоопухолевых препаратов с доказанной цитотоксической активностью в отношении эрит-ромиелоидной лейкозной линии К-562 и действие СНК-411 на функциональ-ную/цитотоксическую активность мононуклеаров периферической крови человека in vitro в МТТ-тесте.
Научная новизна. В результате проведенного исследования действия нового производного 5-оксипиримидина СНК-411 в дозах от 1 до 100 мг/кг у мышей впервые установлены иммунофармакологические свойства СНК-411 в дозах 25 мг/кг и 50 мг/кг, выражающиеся в стимуляции гуморального, клеточного и неспецифического иммунного ответа в общепринятых верифицированных тестах.
Впервые установлено, что СНК-411 в дозах 10, 25, 50 мг/кг обладает выраженным противовоспалительным действием, значимо снижая экссудативные отеки лап мышей и крыс в соответствующих моделях воспаления.
СНК-411 в дозах 25 мг/кг и 50 мг/кг значимо увеличивает в крови и иммунокомпе-тентных органах мышей содержание основных клеток противоопухолевого иммунитета цитотоксических Т-лимфоцитов CD3+CD8+ и натуральных киллеров СD335+.
На основе выявленного спектра фармакологической активности сформулирована рабочая гипотеза о наличии у СНК-411 противоопухолевых свойств. Она нашла подтверждение в разных моделях in vitro и in vivo. Во-первых, СНК-411 при в/б введении в дозах 25 мг/кг и 50 мг/кг или в дозе 100 мг/кг per os значимо ингибирует рост карциномы легкого Lewis (LLC) и процесс метастазирования у мышей C57BL/6. Во-вторых, соединение в дозах 25 и 50 мг/кг в/б на модели перевиваемой карциномы Lewis уменьшает содержание биомаркера опухолевой прогрессии ИЛ-4, пролиферативного ИЛ-2 и провос-палительного ИЛ-6, увеличивает выживаемость у животных с LLC. В-третьих, СНК-411 в концентрациях 10-4 и 10-5 М уменьшает долю жизнеспособных клеток линии К-562 и в концентрации 10-5 М значимо увеличивает гибель К-562, индуцированную мононуклеа-рами периферической крови человека.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Подтверждена рабочая гипотеза о наличии у соединения СНК-411 противоопухолевых свойств. Выявлено оригинальное производное 5-оксипиримидина, сочетающее им-мунофармакологическую, противовоспалительную и противоопухолевую активности,
защищенное соответствующим патентом (патент РФ №251888 от 10.06.2014) и перспективное для дальнейшей разработки в качестве средства противоопухолевой терапии.
Положения, выносимые на защиту.
1. СНК-411 в дозах 25 мг/кг и 50 мг/кг проявляет выраженные иммунофармакологи-
ческие свойства в общепринятых верифицированных тестах (РПГА, ГЗТ, цитометриче-ский анализ, фагоцитоз).
-
СНК-411 в дозах 10 мг/кг, 25 мг/кг и 50 мг/кг проявляет выраженное противовоспалительное действие при различных путях введения в 1 % растворе крахмала или в дистиллированной воде в рекомендованных моделях воспаления у мышей и крыс.
-
CНК-411 в дозах 25 мг/кг, 50 мг/кг в/б и 100 мг/кг per os в модели перевиваемой эпидермоидной карциномы легкого Lewis демонстрирует противоопухолевую и проти-вометастатическую активности.
4. СНК-411 в дозах 25 мг/кг и 50 мг/кг значимо снижает содержание ИЛ-2, ИЛ-6, а
также содержание ИЛ-4, увеличенное у мышей-опухоленосителей.
5. СНК-411 в концентрациях 10-4 М и 10-5 М обладает прямым цитостатическим эф
фектом в культуре клеток линии К-562 in vitro и в концентрации 10-5 М стимулирует ги
бель клеток линии К-562 в присутствии мононуклеаров периферической крови человека
in vitro.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов исследований подтверждается использованием адекватных методов статистической обработки, а также повторами серий опытов.
Результаты диссертационной работы доложены на 4-ом съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), IX конференции молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН Н. В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2014), 17th World Congress of Basic and Clinical Pharmacology (WCP, 2014) (Cape Town, South Africa, 2014), 8-ом съезде онкологов и радиологов СНГ и Евразии (Казань, 2014), XII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Отечественные противоопухолевые препараты" (Москва, 2015), XXII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2015), 12th World Congress of Biological Psychiatry (Athens, Greece, 2015), Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Достижения современной фармакологической науки» (Рязань, 2015), 6-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Клязьма, 2015).
Личный вклад автора состоит в выполнении экспериментальной и аналитической
части диссертации. Автором проведена обработка и описание полученных результатов, сформулированы положения и выводы. При непосредственном участии автора подготовлены публикации по результатам диссертационного исследования.
Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова» по теме «Поиск средств фармакологической коррекции функционального состояния организма и работоспособности в экстремальных условиях среды обитания и деятельности» (Рег. № 01201169194).
Сведения о публикациях по теме диссертации. Результаты исследований опубликованы в 19 печатных работах, из них 4 статьи в журналах из перечня рецензируемых научных журналов, определенных ВАК Минобрнауки РФ, 1 патент РФ (№ 2566445 от 27.10.2015), 14 тезисов в материалах российских и международных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 144 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Иллюстрированна 17 таблицами и 15 рисунками. Библиографический указатель включает 103 отечественных и 168 иностранных источников.
Цитокины в патогенезе злокачественных новообразований
Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) играют ключевую роль в системе противоопухолевого надзора, их киллерная активность может быть существенно повышена при воздействии стимулирующих агентов [176].
ЦТЛ или CD8+ Т-лимфоциты в организме осуществляют функции антиген-специфической цитотоксичности (рисунок 3). ТСR этих лимфоцитов распознает свой антиген в комплексе с молекулами МНС I на мембране клеток собственного организма, которые в данном случае являются клетками-мишенями для кил-лерной атаки со стороны ЦТЛ. Специализированный механизм киллинга у ЦТЛ локализован в гранулах [69; 255]. Неиммунные зрелые ЦТЛ после выхода из тимуса имеют только программу для синтеза эффекторных молекул, но не сами молекулы. После вовлечения их в иммунный ответ, распознавания ими своего антигена эта программа начинает действовать, а именно: происходит синтез ци-тотоксинов, которые накапливаются в гранулах в виде неактивных молекул-предшественников. Причем гранулы в клетке сориентированы локально, что обеспечивает возможность строго направленного киллерного удара по клетке-мишени. Рисунок 3. Распознавание опухолевых клеток цитотокси-ческими Т-лимфоцитами [233].
Примечание: LFA – функционально-ассоциированный антиген лимфоцитов; ICAM-1 – фактор межклеточной адгезии 1; TAP – переносчик, связанный с процессированием антигена.
Сами цитотоксины неспецифичны по отношению к антигену, т.е. они одинаковы для всех антигенов [70; 95; 152]. При работе ЦТЛ не повреждаются ни сами ЦТЛ, ни здоровые клетки тканей организма. Механизм действия ЦТЛ состоит в том, что ЦТЛ связывает своим ТСR антиген на поверхности клетки-мишени и в области связи быстро формируется межклеточная зона контакта [199]. Локально в этой области происходит выброс содержимого гранул ЦТЛ. Гранулы ЦТЛ содержат два типа белков - перфорины и гранзимы А, В и С. Гранзимы являются сериновыми протеазами, предназначенными для инициации программы апоптоза. Но если в клетке-мишени нет программы апоптоза или есть дефекты в этой программе, то ЦТЛ все равно разрушит эту клетку некрозом - осмотическим лизисом через поры, образованные перфорином. Таким образом, антиген-активированные ЦТЛ лизируют опухолевые клетки через высвобождение перфоринов, либо запускают программированную клеточную гибель опухо 18 левых клеток по пути Fas/FasL [209].
По данным ряда авторов, ЦТЛ обладают способностью вступать во взаимодействие с НКТ-лимфоцитами, активируя последние, а также с дендритными клетками.
К настоящему времени установлено широкое распространение апоптоза в иммунологических процессах, причем во многих случаях он осуществляется благодаря взаимодействию рецептора Fas (CD95 или АРО-1) с его лигандом FasL.
Активация НК и Т-лимфоцитов-киллеров (рисунок № 4) при взаимодействии их рецепторов с вирусными антигенами индуцирует экспрессию гена FasL. А FasL-протеин, экспрессированный на поверхностной мембране НК и Т- киллера, связывается с белком Fas на поверхности клетки-мишени и вызывает ее апоп-тоз. Наряду с этим, Т-киллер выделяет гранзимы и перфорин, накопленные в гранулах. Один из гранзимов (гранзим В) является сериновой протеазой, которая активирует каспазу-8 с последующим включением апоптотического протеолити-ческого каскада. Таким образом, перфорин-гранзимовый и Fas/FasL механизмы могут совместно или независимо друг от друга вызывать апоптоз.
НК-клетки (натуральные киллеры) — это большие гранулярные лимфоциты, экспрессирующие маркер NKp46, маркеры CD56 и/или CD16, не экспресси-рующие линейные маркеры Т- и B-клеток (CD3 и CD19) и способные без предварительной активации убивать инфицированные или злокачественно измененные клетки организма [92; 93; 260].
НК-клетки относят к системе врожднного иммунитета, поскольку они развиваются без перестройки генов рецепторного аппарата. Однако в отличие от большинства других клеток врожденной иммунной системы, распознающих полностью чужеродные для организма молекулярные структуры микробного происхождения, НК-клетки узнают и уничтожают измененные собственные клетки организма.
Мишенями НК-клеток являются такие клетки организма, которые частично или полностью утратили поверхностную экспрессию молекул MHC I класса, но при этом экспрессируют нормальные или повышенные уровни поверхностных молекул, индуцируемых клеточным стрессом [85; 102; 118]. Такие молекулярные изменения характерны для клеток, инфицированных вирусами и другими цито-зольными паразитами, а также для опухолевых клеток. НК-клетки способны уничтожать клетки-мишени без какой-либо предварительной активации (иммунизации) [16; 172]. Это их свойство носит название естественной цитотоксично-сти (или НК-активности) и лежит в основе термина «естественные киллеры». НК-клетки способны распознавать самые ранние этапы онкогенной трансформации [251].
Второй важнейшей функцией НК-клеток является продукция цитокинов и хемокинов. НК-клетки вырабатывают в первую очередь провоспалительные ци-токины (ИФН-, ФНО-), а также воспалительные хемокины MIP-1/ и RANTES, тем самым вовлекая в иммунный ответ другие клетки иммунной системы [144]. Однако описаны и так называемые регуляторные НК-клетки, выра 20 батывающие преимущественно интерлейкин-10 (ИЛ-10) и способствующие подавлению иммунного ответа [134].
Уничтожение (лизис) инфицированных клеток макроорганизма и опухолевых клеток является основной функцией НК-клеток. Основным механизмом ци-толитического действия НК-клеток является перфорин-гранзим-зависимый, в основе которого лежит дегрануляция. Кроме того, НК-клетки располагают другими средствами киллинга, из которых наиболее заметную роль играют поверхностные молекулы семейства ФНО, так называемые «рецепторы смерти», в частности Fas-лиганд (FasL, CD178), а также через апоптоз клетки-мишени – факторами TNF/TNFR и TRAIL-активированными НК-клетками [59; 172]. В редких случаях НК-клетки могут распознавать и убивать непосредственно клетки возбудителя [192].
Существует особая субпопуляция Т-лимфоцитов, которая в литературе чаще всего обозначается как CD4+NK1.1+ или НКТ. НКТ-клетки являются Т-клетками с рецепторами TCR и СD3+, но также имеют и рецепторы НК-клеток и другие маркеры, позволяющие им отвечать, как эффекторам врожденной иммунной системы и уничтожать клетки подобно НК-клеткам [29].
НКТ-клетки, быстро продуцируя цитокины в ответ на опухоль, могут изменять последующий адаптивный иммунный ответ стандартных CD4+ Т-клеток. НКТ-клетки могут отвечать на микробную инфекцию быстрее, чем обычные Т-клетки [120]. НКТ-клетки распознают гликолипидные антигены микроорганизмов [196].
Существует два типа НКТ, которые не только имеют противоположные функции (усиление и подавление иммунитета), но и регулируют работу друг друга. Действуя на баланс между двумя этими типами НКТ, можно повлиять на исход инфекционного, аутоиммунного заболевания и злокачественного новообразования. Доказано, что НКТ-лимфоциты активируются в ранние сроки после проникновения антигена в организм и продуцируют большие количества ИЛ-4, отклоняющего в дальнейшем дифференцировку классических CD4+ в сторону Th2 [102].
Препараты для верификации используемых моделей
В работе использовали самцов мышей линий СВА, С57BL/6, F1(СВА C57BL/6) массой 18-20 г., полученных из сертифицированных питомников (питомник «Столбовая»), содержавшихся в условиях вивария ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова» при 12-часовом световом режиме на стандартном сбалансированным брикетированном корме со свободным доступом к пище и воде при естественном освещении и температуре воздуха 20-21оС. Все эксперименты с животными проводили в соответствии с международными правилами (Директива 86/609/ЕЕС) и правилами работы с животными, утвержденными этической комиссией ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова».
Общее количество животных, использованных в экспериментах, составило: 1545 мышей, 50 крыс. Содержание животных в виварии соответствовало Приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».
В качестве опухолевой клеточной культуры использовалась эритромиело-идная линия человека К-562 (Российская коллекция культур клеток позвоночных, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Клетки К-562 поддерживали культивированием в питательной среде RPMI-1640 (ООО «Биолот»), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 10 мМ HEPES-буфера, 2 мМ/мл глутамина, 40 мкг/мл гентамицина при 37оС и в атмосфере 5% СО2. Все реагенты компании НПП «ПанЭко». Для исследований К-562 использовали в концентрации 2104 клеток/лунку.
Клеточный опухолевой штамм эпидермоидной карциномы легкого Lewis (LLC) для исследований in vivo получен из банка1 глубокозамороженных опухолевых культур ФГБНУ «Российский онкологический научный центр имени Н. Н. 1 Автор выражает благодарность за обучение методикам и предоставление опухолевого штамма лабораторию экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДИТО ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина», а также д.м.н., профессора Барышникова А. Ю Блохина» и поддерживался пассированием на мышах линии C57BL/6 в соответствии с методическими рекомендациями [89].
Соединение СНК-4112 (2-изобутил-4,6-диметил-5-оксипиримидин), обладающее противоопухолевой активностью, синтезировано, разработано и запатентовано в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова» (патент № 2518889 от 10.06.2014). Острая токсичность определена в опыте на белых беспородных мышах-самцах массой 18-20 г. при в/б введении. ЛД50 СНК-411 составила 625 мг/кг при расчете по Литчфилду и Уилкоксону. По классификации К. К. Сидорова соединение относится к малотоксичным фармакологически эффективным веществам.
Соединение СНК-511 (2-изопентил-4,6-диметил-5-оксипиримидин), обладающее иммуномодулирующей активностью, синтезировано, разработано и запатентовано в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова» (патент РФ № 2566445 от 27.10.2015) [79].
Соединения под шифрами ПиОН-530, ПиОН-755, ПиОН-805, ПиОН-915, ПиОН-920, ПиОН-922, ПиОН-934, ПиОН-935, ПиОН-942 синтезированы, разработаны в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова».
Диклофенак (диклофенак натрия, HemofarmreumatoLogica, Сербия) – нестероидное противовоспалительное средство (рег. № П N011648/02).
Доксорубицин-ЭБВЕ (доксорубицина гидрохлорид, ЭБВЕ Фарма Гес.м.б.Х. Нфг.КГ, Австрия) – противоопухолевый антибиотик антрациклинового ряда, выделенный из культуры Streptomyces peucetius var. caesius (рег. № П N015188/01).
Фторафур (тегафур, Grindex, Латвия) – противоопухолевое средство, антиметаболит (рег. № П N016066/01). Субстанции тегафура и доксорубицина гидрохлорида (Sigma-Aldrich, 2 Новые производные 3-ОП и 5-ОПМ синтезированы в отделе химии лекарственных средств ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова» старшим научным сотрудником, кандидатом химических наук Никитиным С. В. США). – гентамицин (ООО «ПанЭко», Россия); – гепарин; – глутамин (ООО «ПанЭко», Россия); – диклофенак (Хемофарм, Югославия); – диметилсульфоксид (ДМСО) (ООО «Биолот», Россия); – изопропанол, содержащий 0,04 М НСl; – каррагенан (Sigma, США); – конканавалин А (Sigma, США); – лазерный цитометр EPICS XL 4 color (Beckman Coulter, США); – микротитратор Такачи; –МТТ (3[4,5-диметил-тиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий) (Sigma-Aldrich, США); – питательная среда RPMI-1640 (ООО «Биолот», Россия) – раствор Хенкса; – спектрофотометр (Awareness, Австрия); – счетчик клеток ТС 10 (Bio-Rad, Великобритания); – трипановый синий (Sigma, США); – тушь, суспензия 0,05%; – физиологический раствор; – фосфатно-солевой буфер (ФСБ, ООО «Биолот», Россия); – штангенциркуль цифровой ШЦЦ-1-125 (Micron, Чехия); – эмбриональная телячья сыворотка (ООО «Биолот», Россия); – эритроциты барана (ЭБ, ООО «ЭКОлаб-Центр», Россия); – Assay Buffer - стоковый буфер; – Biotin-Conjugate (specific antibody conjugated to biotin) – биотинилированные вторичные антитела к интерлейкинам, 10шт; – FITC Anti-mouse CD3e (Leo O. et. al. 1987) - меченные флуоресцин-изотиоционатом моноклональные антитела к поверхностному антигену mouse CD3 (Clone 145-2C11) (eBio-Science, Австрия); – FITC Anti-mouse CD335; – Fluorescent Beads coated with specific antibodies – 10 субпопуляций полимерных флюоресцентных частиц, покрытых специфичными антителами к каждому из интерлейкинов (m GM-CSF B8 monoclonal; m IFN-g B6 monoclonal; m IL-1a A4 monoclonal; m IL-2 A6 monoclonal; m IL-4 B9 monoclonal; m IL-5 A8 monoclonal; m IL-6 A10 monoclonal; m IL-10 A12 monoclonal; m IL-17 B10 monoclonal; m TNF-a B7 polyclonal); – HEPES-буфер (ООО «Биолот», Россия); – Mouse Th1/Th2 10plex Kit (BenderMedSysems, Австрия) (Setup Beads (SB) – полимерные частицы для настройки параметров светорассеивания на проточном цитометре; Standard (lyophilized) 10 шт – лиофилизированные образцы интерлей-кинов, для построения концентрационных калибровочных кривых; Streptavidin-Phycoerythrin (Streptavidin-PE) – стрептовидин, коньюгированный с фикоэритри-ном); – Optilyse C (Beckman Соulter, США); – PE Anti-mouse CD4 (Wilde D.B. et. al. 1983) – меченные фикоэритрином моно-клональные антитела к поверхностному антигену CD4 (Clone GK 1.5) (eBioS-cience, Австрия); – PE-Cy5 Anti-mouse CD8a (Ledbetter, J. A. and L. A. 1979) – меченные комплексом фикоэритрин-цианат моноклональные антитела к поверхностному антигену mouse CD8a (Clone 53-6.7).
Производные ряда 5-окиспиримидинов вводили животным внутрибрюшин-но (в/б) однократно в дозах от 1 мг/кг до 50 мг/кг в 1 % растворе крахмала в течение трех дней. Производные ряда 3-окиспиридинов вводили по той же схеме в дозах 25 мг/кг и 50 мг/кг. Контрольным животным вводили 1 % раствор крахмала. Оценку параметров иммунной системы проводили согласно общепринятым методам [91]. 2.6.1. Исследование гуморального иммунного ответа в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) на тимусзависимый антиген (эритроциты барана (ЭБ))
Влияние исследуемых соединений на гуморальный иммунитет оценивали, определяя титры гемагглютининов в сыворотке крови (реакция гемагглютина-ции, поставленная в микротитраторе Такачи, РПГА). Реакция основана на способности антител, содержащихся в сыворотке крови иммунизированных животных, агглютинировать ЭБ, используемые в качестве антигена. После трехкратного введения соединений мышам СВА вводили внутрибрюшинно (в/б) суспензию трижды отмытых в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида ЭБ в субоптимальной дозе, равной 5107 ЭБ/мышь. Через 7 дней после иммунизации животных забивали декапитацией и получали сыворотку крови. Для инактивации комплемента сыворотки прогревали при температуре 56оС в течение 30 минут. Для определения титра гемагглютининов в лунки микротитратора микропипетками закапывали физиологический раствор. В первую лунку закапывали такое же количество сыворотки и специальным дозатором, после перемешивания с физиологическим раствором, переносили разведнный образец из одной лунки в другую. Затем в каждую лунку микропипеткой добавляли ЭБ в концентрации 2108 клеток. Планшеты осторожно встряхивали и ставили в термостат на 2 часа при температуре 37оС. Титр антител (наибольшее разведение сыворотки, при котором наблюдается отчтливая агглютинация ЭБ) выражали величиной двоичный логарифм обратной величины титра антител log2T, где Т – обратная величина титра антител исследуемой сыворотки.
Методы исследования противовоспалительной активности соединений
Согласно многочисленным исследованиям последних лет расшифровка механизмов врожденного и адаптивного иммунитета, хронизации воспалительных процессов и нарушений иммунологического гомеостаза, позволила выявить новые сигнальные молекулы и медиаторы взаимодействия клеток (в частности, плейотропное действие ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, открытие цитолитических механизмов ЦТЛ и НК-клеток) [147]. В связи с этим одним из перспективных направлений в настоящее время является разработка иммунотерапевтических подходов к лечению рака.
Известно, что совместное применение противоопухолевых препаратов с антиоксидантами, обладающими противовоспалительными свойствами, усиливает терапевтическую эффективность цитостатиков и уменьшает их побочное действие [57; 58; 105; 213]. Следовательно, актуален поиск и разработка малотоксичных препаратов с комплексом иммунофармакологической, противовоспалительной и противоопухолевой активности.
В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова» был проведен скрининг 11 новых производных 3-оксипиридина и 5-оксипиримидина, не описанных в научной и патентной литературе, посредством комплекса методов, применяющихся при доклиническом изучении новых фармакологически активных соединений, позволяющих выявить различные иммунофармакологические и противовоспалительные свойства.
Оценка профилей иммунофармакологической активности соединений под шифрами ПиОН-530, ПиОН-755, ПиОН-805, ПиОН-915, ПиОН-920, ПиОН-922, ПиОН-934, ПиОН-935, ПиОН-942, СНК-411 и СНК-511 в опытах на мышах включала исследование влияния этих соединений на основные показатели врожденного, гуморального и клеточного иммунитета и противовоспалительных свойств. Проведенные исследования показали, что производные 3-оксипиридина и 5-оксипиримидина обладают иммуномодулирующими и противовоспалительными свойствами.
Выявлена стимуляция гуморального иммунного ответа у мышей линии СВА после трехкратного в/б введения соединений ряда 3-ОП под шифрами Пион-755, ПиОН-915, ПиОН-942 в дозе 25 мг/кг, ПиОН-530 в дозе 50 мг/кг и соединений ряда 5-ОПМ СНК-411 в дозах 25 мг/кг и 50 мг/кг (р0,01) и СНК-511 в дозе 25 мг/кг (р0,05) по сравнению с контрольными животными.
Показано, что ПиОН-922 и ПиОН-942 в дозе 50 мг/кг значимо стимулируют клеточный иммунный ответ. СНК-411 в дозах 25 мг/кг, 50 мг/кг и СНК-511 в дозах 10 мг/кг, 25 мг/кг и 50 мг/кг также вызывают значимое (р 0,05) увеличение индекса реакции ГЗТ в опытах на мышах F1 (CBAC57ВL/6). ГЗТ является показателем функционального состояния клеточного иммунитета, эта реакция коррелирует со способностью Т-лимфоцитов давать пролиферативный ответ на Т-митогены и с их способностью продуцировать цитокины. Следовательно, возможно предположить, что в условиях in vivo вышеперечисленные соединения могут стимулировать продукцию цитокинов и Т-клеток. Установленные результаты согласуются с литературными данными о стимулирующем влиянии на параметры клеточного и гуморального иммунитета производных 3-оксипиридинов и 5-оксипиримидинов [56].
Для определения наличия противовоспалительных свойств с различным механизмом действия у фармакологически эффективных соединений успешно используется реакция воспаления на конканавалин А. В модели КонА-индуцированного воспаления отек развивается в результате последовательного высвобождения тучными клетками и базофильными лейкоцитами медиаторов воспаления: гистамина, серотонина, лейкотриенов и цитокинов [73]. Кон А непосредственно влияет на поперечное сшивание FcRI рецепторов на мембранах тучных клеток и базофильных лейкоцитов, что приводит к высвобождению медиаторов воспаления без участия реакции антиген-антитело.
При анализе полученных данных установлено значимое (р 0,05) уменьшение КонА-индуцированной реакции воспаления при однократном в/б введении ПиОН-805 в дозе 25 мг/кг, ПиОН-805, ПиОН-915, ПиОН-920, ПиОН-922, ПиОН-935, ПиОН-942 в дозе 50 мг/кг, а также СНК-411 и СНК-511 в дозах 10 мг/кг, 25 мг/кг и 50 мг/кг. Таким образом, установлено, что производное из ряда 5-оксипиримидина под шифром СНК-411 в дозах 25 мг/кг и 50 мг/кг при в/б введении интактным мышам обладает комплексным действием на параметры иммунитета, а также выраженными противовоспалительными свойствами. Исходя из полученных данных иммунофармакологического скрининга для последующего изучения было отобрано соединение СНК-411.
Для подтверждения противовоспалительной активности соединения СНК-411 при разных способах введения была проведена также оценка его действия при пероральном введении на модели Кон А-индуцированного воспаления при разведении в 1 % растворе крахмала, для полного растворения СНК-411 – в горячей (70о С) дистиллированной воде. СНК-411 проявил выраженные противовоспалительные свойства при пероральном введении во всех выбранных дозах (25, 50 и 100 мг/кг в растворе 1 % крахмала и 50 мг/кг, разведенных в горячей (70о С) дистиллированной воде), сравнимые с действием известного нестероидного противовоспалительного препарата диклофенак.
Для исключения межвидовых различий в действии СНК-411 и подбора оптимальной дозы для дальнейших исследований была проведена его оценка на модели острого экссудативного отека стопы на каррагенан у крыс. При использовании данной модели, применяемой, в частности, для определения ингибиторов циклооксигеназы, отек развивается в результате последовательного выделения ряда провоспалительных медиаторов: гистамина, 5-окситриптамина, кинина и простагландинов [73; 91]. Данные, полученные в модели отека у крыс, не выявили межвидовые различия в действии СНК-411 (10, 25, 50 мг/кг снижали отек лап крыс от 2,2 до 3,5 раз на протяжении 4 часов эксперимента) и подтвердили противовоспалительную активность СНК-411, сопоставимую с диклофенаком.
Исходя из полученных данных иммунофармакологического скрининга для дальнейшего изучения были выбраны дозы СНК-411 25 и 50 мг/кг. В следующей серии опытов оценивали действие соединения СНК-411 на врожденный иммунный ответ мышей F1 (CBAC57/BL6) по показателям фагоцитоза и хемилюминесценции.
Исследование клеточного иммунного ответа в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)
Подобный дисбаланс цитокинов развивается и при психических расстройствах, в частности, депрессии, которая характерна для пациентов с онкологическими заболеваниями [6; 141; 183; 201; 210]. Стимулирование содержания клеток иммунной системы и коррекция уровня цитокинов позволили предположить наличие адаптогенных эффектов у СНК-411 на психосоматические показатели у мышей-опухоленосителей с депрессивно-подобным синдромом [87]. Поэтому, в следующих сериях опытов было решено расширить скрининг по исследованию фармакологической активности оригинального производного 5-оксипиримидина и исследовать рост опухоли и поведение у мышей с LLC в условиях зоосоциаль-ного конфликта на фоне введения СНК-411.
Поведение, оцениваемое в инфракрасном актиметре нестрессированных животных-опухоленосителей, характеризовалось выраженным снижением двигательной активности. Известно, что при онкологических заболеваниях у пациентов часто развиваются депрессивные расстройства [24; 116; 194; 264]. У мышей с LLC выраженно снижается активное поведение, что в литературе интерпретируют, как один из показателей депрессивно-подобного состояния [129; 179; 182].
Выявлено, что семидневное введение СНК-411 в дозе 50 мг/кг мышам-опухоленосителям увеличивало локомоторную двигательную активность и пройденное расстояние в 2,5 раза и 1,6 раза по сравнению с контрольной группой с LLC.
Однако контакт мышей-опухоленосителей с агрессорами в течение 15 дней не привел к ожидаемому подавлению двигательной активности. По данным литературы, выраженное подавление параметров поведения наблюдается при нахождении животных в условиях зоосоциального конфликта в течение 30 дней [32; 178; 243].
ТРО при введении СНК-411 в дозе 50 мг/кг составило 58,5 % по сравнению с контрольной группой с LLC. При контакте с агрессором в течение 15 дней мышей-опухоленосителей установлено, что введение СНК-411 ингибировало рост LLC на 43,4 % по сравнению со стрессированной группой с LLC.
При анализе полученных данных выявлено, что СНК-411 вне зависимости от фактора стресса ингибирует рост опухоли. Ингибирование роста опухоли на фоне введения СНК-411 сопряжено с восстановлением психосоматических показателей у мышей с LLC, и сохранением этих эффектов при контакте с агрессором в течение 15 дней.
Согласно методическим рекомендациям по доклиническому изучению противоопухолевой активности новых соединений одним из обязательных этапов разработки является оценка прямой цитотоксичности на штаммах опухолевых клеток человека [89]. В рамках изучения противоопухолевой активности in vitro была исследована способность СНК-411 влиять на рост эритромиелоидной линии человека К-562.
Выявлено, что соединение СНК-411 в концентрациях 10-4 М и 10-5 М обладает способностью подавлять рост клеток линии К-562, выражающейся в уменьшении долей жизнеспособных клеток на 36 % и 18 %. Тегафур в этих же концентрациях снижал долю жизнеспособных клеток на 14 % и 4 %, что согласуется с ранее установленными данными. IC50 доксорубицина выявлено в концентрации 10-6 М, что коррелируется с данными других исследований.
Установлено, что сочетания СНК-411 с тегафуром проявляют аддитивность цитотоксического эффекта. Установлено приращение цитотоксических эффектов в комбинациях СНК-411 с доксорубицина гидрохлоридом в сравнении с отдельно взятым соединением.
Выявленный впервые прямой цитотоксический эффект in vitro для СНК-411 возможно объяснить тем, что производные пиримидина или пурина при включении в ДНК вызывают нарушение репликации или транскрипции и способствуют гибели активно пролиферирующих опухолевых клеток. В частности, препарат тегафур объединяет в молекуле пиримидиновое кольцо и тетрагидрофурановый остаток и является классическим препаратом при лечении злокачественных новообразований [167].
При введении СНК-411 нами было выявлено увеличение процентного содержания НК-клеток в крови и иммунокомпетентных органах мышей методом проточной цитометрии. Поэтому была поставлена задача оценить эффект СНК-411 на функциональную активность мононуклеаров периферической крови (МНК).
В настоящее время в лабораторной практике широко применяется метод оценки функциональной активности НК-клеток, а именно тест на НК-активность мононуклеаров периферической крови (МНК). Под НК-активностью понимают способность МНК, выделенных из крови обследуемого, без какой-либо предварительной активации убивать опухолевые клетки-мишени, лишенные экспрессии MHC I класса. Эта активность МНК опосредуется практически только НК-клетками. Исследование НК-активности МНК позволяет оценить киллерную функцию НК-клеток, но не дает возможности более точно охарактеризовать дефект в системе НК-клеток, если таковой имеется [60]. Очевидно, что на НК-активность может влиять целый ряд параметров, в частности процентное содержание НК-клеток в образце МНК, содержание биологически активных перфори-на и гранзимов в литических гранулах НК-клеток, способность НК-клеток де-гранулировать (т.е. выбрасывать перфорин и гранзимы из литических гранул на поверхность инфицированных или опухолевых клеток-мишеней), способность НК-клеток убивать мишени с помощью механизмов, не связанных с дегрануля-цией [185; 239].
Результаты МТТ-теста свидетельствуют в пользу предположения, что СНК-411 стимулирует функциональную активность МПК человека в отношении эрит-ромиелоидной лейкозной линии К-562. Достоверный эффект выявлен для СНК-411 в высокой концентрации 10-5 М.
Таким образом, установлено, что соединение СНК-411 проявляет цитоток-сический эффект в отношении эритромиелоидной лейкозной линии К-562 и обладает стимулирующим действием на функциональную активность МПК. Данные наблюдения расширяют спектр представлений о возможных механизмах противоопухолевой активности СНК-411.
В настоящее время все более значительной в канцерогенезе представляет роль тканевого гомеостаза, поддержания баланса про- и ангиогенных факторов, иммунного статуса организма. Внутриопухолевая гетерогенность и клональное разнообразие злокачественных опухолей порождают сомнения у ряда исследова 106 телей в возможности эффективной терапии рака. Однако так называемые «дремлющие» небольшие злокачественные новообразования обнаруживают практически у всех людей старше 50-70 лет, но они приводят к летальному исходу лишь у относительно небольшой части пациентов, когда ослабевает иммунная защита организма вследствие возраста и различных неблагоприятных факторов [54].
Таким образом, усиление факторов защиты врожденного и приобретенного иммунитета, выраженная противовоспалительная и противоопухолевая активность соединения СНК-411 в моделях in vivo и in vitro, определяют перспективы его дальнейшей разработки в качестве средства для терапии онкологических заболеваний.